張 哲，李新圃，楊 峰，羅金印，李曉強，劉龍海，李宏勝

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室，甘肅省新獸藥工程重點實驗室，蘭州730050；2.西藏奇正藏藥股份有限公司）

兩種多糖對奶牛乳房灌注的刺激性試驗

張 哲1，李新圃1，楊 峰1，羅金印1，李曉強2，劉龍海1，李宏勝1

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室，甘肅省新獸藥工程重點實驗室，蘭州730050；2.西藏奇正藏藥股份有限公司）

研究低聚糖硫酸酯和右旋糖酐硫酸酯兩種多糖對奶牛乳房灌注的刺激性，為其臨床應(yīng)用提供參考。將0.025 g/mL的兩種多糖溶液分別給奶牛乳房灌注10～50 mL，連續(xù)3 d，每天觀察奶牛體溫、食欲、過敏反應(yīng)、乳房性狀（紅、腫、熱、痛等癥狀）、乳汁外觀性狀，并以LMT法對乳汁進行檢測。試驗結(jié)果表明：奶牛乳房連續(xù)3 d灌注2.5%的兩種多糖液體10～15 mL，奶牛乳房及乳汁未出現(xiàn)任何不良反應(yīng)，但當(dāng)乳房連續(xù)灌注20～50 mL多糖溶液后，部分奶牛乳房出現(xiàn)紅腫、產(chǎn)奶量下降及乳汁變性等不良反應(yīng)。說明兩種多糖可用于奶牛乳房灌注，但安全使用范圍為每個乳區(qū)每次灌注量不應(yīng)超過0.45 g。

奶牛；乳房炎；低聚糖硫酸酯；右旋糖酐硫酸酯；乳房灌注；刺激性試驗

乳房炎由多種病原微生物引起，是奶牛場中最常見、防治難度大、治療成本較高的一種疾?。?］。盡管國內(nèi)外學(xué)者對乳房炎已進行了多年的研究，但它仍然是威脅世界奶牛業(yè)發(fā)展的一種多發(fā)病。使用抗生素治療乳房炎是目前較為有效的一種方法，但抗生素的大量使用會引起細菌耐藥性及藥物殘留等問題，已嚴(yán)重威脅到人類健康［2］。因此，尋找綠色、安全、高效的藥物來替代抗生素，已成為國內(nèi)外學(xué)者研究的焦點。

大量研究表明，多糖具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗衰老、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用［3-6］，且當(dāng)多糖經(jīng)化學(xué)修飾，尤其是硫酸化修飾后，其生物學(xué)活性更加廣泛，抗菌和抗病毒活性會進一步增強［7-8］。此外，多糖來源廣泛，對機體的毒副作用較小，因此，對多糖的研究已成為當(dāng)代生物科學(xué)的熱門領(lǐng)域［9］。低聚糖硫酸酯與右旋糖酐硫酸酯是低聚糖和右旋糖酐經(jīng)硫酸酯化后的產(chǎn)物，前期試驗已證實，2.5%的這兩種多糖對金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌具有良好的體外抑菌作用，且眼刺激性試驗表明這兩種多糖對兔眼無刺激性。為將這兩種多糖用于奶牛乳房炎的治療，筆者對其進行了奶牛乳房灌注刺激性試驗，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 經(jīng)淘汰、但部分乳區(qū)仍有泌乳功能的荷斯坦奶牛10頭，由甘肅荷斯坦奶牛繁育示范中心提供。

1.1.2 藥物 低聚糖硫酸酯（DEAE）及右旋糖酐硫酸酯（DS-4000），外觀為白色粉末狀，由西藏奇正藏藥股份有限公司生產(chǎn)并提供。

1.1.3 試劑 奶牛隱性乳房炎診斷液（LMT），由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院中獸醫(yī)研究所藥廠生產(chǎn)。

1.1.4 儀器 電子天平、注射器、乳頭管和體溫計等。

1.2 方法

1.2.1 藥液的配制 使用電子天平精確稱取DEAE和DS-4000適量，用生理鹽水分別配成濃度為2.5%（g/mL）的藥液，分裝于100 mL鹽水瓶，高壓滅菌后備用。

1.2.2 乳房灌注刺激性試驗 給藥前首先測量10頭淘汰奶牛的體溫，并記錄給藥前2 d各乳室泌乳量。體溫正常、乳汁LMT檢測呈陰性的奶牛方可進行刺激性試驗。采用乳頭管給藥法：用熱毛巾擦拭乳頭，并擠凈乳汁，用75%酒精棉球消毒乳頭，然后用乳導(dǎo)管插入乳頭管內(nèi)，放出乳池中殘留的余乳，爾后用無菌注射器將藥液注入乳室。每種藥物分別注射4頭奶牛，注射劑量分別為10、15、20和50 mL，另外2頭奶牛乳區(qū)分別灌注10 mL和50 mL生理鹽水作為對照。每頭奶牛每天注射1次，連續(xù)注射3 d。

