曾漣 陽(yáng)麗云

體外右美托咪定對(duì)MGC-803胃癌細(xì)胞增殖的影響*

曾漣①陽(yáng)麗云①

目的：探討體外右美托咪定對(duì)MGC-803胃癌細(xì)胞增殖的影響。方法：將MGC-803胃癌細(xì)胞隨機(jī)分為六組，右美托咪定組（A1、A2、A3、A4、A5組）和對(duì)照組（C組），右美托咪定組各組的右美托咪定終濃度分別為1000、100、10、1、0.1 ng/mL，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組OD值，并計(jì)算增殖率。結(jié)果：右美托咪定組各組OD值及增殖率與C組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：體外右美托咪定對(duì)MGC-803胃癌細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響。

右美托咪定； MGC-803胃癌細(xì)胞株； 增殖

胃癌是我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤之一，胃癌基本居惡性腫瘤發(fā)病率及死亡率的前3位［1］。胃癌患者的預(yù)后除了與胃癌分型、胃癌分期等疾病本身的因素相關(guān)外，與手術(shù)、化療、放療等處理因素及患者自身的心理因素也密切相關(guān)。手術(shù)是胃癌患者的主要治療方式，手術(shù)中各個(gè)環(huán)節(jié)都可能對(duì)患者的預(yù)后產(chǎn)生重要影響。麻醉作為手術(shù)中的重要環(huán)節(jié)，麻醉目前的任務(wù)已不僅僅是配合外科醫(yī)生完成手術(shù)過(guò)程，保證患者術(shù)中生命體征平穩(wěn)，麻醉對(duì)患者預(yù)后的影響已逐步成為目前麻醉學(xué)關(guān)注的方向及研究的熱點(diǎn)。目前已有阿片類(lèi)藥物通過(guò)影響細(xì)胞免疫及體液免疫對(duì)腫瘤患者的預(yù)后產(chǎn)生影響的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，也有關(guān)于吸入麻醉藥物對(duì)細(xì)胞免疫應(yīng)答影響的相關(guān)研究。右美托咪定是一種高選擇性α2受體激動(dòng)劑，對(duì)α2腎上腺素受體的選擇性是α1受體的1620倍，1985年研制成功，1999年美國(guó)食品及藥物管理局（US Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)將其應(yīng)用于重癥監(jiān)護(hù)病房短于24 h的鎮(zhèn)靜，2009年才批準(zhǔn)在全身麻醉的手術(shù)患者應(yīng)用于氣管插管和機(jī)械通氣時(shí)的鎮(zhèn)靜等方面，作為一種新型藥物，其臨床應(yīng)用時(shí)間很短，到目前為止右美托咪定應(yīng)用于全麻患者也只有6年，目前對(duì)右美托咪定的研究多側(cè)重于其臨床作用效果，而對(duì)于其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)影響及腫瘤患者愈后的國(guó)內(nèi)外研究都非常少。因此本課題擬從細(xì)胞水平初步研究右美托咪定對(duì)MGC-803胃癌細(xì)胞增殖的影響，探討胃癌患者應(yīng)用右美托咪定的安全性，為進(jìn)一步的臨床研究及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)具體報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：MGC-803胃癌細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。主要試劑和儀器：含酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基（Hyclone，美國(guó)），胎牛血清（四季青，中國(guó)），右美托咪定（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，中國(guó)），MTT粉末（Sigma，美國(guó)），二甲基亞砜（Sigma，美國(guó)），倒置相差顯微鏡（Olympus，日本），酶標(biāo)儀（Thermo，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將MGC-803胃癌細(xì)胞用完全培養(yǎng)基（加入10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的含酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基）培養(yǎng)，置于溫度為37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，隔天換液1次，注意觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并注意觀察細(xì)胞有無(wú)感染（感染的細(xì)胞不適合進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)），當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)傳代，用0.25%胰蛋白酶消化，并置于倒置相差顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞形態(tài)變圓、細(xì)胞之間連接松解時(shí)，立即加入完全培養(yǎng)基終止消化，然后用吸管輕輕吹打培養(yǎng)瓶瓶底，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶瓶底脫落，收集細(xì)胞至離心管中，以1500 r/min的速度離心3 min使細(xì)胞沉淀于離心管底部，棄掉上清液，將細(xì)胞用新鮮的完全培養(yǎng)基重懸，以1∶2的比例傳代。

