王小青，鄭 霄，尹志峰，王良友（河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德 067000）

Fmoc固相合成生長(zhǎng)激素釋放肽-2

王小青，鄭 霄，尹志峰，王良友
（河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德 067000）

GHRP-2；Fmoc固相合成；純化

生長(zhǎng)激素釋放肽（GHRP）于20世紀(jì)70年代末、80年代初依據(jù)蛋氨酸-亮氨酸腦啡肽的結(jié)構(gòu)首次合成［1］，之后又合成了數(shù)種類(lèi)型的GHRP［2］。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)改造后的GHRP-2（又名KP-102，藥品名為Pralmorelin，氨基酸序列為D-Ala-（D-β-naphthyl）-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2）具有更強(qiáng)的刺激生長(zhǎng)激素釋放和改善兒童生長(zhǎng)激素缺乏癥的作用［3-4］。2004年，Pralmorelin用于治療身材矮小癥的Ⅱ期臨床試驗(yàn)已在日本開(kāi)始進(jìn)行［5］。GHRP造價(jià)低廉，給藥簡(jiǎn)便，在下丘腦生長(zhǎng)激素釋放激素?zé)o效時(shí)仍可產(chǎn)生作用，不影響或少影響生長(zhǎng)素的內(nèi)源節(jié)律性釋放，具有明顯的藥物發(fā)展前景［2，5］。

20世紀(jì)90年代末，王勤等［6-8］采用Merrifild固相法合成了生長(zhǎng)激素釋放肽并對(duì)其活性進(jìn)行了測(cè)定。但現(xiàn)有的制備方法操作難度大，不利于工業(yè)生產(chǎn)，而我們也未檢嚴(yán)守紀(jì)律到國(guó)內(nèi)以Fmoc固相合成方法合成生長(zhǎng)激素釋放肽的文獻(xiàn)。本研究以GHRP-2為研究對(duì)象，采用Fmoc固相合成策略，優(yōu)化合成工藝，合成了含有3個(gè)D型氨基酸的GHRP-2，以期為工業(yè)化量產(chǎn)提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 戴安U3000高效液相色譜儀（UV檢測(cè)器，美國(guó)戴安公司），Newstyle型反相高效半制備液相色譜儀（蘇州漢邦科技有限公司），戴安液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀Ultimate 3000/ MSQ（美國(guó)戴安公司），CHRIST凍干機(jī)（北京博勵(lì)行儀器有限公司），高速大容量離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 試劑 固相合成載體Rink-Amide-AM樹(shù)脂（天津南開(kāi)合成科技有限公司，替代度為0.58mmol/g），肽鏈中所有保護(hù)氨基酸（成都誠(chéng)諾新技術(shù)有限公司），HOBt、DIC（蘇州中科天馬肽工程中心有限公司），冰乙醚、TFA（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司），哌啶、苯甲硫醚、間甲酚與苯甲醚（上海晶純?cè)噭┯邢薰荆珽DT（Sigma-Aldrich），DMF（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），DCM（天津博迪化工股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 Fmoc-Lys（Boc）-Rink Amide-AM樹(shù)脂的制備 在洗凈并干燥的反應(yīng)柱中，加入896.2mg（0.5mmol）Rink Amide-AM樹(shù)脂，加DMF通氮?dú)馊苊?0min，充分溶脹后抽掉DMF，加入適量DBLK溶液（哌啶/DMF（V/V）=1：4）脫Fmoc保護(hù)基兩次，時(shí)間分別為5min和7min，茚三酮檢測(cè)合格后，用DMF和DCM分別洗滌樹(shù)脂，抽干溶劑。稱942.0mg（2 mmol）Fmoc-L-Lys（Boc）-OH 和27.1mg HOBt（2mmol）溶于DMF，冰浴并加入310μl（2mmol）DIC活化5min，加入反應(yīng)柱反應(yīng)，茚三酮檢測(cè)合格后，抽干，分別用DMF與DCM洗滌樹(shù)脂，并進(jìn)行替代度檢測(cè)，加入11ml的醋酸酐與吡啶（V/V，6：5）混合液封閉14小時(shí)。沖洗樹(shù)脂，加甲醇收縮兩次（5min/次），減壓干燥至恒重，得干燥樹(shù)脂0.971g。

2.2 GHRP-2逐 步 偶 聯(lián) 將2.1制 備 的Fmoc-Lys（Boc）-Rink Amide-AM樹(shù)脂置于反應(yīng)柱中，加入DMF溶脹30 min，按照附表進(jìn)行氨基酸偶聯(lián)，偶聯(lián)結(jié)束后脫去最后一個(gè)氨基酸氨基并用甲醇收縮樹(shù)脂，抽干并稱重得GHRP-2肽樹(shù)脂1.185g。

