王孟軍

重組人胸腺肽α1研究進(jìn)展

王孟軍

胸腺肽 α1（thymosin α1）是一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的小分子活性多肽，已廣泛應(yīng)用于臨床，主要用于原發(fā)性和繼發(fā)性免疫缺陷癥，如慢性乙型肝炎、重癥乙型肝炎、抗病毒、治療 AIDS等，并用作各種惡性腫瘤前期化療、放療的輔助用藥［1-3］。

胸腺肽 α1的生產(chǎn)技術(shù)經(jīng)歷了生物提取、固相合成等技術(shù)發(fā)展過程，目前主要采用固相合成法生產(chǎn)，雖然與生物提取法相比在質(zhì)量、成本等方面有較大優(yōu)勢(shì)，但仍然沒有解決工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)等問題。通過查詢各種公開資料及匯總分析各種方法、技術(shù)狀況，發(fā)現(xiàn)采用基因工程重組技術(shù)生產(chǎn)重組人胸腺肽 α1成為當(dāng)前研發(fā)的熱點(diǎn)，且首個(gè)重組人胸腺肽α1藥品即將獲批上市，顯示該技術(shù)具有較好的競(jìng)爭優(yōu)勢(shì)和發(fā)展?jié)摿Γ瑢⒊蔀榻窈笮叵匐?α1技術(shù)發(fā)展的主要方向。

1 胸腺肽 α1的制備技術(shù)

Goldstein等［4］在 20世紀(jì) 70年代末期從胸腺生成素第 5組分（TF5）中分離純化出一種小分子生物活性多肽，具有胸腺肽類似的生物活性，命名為胸腺肽 α1。它由 28個(gè)氨基酸組成，等電點(diǎn)為 4.2，相對(duì)分子量 3108，結(jié)構(gòu)式為：Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH。

目前生產(chǎn)胸腺肽 α1的技術(shù)有生物提取法和固相合成法，生物提取法是以新鮮小牛胸腺組織為原料，采用凍融和離子色譜法提純獲得胸腺肽 α1，固相合成法主要采用Wang樹脂等為起點(diǎn)，逐個(gè)添加氨基酸延伸肽鏈長度合成胸腺肽 α1。

生物提取法以動(dòng)物組織為原料，受原料來源及新鮮程度等影響，收率和質(zhì)量不易控制。曹強(qiáng)庚等［5］認(rèn)為不同年齡的牛胸腺組織中胸腺肽含量存在很大差別，剛出生的乳牛胸腺肽含量最高，而材料的新鮮程度也對(duì)胸腺肽的質(zhì)量和收率有較大影響。盡管生物提取法通過改進(jìn)工藝而不斷提高收率，但是胸腺肽在胸腺組織中的含量很低（＜1%）［6］，其有效成分胸腺肽 α1在市售胸腺肽粗粉中的含量也僅為 0.6%～1%。因此，原料來源少和收率低是生物提取法制備胸腺肽α1的最大限制因素。

固相合成法可生產(chǎn)純度很高的胸腺肽 α1，如劉標(biāo)和湯斌［7］采用反相離子對(duì)液相色譜法，通過多步分離純化獲得純度達(dá) 99.5%的胸腺肽 α1產(chǎn)品。但由于合成步驟多，周期長，條件苛刻，獲得高純度的產(chǎn)品需要多步純化，造成總收率偏低，成本偏高，而大量使用的溶媒會(huì)污染環(huán)境，進(jìn)一步增加了產(chǎn)品成本。因此，合成法生產(chǎn)技術(shù)關(guān)鍵是要減少反應(yīng)步驟，采用更為溫和的反應(yīng)條件，如能將催化劑用于固相合成反應(yīng)，尤其是各種生物酶，或?qū)⒍鄠€(gè)小肽鏈縮合反應(yīng)生成多肽的“多肽片段鏈接法”［8］等技術(shù)應(yīng)用于胸腺肽 α1的合成中，將會(huì)有很好的效果。