1.2.3 乳房灌注藥液后觀察指標(biāo) 奶牛乳房灌注后，每天觀察奶牛的精神和食欲，測定體溫及記錄每個乳區(qū)的泌乳量；觀察奶牛有無發(fā)冷、震顫及心動過速等過敏反應(yīng)，乳房有無紅、腫、熱、痛等癥狀；檢查乳汁有無水樣、絮塊、血奶等病變，并對乳汁進行LMT檢測。

1.2.4 LMT檢測及評價 將LMT診斷液與乳汁充分混合后，依據(jù)凝集物的有無和凝集物量的多少及性狀進行判定。陰性（-）：乳汁體細胞數(shù)0～20萬/mL；可疑（±）：乳汁體細胞數(shù)15萬～50萬/mL；弱陽性（+）：乳汁體細胞數(shù)40萬～150萬/mL；陽性（++）：乳汁體細胞數(shù)80萬～500萬/mL；強陽性（+++）：乳汁體細胞數(shù)350萬以上/mL。

1.2.5 多糖對奶牛乳房刺激性評價標(biāo)準(zhǔn) 在每天給藥前以及最后1次給藥后1、2、4、24、48和72 h，檢查并記錄奶牛異常反應(yīng)，參照表1進行評分，如出現(xiàn)相應(yīng)的癥狀即為得1分，反之則為0分，每只奶?？偡e分相加再除以奶牛數(shù)即為該受試物對奶牛乳房刺激性的最后分值（按四舍五入取整數(shù)）。并按表2的評價標(biāo)準(zhǔn)判斷不同濃度的兩種多糖對奶牛乳房的刺激性。

表1 奶牛乳房刺激反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)

表2 奶牛乳房刺激性評價標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

乳房灌注10～15 mL2.5%的兩種多糖后，未觀察到肉眼可見變化；給藥劑量達到20 mL時，奶牛乳房出現(xiàn)輕微紅腫；給藥劑量為50 mL時，乳房出現(xiàn)紅腫，產(chǎn)奶量下降且乳汁呈水樣，LMT檢測為陽性。根據(jù)表1所示評分標(biāo)準(zhǔn)，10 mL及15 mL給藥組和對照組刺激反應(yīng)平均分值均為0，20 mL給藥組平均分值為3分，50 mL給藥組平均分值為7分。對照評價標(biāo)準(zhǔn)（表2）可知，10 mL和15 mL 2.5%的兩種多糖對奶牛乳房無刺激性，20 mL多糖有輕度刺激性，50 mL多糖有中度刺激性。

3 討論與結(jié)論

目前，對于藥物注射安全性評價多參照《化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》（國食藥監(jiān)注［2005］106號），采用家兔進行肌內(nèi)注射，取注射部位肌肉進行病理學(xué)觀察，并按照給定的標(biāo)準(zhǔn)進行評價［10］。但家兔肌肉與奶牛乳房組織存在很大區(qū)別，對藥物刺激性的反應(yīng)也會不同。乳房灌注是通過乳導(dǎo)管直接將藥液注射到患病乳區(qū)內(nèi)，使藥物直接作用于乳區(qū)內(nèi)的病原菌或病變部位，具有局部藥物濃度高、快速、高效、簡單易行等優(yōu)點，是目前國內(nèi)外治療奶牛乳房炎時最常用的局部給藥方式［11］。

林濤等［12］為檢測鹽酸吡利霉素的刺激性，對奶牛乳房分別灌注50～250 mg的鹽酸吡利霉素，在給藥前一天和給藥后的第2、4、8天，采集血液樣品進行生化分析，采集奶樣進行乳成分分析，并觀察、記錄各組牛的精神、食欲、呼吸、排泄等情況。結(jié)果表明，用藥前后，供試奶牛血常規(guī)、血清生化指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)，產(chǎn)奶量和乳成分正常，表明鹽酸毗利霉素乳區(qū)灌注不影響奶牛的正常生理功能。為研究中藥復(fù)方灌注劑對奶牛乳房的刺激性，孟慶娟［13］選取泌乳期健康山羊，乳房灌注10 mL供試藥液，以生理鹽水為對照，連續(xù)灌注5 d，每天按時觀察乳房的變化情況，有無紅、腫、熱、痛或激癢的反應(yīng)，同時測量其體溫，待藥液完全吸收后，將羊宰殺，取其乳腺做組織切片觀察。

