張運輝,伍大華*,袁春云，張秀麗，彭文杰，姚 婷

(1.湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院附屬中西結(jié)合醫(yī)院，湖南 長沙410006；2.湖南中醫(yī)藥大學中藥粉體實驗室，湖南 長沙 410208）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease AD)是一種以進行性癡呆為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病。臨床上以何首烏和三七為主的補腎活血復方益智健腦顆粒用于AD 的治療取得了很好的療效[1-2]。AD患者膽堿能系統(tǒng)損傷后，乙酰膽堿酯酶（AchE）活性在多處腦區(qū)均顯著升高，其變化程度與癡呆等級呈相關(guān)[3-4]。 丙二醛（MDA)含量、超氧化物歧化酶（SOD)活性是評估AD 氧化應激損傷的重要標志[5]。已有研究表明，二苯乙烯苷（TSG）能降低AD 模型大鼠的AchE 活性[6]，并通過抗氧化應激損傷作用明顯減少人β 淀粉樣蛋白25-35（Aβ25-35）引起的PC12 細胞損傷，提高細胞活力[7]。 三七總皂苷（PNS）能改善膽堿能系統(tǒng)、抗氧化應激損傷[8-9]。 我們前段研究預實驗表明，二苯乙烯苷（TSG）100 mmol/L 和PNS 50 mg/L分別是抗阿爾茨海默病損傷的有效劑量，且兩者配伍對神經(jīng)元損傷有協(xié)同或相加的效應。 本文從膽堿能系統(tǒng)損傷和氧化應激損傷兩方面探討TSG 和PNS 配伍對AD 損傷的保護機制， 現(xiàn)將實驗方法及結(jié)果報道如下。

1 實驗材料

1.1 細胞

大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜絡細胞瘤細胞株P(guān)C12 細胞，高分化，永久性，購自長沙贏潤生物技術(shù)有限公司，編號2015032007。

1.2 試劑

TSG （北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院, 批號130725，純度97%），PNS（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，批號MUST-14042810，純度98%），Aβ25-35（美國Sigma 公司，批號053M4804V 純度98%），鹽酸多奈哌齊片（中國衛(wèi)材藥業(yè)有限公司），DMSO（Sigma 公司），F(xiàn)BS（吉泰遠成生物科技有限公司），MDA 試劑盒、SOD 試劑盒、AchE 試劑盒、MTT、胰酶均由南京建成生物工程研究所提供，DMEM 細胞培養(yǎng)液 （賽默飛世爾生物化學制品北京有限公司），10%新生小牛血清（Hyclone Lab），PBS（北京索萊寶科技有限公司）。

1.3 儀器

Galaxy 170R 型二氧化碳培養(yǎng)箱（上海百賽生物技術(shù)有限公司），DL-CJ-2NDI 型超凈工作臺(中國北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司），5804R 型低溫高速離心機(德國Eppendorf 5810R)，Primo Vert型倒置顯微鏡(德國 Carl Zeiss Jena)，UV1800ENG240V 型 紫 外 分 光光度計[島津（中國）有限公司]等。

2 方法

2.1 PC12 細胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清和5%馬血清的DMEM,在95%O2、5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)細胞， 每2 天傳代1次， 待細胞增長至80%融合時， 用0.25%胰酶消化細胞， 調(diào)整細胞數(shù)至1×105個/mL 后傳代或接種于細胞培養(yǎng)板，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

2.2 藥物配制

將TSG、PNS、Aβ25-35、 多奈哌齊分別配成初始濃度為2 000 mmol/L、1 000 mg/L、400 μmol/L、200 μmol/L。藥物干預時，再分別取5 μL 加至100 μL 的細胞培養(yǎng)基中稀釋20 倍。

2.3 藥物配伍劑量的確定

前段研究表明，TSG（100 mmol/L）和PNS（50 mg/L）分別是抗阿爾茨海默病損傷的的有效劑量， 且兩者配伍對神經(jīng)元損傷有協(xié)同或相加的效應。