偶聯(lián)D-Phe、D-βNal和D-Ala三個(gè)D型氨基酸時(shí)反應(yīng)時(shí)間控制在120min以內(nèi)，反應(yīng)時(shí)間在100min時(shí)茚三酮檢測(cè)合成效果最好，反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，粗肽HPLC檢測(cè)雜質(zhì)越多，得率也較低。GHRP-2序列中含有疏水性氨基酸Ala，Phe以及D-βNal等，在反應(yīng)的過(guò)程中添加N-甲基-2吡咯烷酮（NMP）來(lái)增強(qiáng)疏水性氨基酸的溶解性，加快反應(yīng)。見(jiàn)附表：

附表 固相Fmoc保護(hù)策略偶聯(lián)反應(yīng)的一般程序

2.3 肽樹(shù)脂的裂解 平行稱取干燥至恒重的GHRP-2-Rink Amide-AM樹(shù)脂200.0mg 3 份，置于玻璃燒瓶中，分別加入裂解液①TFA：間甲酚（99：1）、②TFA：苯甲硫醚：EDT：苯 甲 醚（9：0.5：0.3：0.2）、③TFA：EDT：間 甲 酚（9.5：0.4：0.1）各2ml，冰浴反應(yīng)30min，逐漸升至室溫，于室溫下反應(yīng)1h。過(guò)濾，用少許TFA洗滌樹(shù)脂，將濾液傾入40ml無(wú)水冰乙醚中，析出白色固體，0℃靜置沉降20min。4000 r/min離心4min，棄去上清液，重復(fù)5次，真空干燥至恒重，得白色固體。

2.4 粗肽的純化與鑒定 粗肽無(wú)氧水溶解，加少量醋酸助溶，置于4℃冰箱放置過(guò)夜。半制備液相條件：半制備柱Hedera ODS-2反相硅膠柱（20×250mm，10μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)215nm；采用乙腈/0.1%TFA水分離體系，流速8ml/min，乙腈25%-55%，洗脫時(shí)間30min。純化后樣品經(jīng)戴安U3000高效液相分析，反相柱Kromasil C18（4.6×250mm，5μm），以乙腈/水為分析體系（0.1%TFA），乙腈5%-95%，流速1ml/ min，20min梯度洗脫，檢驗(yàn)洗脫液純度。粗肽純度為80%，經(jīng)半制備液相純化得GHRP-2純度大于99.0%。結(jié)構(gòu)經(jīng)ESIMS分析確證，質(zhì)譜圖顯示［M+H］+峰m/z 818.6，［M+H］2+ 峰m/z 410.0，質(zhì)譜數(shù)據(jù)與理論值相符。

3 討論

GHRP-2含有D-氨基酸和β-氨基酸，產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與活性密切相關(guān)，環(huán)境對(duì)產(chǎn)物影響較大，易發(fā)生消旋、氧化等副反應(yīng)，產(chǎn)率也較其它多肽產(chǎn)品低。本研究選擇消旋率小的縮合體系，控制反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度，優(yōu)化裂解條件和純化手段得到純度大于99.0%的目標(biāo)產(chǎn)物。

固相合成中固相載體的選擇非常關(guān)鍵，不僅關(guān)系到合成速率，對(duì)合成目標(biāo)肽的純度、收率都有重要的影響。本研究選用的Rink Amide-AM樹(shù)脂主要用來(lái)合成末端羧基氨基化的多肽［9-10］，同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)不同替代度的樹(shù)脂進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)樹(shù)脂替代度在0.4-0.45mmol/g時(shí)產(chǎn)物的得率和純度最好。根據(jù)氨基酸種類(lèi)選擇三種裂解液配比與裂解方法進(jìn)行了平行比較，結(jié)果粗肽得率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，本研究選擇成本最低的TFA：間甲酚=99：1進(jìn)行裂解。溫度、反應(yīng)時(shí)間和裂解試劑劑量是實(shí)驗(yàn)中重要的影響條件。

采用F moc固相合成方法合成GHRP-2，該方法簡(jiǎn)單，目標(biāo)產(chǎn)物得率與純度較高，能夠?yàn)楣I(yè)化量產(chǎn)提供理論依據(jù)。

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（技術(shù)方法欄目編輯：張 ?。?/p>

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2014-09-13）