孫 伶，劉 川，劉曉莉，張偉麗（.石家莊四藥有限公司，河北石家莊 0565；.石家莊市急救中心）

技術(shù)方法

富馬酸替諾福韋二吡呋酯中殘留溶劑檢測方法的建立及驗證

孫 伶1，劉 川1，劉曉莉2，張偉麗1
（1.石家莊四藥有限公司，河北石家莊 052165；2.石家莊市急救中心）

富馬酸替諾福韋二吡呋酯；頂空氣相色譜法；殘留溶劑；方法驗證

富馬酸替諾福韋二吡呋酯化學(xué)名為9-［（R）-2-［［雙［［（異丙氧基羰基）氧基］甲氧基］氧膦基］甲氧基］-丙基］腺嘌呤富馬酸鹽（1：1），是美國Gilead 公司開發(fā)的一種新型核苷酸類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，于2002 年在歐盟上市，用于治療HIV-1感染和慢性乙型肝炎［1］，其活性成分替諾福韋為無環(huán)的5’-單磷酸腺苷類似物，在體內(nèi)被細(xì)胞激酶磷酸化生成替諾福韋二磷酸，通過與5’-三磷酸脫氧腺苷酸競爭參與到病毒DNA鏈的合成中，導(dǎo)致DNA鏈延長受阻而抑制病毒的復(fù)制［2］。酯化的替諾福韋口服吸收率明顯提高，并能提高細(xì)胞對其攝取。

藥物中的殘留溶劑是指在原料藥或輔料的生產(chǎn)及制劑制備過程中使用或產(chǎn)生的，在后續(xù)工藝中未能完全去除的有機溶劑。這些有機溶劑的使用對藥物的產(chǎn)率、晶型以及溶解度等產(chǎn)生重要影響，但在藥物中的殘留不僅沒有藥效作用，而且潛在毒性還會對服藥者的健康造成危害［3-4］。因此，在人用藥品注冊技術(shù)上，國際協(xié)調(diào)會（ICH） 對殘留溶劑的種類和限度做了明確規(guī)定［5］。為了保障人們用藥安全，對藥物中殘留溶劑進行有效控制十分重要。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 島津2010plus氣相色譜儀，配氫火焰離子化檢測器（ 日本島津公司）；TubroMatrix40頂空進樣器，配20ml樣品瓶（PE公司）；SPH-500高純氫氣發(fā)生器，SPB-3空氣發(fā)生器（北京中惠普分析技術(shù)研究所）。富馬酸替諾福韋二吡呋酯原料藥購自上海遐瑞醫(yī)藥科技有限公司；異丙醇、二氯甲烷及乙酸乙酯均購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醇購自美國默克公司；異丙醇、二氯甲烷及乙酸乙酯均為高效液相色譜純；甲醇為氣相頂空專用溶劑。

1.2 色譜條件 DB-624石英毛細(xì)管柱（30m×0.32mm× 1.8μm，美國Agilent公司）。載氣為高純氮氣，柱內(nèi)流速3.0ml/min，隔墊吹掃氣流速3.0ml/min。采用分流進樣，分流比為20：1，進樣口溫度200℃，檢測器溫度250℃。程序升溫：40℃保持20min，5℃/min 的速率升溫至200℃，維持10min。

1.3 頂空條件 平衡溫度90℃，傳輸管溫度100℃，進樣環(huán)溫度110℃；平衡時間30min，加壓時間10s，充樣時間7s，進樣時間15s；頂空進樣體積1ml。

1.4 供試品溶液及對照品溶液的配制

1.4.1 供試品溶液：分別精密稱取不同批次的富馬酸替諾福韋二吡呋酯原料藥500mg，置于20ml頂空瓶中，精密加入5ml甲醇溶解，密封，制得含富馬酸替諾福韋二吡呋酯100mg/ml的供試品溶液，于室溫條件下保存，此時原料藥完全溶解并且性質(zhì)穩(wěn)定。

1.4.2 對照品溶液： 精密稱取500mg異丙醇、60mg二氯甲烷、500mg乙酸乙酯于100ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，分別制得每毫升含5mg異丙醇、0.6mg二氯甲烷、5mg乙酸乙酯的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。將該儲備液用甲醇稀釋10倍，即制得相對于100mg/ml供試品溶液的濃度換算成相當(dāng)于藥典規(guī)定的各個殘留溶劑濃度限度的溶液，將此溶液作為100%對照品。同樣逐級稀釋儲備液制得150%、120%、80%、50%、30%、10%、5%對照品溶液。

1.5 分析方法的建立

1.5.1 溶劑選擇：原料藥易溶于甲醇及N，N-二甲基甲酰胺，微溶于水，參考2010年版中國藥典二部附錄Ⅷ P殘留溶劑測定，初步確定甲醇做為供試品溶液配制的溶劑。

1.5.2 檢測條件選擇：參照中國藥典2010年版二部附錄ⅧP殘留溶劑測定法建立檢測方法，結(jié)合3種殘留溶劑的物理性質(zhì)與極性，依據(jù)安捷倫公司網(wǎng)站中的DB-624色譜柱標(biāo)準(zhǔn)圖譜，采用中等極性毛細(xì)管柱頂空進樣檢測。

