潘章源，狄 冉，劉秋月，胡文萍，王翔宇，郭曉飛，儲明星

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部畜禽遺傳資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，北京100193）

遺傳育種

綿羊BMPR1B基因生物信息學(xué)分析

潘章源，狄 冉，劉秋月，胡文萍，王翔宇，郭曉飛，儲明星

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部畜禽遺傳資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，北京100193）

該研究從生物信息學(xué)角度分析BMPR1B基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、同源進(jìn)化和信號通路。結(jié)果顯示：綿羊BMPR1B DNA全長20 k，包含12個外顯子，其中FecB突變位于第8外顯子；BMPR1B具有3個保守motif和3個功能結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)ecB突變位于蛋白激酶功能結(jié)構(gòu)域，該突變改變了蛋白空間結(jié)構(gòu)；綿羊BMPR1B蛋白與山羊的同源性最高，首先相聚，其次為牛、狼、人、獼猴、小鼠、豬、原雞、斑馬魚；BMPR1B主要在TGFB通路中起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，是一個重要的膜受體。

綿羊；BMPR1B基因；生物信息學(xué)；FecB突變；蛋白互作

綿羊繁殖力是畜牧生產(chǎn)中最重要的經(jīng)濟(jì)性狀之一，其受到多個繁殖相關(guān)基因的調(diào)控，隨著對這些基因研究的不斷深入，信息量越來越大，對其信息進(jìn)行總結(jié)和分析顯得尤為必要。同時隨著生物信息技術(shù)的發(fā)展，一些數(shù)據(jù)庫越來越完善，分析軟件越來越精確，生物信息學(xué)也日益完善。此時通過生物信息學(xué)分析，一方面可以總結(jié)驗證基因的已知信息，另一方面還能挖掘該基因更為深入的未知信息，從而全面地認(rèn)識該基因在機(jī)體中所起的作用。因此，對一些功能基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析具有重要的意義。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1B（bone morphogenetic protein receptor 1B，BMPR1B）是一個受體蛋白，主要參與調(diào)控成骨分化、細(xì)胞擴(kuò)散和卵泡發(fā)育。綿羊BMPR1B基因位于第6號染色體，mRNA序列全長3 255 bp；BMPR1B基因存在一個FecB（fecundityBooroola）（A746G）突變，導(dǎo)致第249位氨基酸由谷氨酰胺（Q）變成了精氨酸（R）［1-3］，該突變對綿羊排卵數(shù)具有加性效應(yīng)，即每增加一個拷貝將額外多排卵1.65枚［4］，因此BMPR1B基因成為目前已知的并應(yīng)用于生產(chǎn)的綿羊高繁殖力標(biāo)記基因之一。目前研究表明，F(xiàn)ecB突變存在于世界各地各種高繁殖力綿羊品種中，主要包括Booroola Merino綿羊（澳大利亞）［1］、Bonpala綿羊（印度）［5］、Kalehkoohi綿羊（伊朗）［6］、小尾寒羊（中國）［7］、湖羊（中國）［8］、多浪羊（中國）［9］、策勒黑羊（中國）［10］和洼地綿羊（中國）［11］。FecB突變分布的廣泛性為提高綿羊產(chǎn)羔數(shù)提供了廣闊的前景，對通過分子標(biāo)記育種提高綿羊繁殖力極其重要。鑒于BMPR1B基因的重要性，而目前未見有關(guān)綿羊BMPR1B基因生物信息學(xué)報道，本研究通過網(wǎng)絡(luò)軟件和網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，利用生物信息學(xué)對BMPR1B基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)、同源進(jìn)化以及FecB突變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，同時對BMPR1B功能、信號通路和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行預(yù)測，從而獲得關(guān)于綿羊BMPR1B基因更加全面和深入的認(rèn)識，為進(jìn)一步研究BMPR1B基因生物學(xué)功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 序列來源

所有序列均來自NCBI和UCSC數(shù)據(jù)庫。包括綿羊BMPR1B基因DNA序列NC_019463；多個物種BMPR1B mRNA序列：綿羊（NM_001009431）、山羊（NM_001285575）、牛（NM_001105328）、人（NM_001256794）、獼猴（NM_001 266263）、豬（NM_001039745）、狼（NM_001145151）、小鼠（NM_007560）、大鼠（NM_001024259）、原雞（NM_205132）和斑馬魚（NM_131457）；同時獲得以上物種的蛋白質(zhì)序列。