1.2.2 細(xì)胞增殖的檢測(cè) 采用噻唑藍(lán)（MTT）法。MTT全稱(chēng)為3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，其商品名為噻唑藍(lán)。檢測(cè)原理為活細(xì)胞線(xiàn)粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，吸光度值與細(xì)胞數(shù)成正比。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC-803胃癌細(xì)胞消化離心后棄掉舊的培養(yǎng)基，加入新鮮完全培養(yǎng)基，用吸管吹打?qū)⑵浯瞪⒅瞥杉?xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在倒置相差顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)，調(diào)整為3×104/mL的密度接種于96孔板，每孔200 μL（邊緣孔用無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液填充，每孔200 μL，以避免96孔板周?chē)椎膿]發(fā)效應(yīng)）。設(shè)置C組（對(duì)照組）、右美托咪定組（A1、A2、A3、A4、A5組）和調(diào)零組（為只加培養(yǎng)基不加細(xì)胞組，在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)用實(shí)驗(yàn)組的OD值減去調(diào)零組的OD值，以去除培養(yǎng)基等對(duì)OD值的影響）。置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用無(wú)菌1 mL注射器小心吸除舊的培養(yǎng)基。C組在完全培養(yǎng)基中加入生理鹽水，A1、A2、A3、A4、A5組在完全培養(yǎng)基中加入等體積的用生理鹽水稀釋好的右美托咪定溶液，使右美托咪定終濃度分別為1000、100、10、1、0.1 ng/mL，調(diào)零組為無(wú)細(xì)胞組只加完全培養(yǎng)基，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。對(duì)于72 h時(shí)間點(diǎn)組，在48 h時(shí)按上述步驟更換培養(yǎng)基，以滿(mǎn)足細(xì)胞對(duì)各營(yíng)養(yǎng)成分的需求。分別于右美托咪定作用MGC-803胃癌細(xì)胞24、48、72 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，各孔加入MTT（5 mg/mL）溶液20 μL（盡量避光操作），繼續(xù)將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h（以使活細(xì)胞有充足的時(shí)間將MTT還原為甲瓚）。4 h后，用1 mL注射器小心吸除舊的培養(yǎng)液，注意輕柔操作，避免吸到培養(yǎng)孔底部的結(jié)晶物，然后加入200 μL二甲基亞砜，隨后將細(xì)胞培養(yǎng)板放置于搖床上振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，采用酶標(biāo)儀在492 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各組吸光度值（optical density，OD值）。實(shí)驗(yàn)按上述步驟重復(fù)3次。細(xì)胞增殖率（%）=右美托咪定組OD/對(duì)照組OD×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所得數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用（±s）表示，比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

右美托咪定作用于MGC-803胃癌細(xì)胞24、48、72 h，右美托咪定各組OD值及增殖率與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 右美托咪定對(duì)MGC-803胃癌細(xì)胞增殖的影響（±s）

表1 右美托咪定對(duì)MGC-803胃癌細(xì)胞增殖的影響（±s）

48 h組別24 h 72 h OD值增殖率（%）OD值增殖率（%）OD值增殖率（%）C組1.163±0.065100.00±5.581.494±0.156 100.00±10.441.694±0.342100.00±20.19 A1組1.115±0.111 95.87±9.541.515±0.105101.41±7.031.988±0.213117.36±12.57 A2組1.148±0.084 98.71±7.221.397±0.217 93.51±14.521.709±0.318100.89±18.77 A3組1.212±0.058104.21±4.991.482±0.145 99.20±9.711.927±0.356113.75±21.02 A4組1.101±0.104 94.67±8.941.591±0.137106.49±9.171.650±0.261 97.40±15.41 A5組1.210±0.077104.04±6.621.407±0.111 94.18±7.431.630±0.230 96.22±13.58

3 討論

右美托咪定是一種高選擇性α2受體激動(dòng)劑，臨床應(yīng)用時(shí)間較短，直到2009年才批準(zhǔn)用于行全身麻醉的手術(shù)患者氣管插管和機(jī)械通氣時(shí)的鎮(zhèn)靜等方面［2］。由于其具有產(chǎn)生類(lèi)似自然睡眠、易喚醒、呼吸抑制作用弱、提高血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性、減少手術(shù)應(yīng)激反應(yīng)、減少阿片類(lèi)和麻醉藥物用量等優(yōu)勢(shì)，目前常用于減少術(shù)后躁動(dòng)，術(shù)前患者、重癥患者及其他患者有創(chuàng)操作時(shí)的鎮(zhèn)靜，局部麻醉輔助用藥，清醒插管及術(shù)后鎮(zhèn)痛等方面［3-13］。并且近期有研究表明其有神經(jīng)保護(hù)、心臟保護(hù)、減少寒戰(zhàn)及降低譫妄發(fā)生率的作用［14］。右美托咪定的藥理特點(diǎn)顯示其分布半衰期約為6 min，清除半衰期約2 h，主要在肝臟進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化由腎臟排出體外。臨床觀察及研究表明右美托咪定的藥代動(dòng)力學(xué)特征在不同的年齡及性別組并未表現(xiàn)出明顯的差異。但是隨著右美托咪定輸注時(shí)間的延長(zhǎng)，右美托咪定的持續(xù)輸注半衰期顯著延長(zhǎng)。由此可見(jiàn)隨著用藥時(shí)間延長(zhǎng)，右美托咪定有可能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生較長(zhǎng)時(shí)間的影響。由于右美托咪定臨床應(yīng)用的諸多優(yōu)勢(shì)，臨床上應(yīng)用右美托咪定越來(lái)越廣泛。而隨著人口老齡化，人們對(duì)自身健康關(guān)注度、重視度的提高及醫(yī)療水平的提高，早期發(fā)現(xiàn)及早期手術(shù)的患者也逐步增多，因此右美托咪定應(yīng)用于癌癥患者的機(jī)會(huì)也必然日益增多。