1.5.3 樣品平衡溫度的考察：樣品平衡溫度影響檢測靈敏度，溫度越高，蒸汽壓越高，頂空氣體的濃度越高，分析的靈敏度將會提高，但過高的溫度可能引起供試品熱分解以及樣品體系的不穩(wěn)定，所以需要對平衡溫度進行考察。實驗中以100%對照品為測試液，分別考察80℃、90℃與100℃的平衡溫度對各組分測定的影響。在上述過程中每個溫度條件下，樣品平衡時間均維持30min，頂空進樣器的定量環(huán)、樣品傳輸線的設(shè)定分別比相應(yīng)平衡溫度高10℃。比較平衡溫度為90℃與平衡溫度為80℃，3種殘留溶劑的檢測靈敏度均有較大提高，當(dāng)平衡溫度為100℃時，異丙醇的靈敏度降低，其他兩種溶劑的靈敏度增長亦不明顯，綜合分析，選擇90℃作為樣品的平衡溫度。見表1：

表1 平衡溫度選擇試驗結(jié)果

1.5.4 樣品平衡時間的選擇：樣品平衡時間過短會導(dǎo)致樣品溶液的氣-液兩相達(dá)不到平衡，使進樣的重復(fù)性變差，影響準(zhǔn)確定量；過長則會使分析時間變長，降低分析速度，因此需對頂空的平衡時間進行考察。以100%對照品溶液為測試液，在最佳平衡溫度90℃條件下，分別考察了平衡時間為20min、30min與40min時樣品的平衡情況。當(dāng)平衡時間為30min時比平衡溫度為20min時3種殘留溶劑的檢測靈敏度均有較大提高，當(dāng)平衡時間增加為40min時，3種溶劑的靈敏度增長均不明顯，綜合分析，選擇最佳平衡時間為30 min。見表2：

表2 平衡時間選擇試驗結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性試驗 分別考察了樣品溶劑甲醇、異丙醇、二氯甲烷和乙酸乙酯相互間準(zhǔn)確定量的干擾情況，從試驗結(jié)果看，甲醇、異丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯依次出峰，甲醇和3種殘留溶劑的色譜峰在各自出峰時間處不產(chǎn)生相互干擾，同時各組分也不含有干擾其他組分測定的雜質(zhì)峰，說明本方法合理可行。

2.2 檢出限、定量下限與線性范圍 通過將低濃度的對照品溶液逐級稀釋頂空進樣，將色譜峰高為信噪比3倍時對應(yīng)的濃度作為檢出限，峰高為信噪比10倍時對應(yīng)的濃度為定量限；將5%-150%對照品溶液按濃度從低到高進行測定，以濃度（X，mg/ml）為橫坐標(biāo)，以平均峰面積（Y，μV?s）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得到3種溶劑的線性方程及相關(guān)系數(shù)（見表3）。結(jié)果顯示，異丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯的檢出限為依次為0.53、0.08、0.25（10?g/ml），根據(jù)對應(yīng)的100mg/ml的供試品濃度，分別換算成藥物質(zhì)量的0.0005%、0.00007%、0.0003%。3種殘留溶劑的檢出限均小于2010年版中國藥典規(guī)定的濃度限度0.5%、0.06%、0.5%。3種溶劑在各自的定量限與150%濃度限度范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)均大于0. 995。表明采用外標(biāo)曲線法可實現(xiàn)對藥物中溶劑殘留量的準(zhǔn)確定量。

表3 3種溶劑的檢出限、定量下限、線性方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)

2.3 精密度與準(zhǔn)確度試驗 將100%對照品溶液連續(xù)6次平行頂空進樣測定，記錄各組分的峰面積，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。得到異丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯峰面積的RSD分別為1.5%、1.9%、0.6%，均小于藥物質(zhì)量控制方法研究中關(guān)于精密度實驗峰面積RSD（n=6）不大于5.0%的規(guī)定，表明本方法精密度良好。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，依次向準(zhǔn)確稱取的500mg富馬酸替諾福韋二吡呋酯原料藥中分別添加5ml 80%、100%、120%的對照品溶液，每個濃度的對照品溶液配制3個樣品，在選定的色譜條件下，進行測定，分別計算各組分的平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。試驗結(jié)果表明，3種溶劑的平均回收率為99%-101.0%，RSD（n=9）均不大于2.4%，可滿足準(zhǔn)確度實驗平均回收率在90%-110%范圍內(nèi)、RSD（n=9）小于5.0%的規(guī)定，表明本方法準(zhǔn)確度良好。

2.4 溶液穩(wěn)定性試驗 原料藥溶于甲醇制成一定溶度的溶液后，溶液的穩(wěn)定性直接影響到檢測方法的準(zhǔn)確性，故應(yīng)進行溶液穩(wěn)定性試驗。取供試品溶液于室溫放置，分別于0、1、2、4、8、12h取樣檢測，記錄各組分的峰面積，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。得到異丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯峰面積的RSD分別為0.5%、0.4%、0.9%，均小于1.0%，滿足溶液穩(wěn)定性的要求，表明本方法中供試品溶液于12h內(nèi)穩(wěn)定。

3 討論

本文建立了測定富馬酸替諾福韋二吡呋酯原料藥中殘留溶劑異丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯的頂空氣相色譜方法，并對溶劑、檢測條件、平衡溫度、平衡時間等條件進行了選擇及優(yōu)化。通過條件優(yōu)化，最終確立了以DB-624 為分析柱、90℃為平衡溫度、30min為平衡時間的分析方法。經(jīng)過方法學(xué)驗證，該方法的專屬性、檢出限、線性相關(guān)性、重復(fù)性、準(zhǔn)確度等各項指標(biāo)均可滿足藥物質(zhì)量控制的方法學(xué)要求，所建立的分析方法能夠?qū)Ω获R酸替諾福韋二吡呋酯原料藥中的殘留溶劑達(dá)到有效監(jiān)控，可以作為企業(yè)產(chǎn)品研發(fā)與生產(chǎn)的質(zhì)控方法，同時本方法也能夠?qū)ζ渌愃茪埩羧軇┑臋z測工作提供參考，具有廣泛的實用性。

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