現(xiàn)有的生物提取法和固相合成法生產(chǎn)胸腺肽 α1因受到原料、技術(shù)、環(huán)境保護(hù)等因素影響，其生產(chǎn)成本居高不下，市場(chǎng)售價(jià)偏高，如 1.6 mg/支商品名為“日達(dá)仙”的注射用胸腺肽 α1藥品售價(jià)高于 700元，因此有必要尋求新的解決途徑。

2 重組人胸腺肽 α1制備技術(shù)

多肽類物質(zhì)來源于生物有機(jī)體，利用基因重組技術(shù)將目的基因整合到宿主中，使其具備表達(dá)目標(biāo)產(chǎn)物的能力，通過發(fā)酵方法可以獲得大量的目標(biāo)產(chǎn)物。經(jīng)過研究者的不懈努力，重組人胸腺肽 α1的技術(shù)已經(jīng)日漸成熟，首個(gè)產(chǎn)品即將上市［9］，將成為極有力的競(jìng)爭者。

2.1 基因工程菌的構(gòu)建技術(shù)

胸腺肽 α1是由 28個(gè)氨基酸組成的小分子多肽，選擇合適的目的基因載體和宿主是獲得有效表達(dá)胸腺肽 α1基因工程菌的關(guān)鍵。歸納已有文獻(xiàn)資料報(bào)道，目前基因工程菌的構(gòu)建主要有以下三種方式。

2.1.1 多串體基因 Xue等［10］利用隨機(jī)退火與 PCR技術(shù)相結(jié)合的方法構(gòu)建了胸腺素 α1的多串體基因，并成功克隆到大腸桿菌中；東北制藥集團(tuán)股份有限公司采用雙酶切方法將胸腺肽 α1四串體基因克隆至 pGEX-4T-2質(zhì)粒相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建融合表達(dá)載體 pGEX-4T-2-4Tα1，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌得到基因工程菌，在 IPTG誘導(dǎo)下以包涵體形式表達(dá)［11］。

2.1.2 融合蛋白 Zhang等［12］構(gòu)建了 hTα1-histag融合蛋白，在大腸埃希菌 BL21中獲得表達(dá)；陳培富等［13］將人工合成的人胸腺肽 α1基因插入到載體 pBV222，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α菌株中，置 42℃ 誘導(dǎo)表達(dá)含胸腺肽 α1的可溶性融合蛋白；劉中祿等［14］將人工合成的胸腺肽 α1基因序列進(jìn)行 PCR擴(kuò)增和酶切后，用T4DNA快速連接酶連接構(gòu)建 pMAL-C2x-Tα1融合表達(dá)質(zhì)粒，將重組體轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌 TB1菌中，成功構(gòu)建了 pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌；深圳市海王英特龍生物技術(shù)股份有限公司將人工合成的融合蛋白基因重組到載體質(zhì)粒 pet-22b中，將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主大腸桿菌成功構(gòu)建了工程菌［15］；Lao等［16］為了增強(qiáng)胸腺肽 α1在抗腫瘤治療中的藥效，將合成 Tα1-iRGD基因序列插入到載體pET32a，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 BL21（DE3），使胸腺肽 α1與腫瘤穿透肽 iRGD融合表達(dá)。

此兩種方法是將胸腺肽 α1肽鏈人為擴(kuò)充，使其易于克隆到宿主細(xì)胞中并能有效表達(dá)目標(biāo)產(chǎn)物，但產(chǎn)物是以融合蛋白形式存在，需要進(jìn)行酶切等后續(xù)處理才能獲得單一的胸腺肽 α1。

2.1.3 單體基因 長春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司構(gòu)建了分泌型表達(dá)載體 oSTII/Tα1，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌（E.coli W3110）使之成為工程菌，然后進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，目標(biāo)產(chǎn)物以單一組分分泌在細(xì)胞間質(zhì)中［17］；熊燕燕和湯斌［18］將人工合成的胸腺肽 α1單體基因連接到 pPIC9K質(zhì)粒上，構(gòu)建表達(dá)載體 pPIC9K-Tα1，整合到畢赤酵母中，目標(biāo)產(chǎn)物直接分泌到發(fā)酵液中，相比于融合表達(dá)，大大簡化了后續(xù)產(chǎn)品分離步驟。

