鄒有土，白羊，葛平輝，阮卡，陳星

·技術(shù)與方法·

阿達(dá)木單抗ELISA定量檢測方法的建立

鄒有土，白羊，葛平輝，阮卡，陳星

治療性單抗藥物已經(jīng)成為生物醫(yī)藥的重要組成部分，在疾病治療上具有廣闊的應(yīng)用前景，成功用于治療腫瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反應(yīng)等多種疾病。隨著研究的深入及技術(shù)的進(jìn)步，治療性單抗藥物呈現(xiàn)出良好的發(fā)展勢頭［1-2］。阿達(dá)木單抗是一種全人源的 IgG1型單克隆抗體，可靶向作用于在自身免疫疾病發(fā)病機(jī)制中起重要作用的促炎細(xì)胞因子——人腫瘤壞死因子（TNF-α）。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）、多關(guān)節(jié)型幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎（juvenile idiopathic arthritis，JIA）、銀屑病關(guān)節(jié)炎（psoriatic arthritis，PsA）和強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）患者關(guān)節(jié)滑液中均發(fā)現(xiàn) TNF-α水平增高，這與炎癥發(fā)生和關(guān)節(jié)破壞密切相關(guān)［3-4］。阿達(dá)木單抗可特異性、高親和地與TNF-α結(jié)合，并阻止它與細(xì)胞表面 TNF-α受體 p55和p75結(jié)合，從而拮抗 TNF-α的生物活性，減少表皮厚度和炎性細(xì)胞浸潤［5-6］。

由于阿達(dá)木單抗的特殊療效及其巨大的市場份額，許多醫(yī)藥企業(yè)通過生物仿制藥的方式加入到該產(chǎn)品的開發(fā)和生產(chǎn)中。在開發(fā)和生產(chǎn)過程中必須建立起嚴(yán)格高效的質(zhì)量控制方法，而含量的測定是重要的項(xiàng)目控制之一。本研究以hTNF抗原為包被抗原，羊抗人 IgG-HRP為檢測抗體，建立了定量測定阿達(dá)木單抗的 ELISA方法，并對(duì)該方法進(jìn)行了方法學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

阿達(dá)木單抗注射液（修美樂，Humira）購自美國雅培制藥；牛血清白蛋白（BSA）購自美國 Roche公司；hTNF抗原購自美國 BD Pharmingen公司；TMB購自美國 Fisher Scientific公司；羊抗人 IgG（H+L）-HRP購自美國 Pierce公司；吐溫 20為美國 Amresco公司分裝；其他常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品；苯乙烯 96孔板購自丹麥 Nunc公司；Sunrise型酶標(biāo)儀購自瑞士 Tecan公司。阿達(dá)木單抗發(fā)酵液、空白細(xì)胞株（不含阿達(dá)木單抗基因的細(xì)胞株）發(fā)酵液、輔料溶液（按阿達(dá)木單抗注射液處方的輔料組成制得的空白對(duì)照品溶液）均為本公司提供。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制 將阿達(dá)木單抗注射液稀釋至 1 ng/ml，之后再對(duì)倍系列稀釋到所需濃度。

1.2.2 含量檢測 用 pH 9.6的包被緩沖液稀釋 hTNF抗原后包被 96孔板，4℃ 過夜。洗板 3次，拍干，加封閉液 200 μl/孔，室溫封閉 2 h，洗板 3次，拍干。加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品 100 μl，37℃ 孵育 1 h，洗板6次，拍干，加檢測抗體 1∶10000，100 μl/孔，室溫孵育1 h。洗板 6次，拍干，加 TMB顯色液 100 μl/孔，室溫孵育 15 min，加終止液 100 μl/孔，測定 OD450值。

1.2.3 方法學(xué)研究

1.2.3.1 線性范圍 用 0.5 μg/ml的 hTNF抗原包被酶標(biāo)板，將阿達(dá)木單抗注射液稀釋至 8.0 ng/ml，然后進(jìn)行倍比稀釋，共 16個(gè)濃度梯度，每一稀釋度設(shè) 3個(gè)平行孔，分別加入酶標(biāo)板，加酶標(biāo)檢測抗體羊抗人IgG-HRP，顯色，檢測 OD450值，以阿達(dá)木單抗?jié)舛葹闄M坐標(biāo)，相應(yīng)的 OD450值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2 包被濃度與酶標(biāo)抗體濃度的優(yōu)化 用包被緩沖液將包被抗原 hTNF稀釋至 100、50、20 ng/ml三個(gè)濃度，各包被 3條標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)所用的酶標(biāo)孔。用抗體稀釋液將檢測抗體羊抗人 IgG-HRP稀釋至 1∶5000、1∶10000、1∶15000三個(gè)濃度，每個(gè)濃度的檢測抗體分別加入到 100、50、20 ng/ml三個(gè)濃度的 hTNF包被的酶標(biāo)板上，得到9條標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.3 靈敏度 空白樣品檢測 10次，計(jì)算 10個(gè)陰性孔 OD450的平均值（x）和標(biāo)準(zhǔn)差（S），從標(biāo)準(zhǔn)曲線中找到+2S相應(yīng)值的濃度定為該 ELISA方法的檢測限。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍確定定量限。