2.4 分組及藥物干預

文獻[10]表明，Aβ25-35能劑量依賴性地損傷皮質(zhì)神經(jīng)元,1 μmol/L Aβ25-35劑量組處理24 h 后細胞存活率可降低50%左右, 可用于Aβ25-35體外誘導阿爾茨海默病細胞模型的建立[10]。 故本實驗選用Aβ25-35誘導PC12 細胞建立AD 損傷模型。

待PC12 細胞進入對數(shù)生長期后， 以2×104/mL密度， 隨機接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中， 每孔100 μL，每組8 孔，共6 組。24 h 后，吸取培養(yǎng)液，細胞分成6 組進行藥物干預：（1） 空白組（正常PC12細胞）；（2）模型組（20 μmol/L Aβ25-35）；（3）多奈哌齊組（20 μmol/L Aβ25-35+10 μmol/L 多奈哌齊）（4）TSG組 （20 μmol/L Aβ25-35+100 mmol/L TSG）；（5）PNS組(20 μmol/L Aβ25-35+50 mg/L PNS；（6）TSG-PNS（20 μmol/L Aβ25-35+100 mmol/L TSG+50 mg/L PNS）組，繼續(xù)孵育24 h。

2.5 PC12 細胞中AchE 及SOD 活力、MDA 含量檢測

完成加藥孵育24 h 后， 采用細胞刮徹底收集細胞， 超聲破碎細胞，4 ℃下3 000 r/min 離心10 min， 收集上清液按照試劑盒方法測定細胞均漿中的AchE 及SOD 活力、MDA 含量。

2.6 統(tǒng)計學處理

3 結(jié)果

與空白組比較， 模型組AchE 活力、MDA 含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，AchE 活力、MDA含量在各組顯著降低（P＜0.05），且配伍組及多奈哌齊組比TSG 組和PNS 單用組降低更明顯 （P＜0.01，P＜0.05）。

與空白組比較，模型組SOD 活力顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，SOD 活力在各組顯著升高（均P＜0.05），配伍組及多奈哌齊組均升高明顯（P＜0.01，P＜0.05）， 且配伍組比TSG 組和PNS 單用組升高更明顯（均P＜0.01）。 見表1。

表1 各組PC12 細胞上清液中AchE 及SOD 活力、MDA 含量的比較 （±s,n=8）

表1 各組PC12 細胞上清液中AchE 及SOD 活力、MDA 含量的比較 （±s,n=8）

注：與空白組比較△△P＜0.01;與模型組比較★P＜0.05,★★P＜0.01；與TSG-PNS 配伍組比較☆P＜0.05,☆☆P＜0.01。

MDA(nmol/L)8.48±0.56 11.29±0.82△△9.06±0.65★☆9.24±0.68★☆☆7.06±0.40★★8.65±0.59★★☆組別空白組模型組TSG PNS TSG-PNS多奈哌齊組AchE(U/mL)25.00±2.52 20.00±2.34△△12.00±1.25★★☆☆15.00±1.54★☆☆5.00±0.76★★8.00±1.08★★☆SOD（U/mL)251.33±9.84 111.42±4.98△△152.79±10.32★☆☆173.61±10.50★☆☆290.86±16.30★★272.53±15.82★★☆☆

4 討論

上世紀70年代，研究發(fā)現(xiàn)AD 患者基底前腦去膽堿能神經(jīng)元丟失，從基底節(jié)到皮質(zhì)，膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）活性降低和乙酰膽堿酯酶（AChE）活性明顯升高，造成乙酰膽堿（ACh）的合成，儲存和釋放減少，皮質(zhì)ACh 受體數(shù)目減少，導致以學習記憶減退和認知障礙為主的多種臨床表現(xiàn)， 產(chǎn)生AD 癥狀[11]。AD 病人體內(nèi)自由基生成增加， 尤其是腦組織中神經(jīng)細胞的氧化應激是導致其腦結(jié)構(gòu)和功能改變的原因[12]。 超氧化物歧化酶（SOD)屬于生物抗氧化酶類，被稱為生物體抗氧化系統(tǒng)的第一道防線。 丙二醛 （MDA) 屬于脂質(zhì)過氧化物標志物。 實驗證明，MDA 的水平在AD 腦內(nèi)顯著提高[13]。 一旦自由基產(chǎn)生和清除的平衡狀態(tài)被打破，自由基堆積，對機體造成氧化損傷，促使AD 的發(fā)生。 因此，膽堿能系統(tǒng)損傷、氧化應激自由基損傷是AD 發(fā)病的重要機制。我們前期預實驗發(fā)現(xiàn)，40 μmol/L 濃度范圍內(nèi)，Aβ25-35對PC12 細胞損傷存在濃度依耐性， 隨著濃度的升高，細胞發(fā)生聚集、脫落，呈彌漫狀，細胞存活率也成線性降低；當損傷濃度升高至40 μmol/L，鏡下視野幾乎無細胞存活，對細胞的損傷達到頂峰。 考慮到Aβ25-35的嚴重致?lián)p作用可能導致PC12 細胞不可逆轉(zhuǎn)性的損傷，故我們選取20 μmol/L 的Aβ25-35作用PC12 細胞建立AD 體外細胞模型。