1.2 方法

使用網(wǎng)絡(luò)比對軟件NCBI BLAST對綿羊DNA和mRNA序列進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，利用NCBI在線軟件ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）對BMPR1B基因開放閱讀框進(jìn)行分析，同源性分析和進(jìn)化樹分析分別使用 ClustalW 軟件（http：//www.ebi.ac. uk/Tools/msa/clustalw2/）和MEGA6。BMPR1B蛋白理化性質(zhì) 使 用 ExPASy-ProtParam tool（http：//web.expasy. org/protparam/）進(jìn)行分析。

二級結(jié)構(gòu)預(yù)測使用 HNN（http：//npsa-pbil.ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html），蛋白質(zhì)motif分析使用MEME（http：//meme.nbcr.net/meme/cgibin/meme.cgi），蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測使用HMMER和 SMART（http：//hmmer.janelia.org/），蛋白三維結(jié)構(gòu)圖使用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/），構(gòu)象調(diào)整使用SPDBV軟件。Pathway分析使用KEGG數(shù)據(jù)庫（http：//www.genome.jp/kegg/）。Gene ontology（GO）分析使用uniprot數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/）。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析使用網(wǎng)絡(luò)軟件STRING。

2 結(jié)果和分析

2.1 綿羊BMPR1B基因結(jié)構(gòu)分析

通過查詢NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得綿羊全長為3 255 bp的BMPR1B mRNA序列（NM_001009431）。將mRNA序列放置UCSC Table Browser程序中比對分析，獲得綿羊BMPR1B全長為225 039 bp的DNA序列。NCBI BLAST分析結(jié)果顯示，綿羊BMPR1B位于第6號染色體，為基因組反向擴(kuò)增序列。同時對比BMPR1B mRNA和DNA序列，結(jié)果顯示，BMPR1B基因包含12個外顯子，最大的外顯子為第12外顯子（1 720 bp），最小外顯子為5’UTR區(qū)域的41 bp小片段，而FecB突變位點位于BMPR1B第8外顯子。

2.2 綿羊BMPR1B蛋白理化性質(zhì)分析

ProtParam預(yù)測綿羊BMPR1B蛋白的理化性質(zhì)，BMPR1B基因編碼502個氨基酸，分子量56 907.4 Da，理論等電點pI為7.78。在組成BMPR1B蛋白的20種氨基酸中，亮氨酸所占比例最高，達(dá)10.0%。BMPR1B蛋白帶負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)61，帶正電荷氨基酸殘基數(shù)63，疏水指數(shù)83.29，屬于脂溶性蛋白。

2.3 綿羊BMPR1B蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分析

使用Hopfield神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（HNN）預(yù)測BMPR1B蛋白二級結(jié)構(gòu)，從預(yù)測結(jié)果（圖1A）可知，BMPR1B蛋白二級結(jié)構(gòu)組分中，α-螺旋占23.51%，β-折疊占21.31%，自由卷曲占55.18%。motif結(jié)果（圖1B）表明，BMPR1B主要存在3個motif，分別位于248-264 aa、354-403 aa和450-499 aa，這些motif是構(gòu)成功能結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)，圖1B表明，各物種間在這些motif上具有高度的保守性。進(jìn)一步分析綿羊BMPR1B功能結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)BMPR1B具有Activin受體結(jié)構(gòu)域、TGFB1結(jié)構(gòu)域和蛋白激酶功能結(jié)構(gòu)域（圖1C）。

FecB是BMPR1B基因極為重要的突變位點，分析表明FecB位于一個α-螺旋區(qū)域，屬于第一個保守motif，進(jìn)一步分析表明FecB位于蛋白激酶功能結(jié)構(gòu)域上。FecB突變使谷氨酰胺（Q）變成精氨酸（R），由不帶電中性氨基酸變成了帶負(fù)電的堿性氨基酸，其極可能改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)。如圖2所示，F(xiàn)ecB突變改變了BMPR1B蛋白的空間結(jié)構(gòu)，突變區(qū)域由向外開口，變成了向內(nèi)偏。