由于右美托咪定臨床應(yīng)用時(shí)間較短，其應(yīng)用于癌癥患者的安全性的研究目前較少。Bruzzone等［15］通過(guò)在小鼠皮下移植鼠MC4-L5乳腺癌細(xì)胞，以建立小鼠乳腺癌模型，并分別予以輸注右美托咪0.05 mg/（kg·d），可樂(lè)定0.1 mg/（kg·d）和等量的生理鹽水，與輸注生理鹽水組對(duì)比，發(fā)現(xiàn)右美托咪定和可樂(lè)定具有促進(jìn)鼠乳腺癌細(xì)胞株MC4-L5增殖的作用。有研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定通過(guò)改變膠原結(jié)構(gòu)促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展［16］。徐興國(guó)等［17］研究發(fā)現(xiàn)全麻期間持續(xù)靜脈輸注右美托咪定可有效抑制胃癌根治術(shù)患者圍術(shù)期的應(yīng)激反應(yīng)，減少細(xì)胞免疫功能的抑制，有利于胃癌根治術(shù)患者的術(shù)后康復(fù)。該研究認(rèn)為右美托咪定通過(guò)影響機(jī)體免疫功能間接影響胃癌患者的術(shù)后康復(fù)，本研究通過(guò)右美托咪定直接作用于胃癌細(xì)胞從細(xì)胞水平研究右美托咪定對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響，以探討右美托咪定是否會(huì)對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生直接的影響。本研究設(shè)置1000、100、10、1、0.1 ng/mL 5個(gè)不同濃度右美托咪定組作用于MGC-803胃癌細(xì)胞，研究右美托咪定與MGC-803胃癌細(xì)胞的量效關(guān)系，研究結(jié)果顯示右美托咪定不同濃度組OD值及增殖率與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。由此本研究認(rèn)為不同濃度右美托咪定對(duì)MGC-803胃癌細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響。本研究同時(shí)還設(shè)置了24、48、72 h 3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，觀察右美托咪定作用不同時(shí)間對(duì)MGC-803胃癌細(xì)胞的增殖是否產(chǎn)生影響，用以研究右美托咪定與MGC-803胃癌細(xì)胞的時(shí)效關(guān)系，研究結(jié)果顯示右美托咪定組各時(shí)間OD值及增殖率與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，右美托咪定在體外對(duì)MGC-803胃癌細(xì)胞的增殖未表現(xiàn)出明顯影響。Bruzzone等［15-16］的研究結(jié)果顯示右美托咪定可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增長(zhǎng)，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與其實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較提示，右美托咪定對(duì)于不同類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞可能會(huì)產(chǎn)生不一樣的影響，對(duì)不同細(xì)胞不同組織類(lèi)型的腫瘤患者的預(yù)后可能會(huì)產(chǎn)生不一樣的影響，其對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生影響的機(jī)制目前還不是很明確，有可能通過(guò)作用不同的受體引發(fā)不同的分子機(jī)制產(chǎn)生不同的影響。而對(duì)于體內(nèi)作用，右美托咪定的作用可能更加復(fù)雜，有可能通過(guò)對(duì)免疫系統(tǒng)及細(xì)胞基質(zhì)等影響間接對(duì)胃癌患者的預(yù)后產(chǎn)生影響。因此右美托咪定在不同類(lèi)型腫瘤細(xì)胞及其在體內(nèi)對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的影響，是下一步研究的方向。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示在體外右美托咪定對(duì)MGC-803胃癌細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響，表明右美托咪定可能不通過(guò)直接作用于MGC-803胃癌細(xì)胞對(duì)其生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，但是其作用于人體體內(nèi)是否通過(guò)其他途徑影響腫瘤的生長(zhǎng)目前還不清楚，因此右美托咪定應(yīng)用于胃癌患者的安全性還有待于進(jìn)一步的臨床觀察和深入研究。

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Effects of Dexmedetomidine on the Proliferation of MGC-803 Gastric Cancer Cell Lines in Vitro

ZENG Lian，YANG Li-yun.//Medical Innovation of China，2015，12（36）：001-004

Objective：To investigate the effects of Dexmedetomidine on the proliferation of MGC-803 gastric cancer cell lines in vitro.Method：The gastric cancer cells were randomly divided into six groups，the Dexmedetomidine groups（group A1，A2，A3，A4，A5） and the control group（group C）.The final concentration of Dexmedetomidine in the five Dexmedetomidine groups were 1000，100，10，1，0.1 ng/mL respectively.MTT method was used to test the optical density value and the proliferation rate was calculated.Result：There was no statistically significant difference between the Dexmedetomidine groups and the control group in the optical density value and the proliferation rate（P＞0.05）. Conclusion：Dexmedetomidine has no significant effect on the proliferation of MGC-803 gastric cancer cell lines in vitro.

Dexmedetomidine； MGC-803 gastric cancer cell lines； Proliferation

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.36.001

2015-09-21） （本文編輯：王利）

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費(fèi)科研課題（Z2013008）

①?gòu)V西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 廣西 南寧 530021

曾漣

First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China