本研究結(jié)果表明，Aβ25-35誘導PC12 細胞建立AD 損傷模型后，模型組上清液AchE 活力、MDA 含量顯著升高、SOD 活力明顯降低， 說明AD 模型PC12 細胞的膽堿能系統(tǒng)和自由基清除系統(tǒng)發(fā)生嚴重障礙。 藥物干預后TSG、PNS、TSG-PNS 可降低AchE 活力、MDA 含量、提高SOD 活力。且TSG-PNS配伍組的效應比TSG 或PNS 單用組更好。 TSG 和PNS 配伍治療AD 的機制可能是通過改善膽堿能損傷和抑制氧化應激損傷來實現(xiàn)的。

[1]董克禮， 曾望遠. 益智健腦顆粒治療阿爾茨海默病20 例總結(jié)[J].湖南中醫(yī)雜志，2006，22（2）：3-4.

[2]董克禮，蔣美艷.益智健腦顆粒治療老年癡呆病臨床觀察[J]. 湖南中醫(yī)藥大學學報，2007，27（1）：58-59.

[3]Engelborghs S, de Deyn PP. The neurochemistry of Alzheimer’s disease[J].Acta Neurol Belg,1997,97(2):67-84.

[4]Nesulam I. .Some cholinergic themes related to Alzheimer’s disease:synaptology of the nucleus basalis,location of m2 receptors,interactions with amyloid metabism and perturbations of cortical plasticity[J].Physiol Paris,1998,92(3-4):293-298.

[5]馬 晶.柚皮素通過影響氧化應激改善阿爾茨海默病模型大鼠的學習記憶能力[D].重慶：重慶醫(yī)科大學，2013.

[6]張 蘭，葉翠飛，褚燕琦，等.二苯乙烯苷對鵝膏蕈氨酸致癡呆大鼠模型腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)的影響[J].中國藥學雜志，2005,40(10):749-752.

[7]馬海涵，邵 陽，陳力學，等.二苯乙烯苷對Aβ25-35誘導的細胞損傷的保護作用[J].中國老年學雜志,2011,31（1）:55-57.

[8]鐘振國，屈澤強，王乃平，等. 三七總皂苷對阿爾茨海默病大鼠腦膽堿能神經(jīng)的保護作用[J].中國臨床康復，2006,10（19）:174-175.

[9]呂 良，鐘振國，吳登攀，等.三七總皂苷對快速老化模型小鼠腦內(nèi)syp,tau 基因表達的影響[J].中國中藥雜志，2009,34（10）：1 261-1 263.

[10]于 洋，李 萌，候艷寧，等.Aβ25-35對原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷作用[J].華北國防醫(yī)藥,2010,22（4）:301-304.

[11]Musia A, Bajda M, Malawska B. Recent developments in cholinesterases inhibitors for Alzheimer's disease treatment.Curr Med Chem, 2007,14(25):2 654-2 679.

[12]Zawia NH, Lahiri DK, Cardozo-Pelzez F. Epigenetics, oxidative stress, and Alzheimer disease [J]. Free Radic Bio Med, 2009,46(11):1 241.

[13]Markesbery WR,Lovell MA. 4-Hydroxynonenal,a product of lipid peroxidation,is increased in the brian in Alzheimer’s disease[J].Neurobiology of Aging,1998(1-2),19(1):33-36.