圖1 綿羊BMPR1B蛋白二級結(jié)構(gòu)功能結(jié)構(gòu)域分析

圖2 綿羊BMPR1B FecB突變型和野生型蛋白空間結(jié)構(gòu)對比圖

2.4 綿羊BMPR1B基因直系同源性分析和進(jìn)化樹分析

使用ClustalW軟件對各物種BMPR1B基因編碼區(qū)（CDS）進(jìn)行對比分析，結(jié)果顯示BMPR1B CDS序列在10個物種間具有比較高的保守性，綿羊與山羊、牛、人、獼猴、豬、狼、小鼠、原雞、斑馬魚CDS序列同源性分別達(dá)98.81%、98.21%、93.04%、93.57%、93.24%、92.58%、88.93%、81.31%和73.03%。對比各物種BMPR1B氨基酸序列，綿羊與山羊、牛、人、獼猴、豬、狼、小鼠、原雞、斑馬魚同源性分別達(dá)98.8%、99.8%、98.41%、99.2%、98.61%、99%、98.61%、92.23%和81.87%。應(yīng)用MEGA5.0軟件的鄰接法建立10個物種BMPR1B基因的進(jìn)化樹，結(jié)果顯示（圖3），綿羊與山羊親緣最近，與斑馬魚親緣最遠(yuǎn)，3種反芻動物綿羊、山羊和牛聚類在一起，人與獼猴聚類在一起。

圖3 BMPR1B同源蛋白序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.5 BMPR1B信號通路和蛋白互作通路分析

Gene Ontology（GO）分析結(jié)果表明，BMPR1B具有多項繁殖重要功能，包括卵丘細(xì)胞擴(kuò)展（GO∶0001550）、排卵循環(huán)（GO∶0042698）和細(xì)胞分化的正調(diào)控（GO∶0045597）；同時BMPR1B還具有骨骼系統(tǒng)發(fā)育（GO∶0001501）和軟骨凝結(jié)（GO∶0001502）等與成骨生成密切相關(guān)的功能。Pathway分析表明，BMPR1B主要參與4個信號通路，細(xì)胞因子受體互作（ko04060）、TGFB信號通路（ko04350）、Hippo信號通路（ko04390）、多功能干細(xì)胞的調(diào)節(jié)通路（ko04550）。綿羊以TGFB信號通路為最重要，該通路中具有多個與繁殖力密切相關(guān)的蛋白（BMPs）。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析（圖4）也表明，BMPR1B與TGFB信號通路中的蛋白都具有緊密的蛋白互作聯(lián)系，網(wǎng)絡(luò)中的蛋白彼此之間都有一定的關(guān)聯(lián)性，但是大部分蛋白均以BMPR1B為媒介與其他蛋白進(jìn)行關(guān)聯(lián)，這表明BMPR1B在這些信號通路中起著重要的作用。

圖4 BMPR1B蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

3 討論

基因是組成生物性狀的基本遺傳單位，對基因結(jié)構(gòu)的分析，就等同于對生命性狀的解析。BMPR1B是綿羊繁殖力重要候選基因，對其深入的分析，將為解析綿羊產(chǎn)羔性狀提供重要的基礎(chǔ)。分析表明，BMPR1B是一個長片段基因，其DNA全長為20 k，但其編碼區(qū)為1 509 bp，其它均為內(nèi)含子。目前一些研究表明，內(nèi)含子也具有調(diào)控基因的作用［12-14］，BMPR1B內(nèi)含子是否在調(diào)控上起作用，還有待進(jìn)一步研究。

蛋白結(jié)構(gòu)直接影響到蛋白的活性，早在2001年，Mulsant等［1］根據(jù)人TGF-β受體（TβR-I）和克莫司結(jié)合蛋白-12（FKBP-12）復(fù)合物模型，構(gòu)建了BMPR1B蛋白與FKBP-12的空間結(jié)構(gòu)模型，并認(rèn)為FecB突變使得FKBP-12對BMPR1B活性抑制作用增強(qiáng)，從而細(xì)胞對BMPR1B特異性配體的敏感性下降，最終使得綿羊排卵數(shù)提高，然而此文對BMPR1B二級結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域并無深入的分析。本研究分析表明，綿羊BMPR1B蛋白包含 α-螺旋 23.51%，β-折疊 21.31%和自由卷曲55.18%，這些結(jié)構(gòu)組成了3個高度保守的motif，并進(jìn)一步構(gòu)成Activin受體、TGFB1和蛋白激酶3個功能結(jié)構(gòu)域，這些功能結(jié)構(gòu)域從側(cè)面反映了BMPR1B的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。對比分析FecB突變，發(fā)現(xiàn)該突變處于蛋白激酶活性區(qū)域，暗示FecB突變可能改變BMPR1B蛋白激酶活性。蛋白空間結(jié)構(gòu)顯示，F(xiàn)ecB突變使得一個區(qū)域開口向外變成了向內(nèi)偏，可能正是由于這微小的空間結(jié)構(gòu)改變，使得BMPR1B功能活性發(fā)生改變。