以上兩種評價方法雖然都能反映出受試藥物對乳房的刺激性，但林濤等［12］的方法需多次采集血樣及奶樣，并通過血液生化儀和乳成分分析儀進行分析，操作繁瑣且需要特殊的試驗儀器，不易推廣；孟慶娟［13］采用奶山羊代替了奶牛，但成本仍然很高，且羊與奶牛乳房對藥物的刺激性反應(yīng)會有不同。參照以上兩種方法，結(jié)合實驗室多年對奶牛乳房炎臨床治療經(jīng)驗，筆者等對奶牛乳房分別灌注10～50 mL的兩種多糖，并以生理鹽水作為對照，通過對奶牛乳汁、乳房及全身的一些癥狀觀察，并參照自擬的評價標(biāo)準(zhǔn)，同時結(jié)合LMT試驗結(jié)果，判斷兩種多糖對奶牛乳房的刺激性。結(jié)果表明，奶牛乳房分別灌注2.5%的DEAE和DS-4000至20 mL時，乳房出現(xiàn)輕微紅腫；給藥劑量達50 mL時，乳房嚴(yán)重紅腫，產(chǎn)奶量下降且乳汁成水樣，LMT檢測為陽性。乳房出現(xiàn)紅腫可能是因為這兩種多糖能改善乳房組織微循環(huán)，使組織輕微充血。右旋糖酐在機體內(nèi)水解后會轉(zhuǎn)變成較低分子量的化合物，與血漿具有相同的膠體特性，可作為血漿代用品。小分子及低分子右旋糖酐能改善微循環(huán)，具有消除血管內(nèi)紅細胞聚集、防止血栓形成及滲透利尿的作用。右旋糖酐硫酸酯具有抗凝血活性［14］，并且對外周血中造血干細胞有動員作用。由于藥物的刺激使得機體釋放組胺，局部的小靜脈和毛細血管擴張及通透性增加［15］，造成局部組織的紅腫，血漿滲透壓的降低，導(dǎo)致組織液外流而引起乳汁成水樣。乳汁的分泌由一系列復(fù)雜的生理過程組成，受多種激素的調(diào)控［16］，產(chǎn)奶量的減少可能是由于藥物刺激引起的機體激素分泌紊亂造成的。LMT試驗是根據(jù)乳汁中細胞在表面活性劑和堿性藥物作用下，脂類物質(zhì)乳化，細胞被破壞，細胞蛋白隨之形成灰白或灰黃色粘性沉淀或灰紫色膠狀物質(zhì)團塊。健康乳室的乳汁一般因細胞數(shù)少（不超過20萬/mL乳汁），故無凝集物沉淀或僅有微量沉淀。當(dāng)給藥劑量達到50 mL時，乳汁LMT試驗為陽性，說明乳汁中存在大量的細胞。這可能是由于毛細血管通透性增加，使得細胞流入乳汁中。但出現(xiàn)乳房紅腫、產(chǎn)奶量下降且乳汁呈水樣及LMT陽性的原因是否如上所述，還需進一步的試驗探究。

綜上所述，低聚糖硫酸酯與右旋糖酐硫酸酯對奶牛乳房有一定的刺激性，兩種多糖可用于奶牛乳房灌注，但其安全使用劑量為每個乳區(qū)不超過0.45 g。本試驗制定的奶牛乳房灌注藥物刺激性評價標(biāo)準(zhǔn)，指標(biāo)可觀完善，方法操作簡便，不需要特殊試驗儀器，能夠真實反映藥物對奶牛乳房的刺激性，具有一定的應(yīng)用價值。

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Stimulation of Perfusion of Two Kinds of Polysaccharides on Breast in Dairy Cow

ZhangZhe，Li Xinpu，Li Hongsheng，et al
（KeyLaboratoryofNewAnimal DrugProject ofGansu Province,KeyLaboratoryofVeterinaryPharmaceutical Discovery,Ministry ofAgriculture,Lanzhou Institute ofAnimal Husbandryand Pharmaceutical Sciences,Chinese AcademyofAgricultural Sciences, Lanzhou 730050,China）

The stimulation test ofthe oligosaccharide sulfate and dextran sulfate in breast perfusion in dairycowwere done in order to provide a foundation for further clinical application of the two polysaccharides.10～50 mL of two polysaccharide solutions of 0.025g/mLwere perfused intobreast for three days.And then the temperature,appetite,allergic reaction,breast reaction,milk and the result of LMT were observed,respectively.The results showed that it’s safe to perfuse 10～15 mL of the polysaccharide solutions of 0.025 g/mL.But when the volume of solution reached to 20～50 mL，some breasts appeared inflamation,milk yield decrease,milk denaturation and other adverse reactions.That is to say,the polysaccharides can be used for breast perfusion,but no more than 0.45gper udder everytime.

dairycow；mastitis;oligosaccharide sulfate;dextran sulfate;breast perfusion;stimulation test

S823.5

A

2095-3887（2015）06-0038-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.06.012

2015-08-28

“十二五”國家科技支撐計劃（2012BAD12B03）；甘肅省科技支撐計劃（144NKCA240）；甘肅省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項目（GNCX-2013-59）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程項目（奶牛疾病研究團隊）

張哲（1990-），男，碩士研究生。

李宏勝（1964-），男，研究員，博士。研究方向：奶牛乳房炎免疫及預(yù)防。