1.2.3.4 特異性 對(duì)所建立的 ELISA檢測方法進(jìn)行特異性分析。分別添加曲妥珠單抗、貝伐珠單抗、空白細(xì)胞株發(fā)酵液、輔料溶液，考察該方法的特異性。

1.2.3.5 準(zhǔn)確度 配制高（0.80 ng/ml）、中（0.20 ng/ml）、低（0.02 ng/ml）三個(gè)濃度的阿達(dá)木單抗溶液，分別加入到空白細(xì)胞株發(fā)酵液中，采用與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)測定的方法，在一次實(shí)驗(yàn)中每個(gè)濃度點(diǎn)測 5孔，計(jì)算平均回收率。

1.2.3.6 精密度 配制高（0.80 ng/ml）、中（0.20 ng/ml）、低（0.02 ng/ml）三個(gè)濃度的阿達(dá)木單抗溶液，采用與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)測定的方法，在一次實(shí)驗(yàn)中每個(gè)濃度點(diǎn)測 5孔，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)。連續(xù)測 5批次，計(jì)算批間變異系數(shù)。1.2.3.7 穩(wěn)定性 采用與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)測定的方法，即每天新配制標(biāo)準(zhǔn)溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，連續(xù) 8 d測定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，比較曲線的漂移。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 Microsoft Excel統(tǒng)計(jì)軟件 t檢驗(yàn)方法，對(duì)阿達(dá)木樣品添加干擾物質(zhì)后測得的 OD450值與單純阿達(dá)木樣品的OD450值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以 P=0.05為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 線性范圍

以阿達(dá)木單抗?jié)舛葹闄M坐標(biāo)，相應(yīng)的 OD450值為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在 1.0～0.0078 ng/ml的濃度范圍內(nèi) OD450和單抗?jié)舛蕊@示出良好的線性關(guān)系（r2= 0.9982），回歸方程 y=1.7361x+0.0783，將此濃度范圍定為 ELISA檢測阿達(dá)木單抗的線性范圍（圖 1）。

2.2 包被濃度與酶標(biāo)抗體濃度的優(yōu)化

通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，共得到 9條標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，包被濃度為 50 ng/ml，檢測抗體濃度為 1∶10000時(shí)，即能得到線性關(guān)系良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.9703x+0.0503，r2= 0.9995）（圖 2），同時(shí)節(jié)約了包被抗原的用量，因此將此條件定為 ELISA檢測阿達(dá)木單抗的合適條件。

圖1 ELISA檢測阿達(dá)木單抗的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 不同包被濃度與檢測抗體濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 靈敏度

通過試驗(yàn)得出此 ELISA方法的檢測限為 0.002 ng/ml；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍，定量限設(shè)為 0.0078 ng/ml。

2.4 特異性

添加曲妥珠單抗、貝伐珠單抗、空白細(xì)胞株發(fā)酵液、輔料溶液后測得的 OD450值均與無添加阿達(dá)木單抗溶液的OD450值相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），故該方法的特異性較好。

2.5 準(zhǔn)確度

在 5次試驗(yàn)中，3個(gè)濃度點(diǎn)的回收率分別為（91.50± 9.2）%、（86.50±8.0）% 和（80.00±6.8）%（表 1）。

表1 回收率測定結(jié)果

2.6 精密度

試驗(yàn)結(jié)果顯示，該檢測方法的批內(nèi)變異系數(shù)為 11.29%，批間變異系數(shù)為 12.60%（表 2、表 3）。

2.7 穩(wěn)定性

通過連續(xù) 8 d的測定，發(fā)現(xiàn)各點(diǎn) OD450值無明顯下降，通過線性擬合，相關(guān)系數(shù)（r2）都能達(dá)到 0.99以上，說明該方法具有較好的穩(wěn)定性。

表2 批內(nèi)精密度測定結(jié)果

表3 批間精密度測定結(jié)果

3 討論

目前常用 ELISA進(jìn)行藥物蛋白的定量檢測。在重組單抗藥物的發(fā)酵初期，表達(dá)量往往比較低，且發(fā)酵液中及純化中間樣品常含有其他的非目的蛋白，采用 ELISA進(jìn)行定量檢測，其檢測限低，特異性高，可以準(zhǔn)確地跟蹤重組單抗藥物的表達(dá)及純化情況。

本研究建立了定量檢測阿達(dá)木單抗的 ELISA方法，并進(jìn)行了包被濃度與酶標(biāo)抗體濃度的優(yōu)化。數(shù)據(jù)顯示優(yōu)化后的ELISA方法在 1.0～0.0078 ng/ml濃度范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)r2=0.9995；檢測限為 0.002 ng/ml，定量限為 0.0078 ng/ml。在高濃度（0.80 ng/ml）條件下回收率為（91.50±9.2）%，中濃度（0.20 ng/ml）條件下回收率為（86.50±8.0）%，低濃度（0.02 ng/ml）條件下回收率為（80.00±6.8）%。同樣，在中高濃度條件下，具有較低的變異系數(shù)（小于 10.0%）。由此可見，在測定阿達(dá)木單抗?jié)舛葧r(shí)，將樣品稀釋至中、高濃度范圍內(nèi)，能夠提高檢測的準(zhǔn)確度和精確度。實(shí)驗(yàn)還證明成品藥中的輔料成分及檢測樣品中的培養(yǎng)基成分對(duì)阿達(dá)木單抗的檢測均無干擾；8 d連續(xù)監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)曲線穩(wěn)定性良好。以上數(shù)據(jù)顯示了 ELISA檢測阿達(dá)木單抗良好的專屬性、穩(wěn)定性和適用性。