本研究結(jié)果表明，各物種間BMPR1B編碼區(qū)和蛋白同源性基本一致，BMPR1B序列保守性強(qiáng)，密碼子偏好性不強(qiáng)。在進(jìn)化分析中，綿羊與山羊的分子距離最近，同源性達(dá)98.8%以上，這與動物學(xué)分類結(jié)果一致。小鼠和豬高繁殖力動物聚類在一起，與其他相對低繁殖力的物種有明顯的分支關(guān)系，暗示BMPR1B與繁殖力在遺傳進(jìn)化史上具有一定關(guān)聯(lián)性。

最新綿羊基因組測序結(jié)果表明，綿羊油脂代謝為多基因互作的結(jié)果，并具有明顯的信號通路［15］，而目前對綿羊繁殖力的研究也開始集中在信號通路上［16-17］。本研究通過信號通路分析，發(fā)現(xiàn)BMPR1B蛋白與TGFB信號通路中的蛋白（BMPs、GDF6、SMAD4）具有明確的互作關(guān)系，從整體上看BMPR1B在其中起著關(guān)鍵節(jié)點的作用，許多基因之間的互作關(guān)系都需要通過BMPR1B進(jìn)行關(guān)聯(lián)。目前研究表明，GDF9、BMP15基因與綿羊高繁殖力密切相關(guān)［18-19］，而在該蛋白互作圖中可以看到，GDF9、BMP15均與BMPR1B密切相關(guān)，它們是否存在于同一通路，還有待進(jìn)一步深入研究。同時蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中其他基因均可能與綿羊繁殖力有關(guān)聯(lián)性。

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過刊征訂

1.《中國草食動物》雜志1999年（1～6期）21元，2000—2002年（1～6期）27元，2003年（2～6期）33元，2004—2008年（1～6期）39元，2009—2014年（1～6期）48元（均含掛號郵資）；

2.有2002、2003、2004、2005、2006和2007年養(yǎng)羊?qū)］嫞òㄆ贩N、遺傳、繁育、營養(yǎng)、市場等內(nèi)容），價格分別為31、34、26、58、38、28元，含掛號郵資，數(shù)量有限，欲購從速；

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《中國草食動物科學(xué)》雜志社

Bioinformatics Analysis on BMPR1B Gene of Sheep

Pan Zhangyuan，Di Ran，Chu Mingxing，et al
（KeyLaboratoryofFarmAnimal Genetic Resources and GermplasmInnovation of MinistryofAgriculture，Institute of Animal Science，Chinese AcademyofAgricultural Sciences，Beijing100193，China）

In this study,the bioinformatics method was used to analyze the character of BMPR1B gene of sheep,including genetic structure,protein structure,physical and chemical properties,homologous evolution,signal pathways.The results showed that the complete DNA sequence of BMPR1B was 20 k,and it contained 12 exons.The FecB mutation located at the eighth exon.The analysis ofprotein structure showed that BMPR1B had three conservative motifs and three functional domains.The FecB mutation was present at the kinase domain and changed the construction of BMPR1B protein.Homologous evolution analysis showed that sheep had the highest homologyand the closest relationship with goat,followed bycattle,wolf,human,monkeys,mice,pigs,jungle fowl,zebrafish.Signaling pathway and protein interaction analysis showed that BMPR1B played an important role in the signal transduction ofTGFBpathwayas a membrane receptor.This paper has laid a biological foundation for further studyon the function ofBMPR1B gene in ovine reproduction.

sheep;BMPR1B gene;bioinformatics;FecB mutation;protein interaction

S826.2

A

2095-3887（2015）06-0001-05

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.06.001

2015-10-10

內(nèi)蒙古自治區(qū)科技重大專項；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-IAS13）；國家肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項（CARS-39）；新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項目（2013911056）；國家自然科學(xué)基金項目（31472078、31101687和31402041）；北京市自然科學(xué)基金項目（6144029）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（2011cj-7和2013ywf-zd-1）

潘章源（1986-），男，博士，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究。

儲明星（1968-），男，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究。