在單抗藥物的含量測定中，可以使用理化的分光光度法、Lowry法和二辛可酸（BCA）法及 HPLC法，還可使用 ELISA法檢測［7］。ELISA法是基于抗體特異性的免疫學(xué)方法，用相應(yīng)的抗原進(jìn)行包被，如檢測阿達(dá)木單抗，則選擇hTNF抗原作為包被抗原，從而具有很高的特異性。同時(shí)通過比較免疫學(xué)方法和理化方法測定的蛋白含量，還可以獲得總蛋白中具有特異性結(jié)合活性的蛋白所占比例的相關(guān)信息，但是 ELISA法測定單抗制品中單抗含量的過程中，需對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的含量和活性精確標(biāo)定，否則將使測定結(jié)果產(chǎn)生較大的誤差［7］。根據(jù)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，建立的 ELISA方法易于操作，快速高效，方法的準(zhǔn)確性和精密度良好，可以用于阿達(dá)木單抗的含量測定，為該重組單克隆抗體的快速定量檢驗(yàn)提供了方法學(xué)依據(jù)。

［1］ Simpson A，Caballero O.Monoclonal antibodies for the therapy of cancer.BMC Proc，8（Suppl 4）:O6.

［2］ Shao RG.Trends in antibody-based drugs for cancer therapy.Chin Med Biotechnol，2014，9（4）:288-290.（in Chinese）

邵榮光.抗腫瘤抗體藥物的研究趨勢.中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2014， 9（4）:288-290.

［3］ Scheinfeld N.Adalimumab（HUMIRA）:a review.J Drugs Dermatol，2003，2（4）:375-377.

［4］ Pomirleanu C，Ancuta C，Macovei L，et al.Prospective study of the efficiency and safety of adalimumab in treatment of active established rheumatoid arthritis.Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi，2012，116（2）: 395-400.

［5］ Tonelli F，Giudici F，Asteria CR.Effectiveness and safety of local adalimumab injection in patients with fistulizing perianal Crohn's disease:a pilot study.Dis Colon Rectum，2012，55（8）:870-875.

［6］ An FR，Cui L，Wang Q.Clinical study advances of adalimumab in treatment of autoimmune diseases.Chin J New Drugs Clin Rem，2010，29（6）:410-415.（in Chinese）

安富榮，崔嵐，王勤.阿達(dá)木單抗治療自身免疫疾病的臨床研究進(jìn)展.中國新藥與臨床雜志，2010，29（6）:410-415.

［7］ Zhang F.The quality control of therapeutic monoclonal antibody products.China Licensed Pharmacist，2013，10（1）:25-30，36.（in Chinese）

張峰.治療性單克隆抗體類制品質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的思考.中國執(zhí)業(yè)藥師，2013，10（1）:25-30，36.

［8］ Ma S，Mao Q，Liang Z，et al.Development of a sandwich ELISA for the quantification of enterovirus 71.Cytotechnology，2014，66（3）:413-418.

［9］ Kummitha CM，Mayle KM，Christman MA 2nd，et al.A sandwich ELISA for the detection of Wnt5a.J Immunol Methods，2010，352（1-2）:38-44.

［10］Corrales J，Gordon WL，Noga EJ.Development of an ELISA for quantification ofthe antimicrobialpeptide piscidin 4 and its application to assess stress in fish.Fish Shellfish Immunol，2009，27（2）:154-163.

［11］Friedrich M，Holtz W.Establishment of an ELISA for measuring bovine pregnancy-associated glycoprotein in serum or milk and its application for early pregnancy detection.Reprod Domest Anim，2010，45（1）:142-146.

［12］Kim TK，Lee JI，Kim JH，et al.Comparison of ELISA and HPLC methods for the determination of biogenic amines in commercial doenjang and gochujang.Food Sci Biotechnol，2011，20（6）:1747-1750.

［13］Kuntaruk S，Tatu T，Keowkarnkah T，et al.Sandwich ELISA for hemoglobin A2 quantification and identification of beta-thalassemia carriers.Int J Hematol，2010，91（2）:219-228.

［14］Cui Y，Zhou Y，Ma G，et al.Establishment of twonovel ELISA methods for Dermatophagoides farina-specific IgE detection with recombinant group 2 allergen.Ann Clin Lab Sci，2012，42（4）:392-396.

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.02.017

“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項(xiàng)（2011ZX09202-301-15）

361009廈門，未名生物醫(yī)藥有限公司

陳星，Email：15259203827@163.com

2014-12-08