比較以上不同方法可看出，采用多串體基因或融合蛋白方式克服了小分子肽難以表達(dá)的難題，構(gòu)建了有效表達(dá)胸腺肽 α1的工程菌，但因表達(dá)的目標(biāo)產(chǎn)物與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，需要進(jìn)行細(xì)胞破壁釋放，在后續(xù)純化時(shí)需要進(jìn)行酶切等處理，增加了技術(shù)難度和成本。然而，采用與腫瘤穿透肽等蛋白結(jié)合進(jìn)行融合表達(dá)，使其具備新的功能，是一個(gè)很好的創(chuàng)新思路。相比而言，單體基因技術(shù)具有相對(duì)優(yōu)勢(shì)，將合成的胸腺肽 α1單體基因與相關(guān)質(zhì)粒結(jié)合，整合到宿主細(xì)胞中，其優(yōu)勢(shì)在于可將產(chǎn)生的胸腺肽 α1分泌到發(fā)酵液中，大大降低了后續(xù)處理難度。

2.2 發(fā)酵純化技術(shù)

在成功獲得能表達(dá)胸腺肽 α1工程菌的同時(shí)，其發(fā)酵純化技術(shù)也取得了進(jìn)展。因基因工程菌的不同特點(diǎn)，發(fā)酵條件的優(yōu)化和后續(xù)純化又各有特點(diǎn)，目前主要有兩種方式。

采用融合蛋白方式構(gòu)建的工程菌在發(fā)酵時(shí)往往需要特定條件進(jìn)行誘導(dǎo)，主要以胞內(nèi)產(chǎn)物形式存在，純化時(shí)需要破壁及酶切融合蛋白。如深圳市海王英特龍生物技術(shù)股份有限公司將獲得的基因工程菌［E.coli，載體質(zhì)粒pet-22b/BL21（DE3）］在 10 L發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)分離后每升發(fā)酵液獲得 127.3 g濕菌體，純化過程采用菌體破碎、親和層析、腸激酶水解融合蛋白、離子交換等方法獲得純度大于 98%的重組胸腺肽 α1，折合表達(dá)量約254.6 mg/L［15］；劉中祿等［19］將獲得的重組工程菌（E.coli，Tα1/PMAL-C2x/TB1）進(jìn)行發(fā)酵并誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白MPB-Tα1，經(jīng)親和層析純化，凝血酶裂解融合蛋白，Source Q離子交換，得到蛋白純度大于 95% 的胸腺肽 α1。

與上述技術(shù)相比，采用單體基因方式獲得的基因工程菌可獲得胞內(nèi)或胞外產(chǎn)物，其在后續(xù)處理上有較大的優(yōu)勢(shì)。如熊燕燕和湯斌［18］采用獲得的含 pPIC9K-Tα1的畢赤酵母進(jìn)行培養(yǎng)，將目的蛋白直接分泌到發(fā)酵液中，取發(fā)酵液上清，過 DEAE52、SephadexG-25柱純化后獲得目的蛋白，采用Tricine-SDS-PAGE和 HPLC法分析，表達(dá)量為 4.8 mg/L。

無論以何種方式獲得的重組工程菌，其蛋白表達(dá)水平和后續(xù)的純化技術(shù)將決定其是否具備規(guī)模化生產(chǎn)能力，上述方法中構(gòu)建的單體基因重組的畢赤酵母工程菌具有一定的優(yōu)勢(shì)，應(yīng)成為今后技術(shù)發(fā)展的方向。由于其將目的蛋白直接分泌到發(fā)酵液中，經(jīng)過 DEAE52和 SephadexG-25兩步純化后可直接得到純度較高的胸腺肽 α1，相比于融合表達(dá)，大大簡化了分離步驟，降低了成本，易規(guī)?；a(chǎn)。

2.3 基因重組技術(shù)成為研發(fā)熱點(diǎn)

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，采用基因工程重組技術(shù)獲得胸腺肽 α1逐漸成為研發(fā)熱點(diǎn)，中國專利數(shù)據(jù)庫（http://epub. sipo.gov.cn/）數(shù)據(jù)顯示，與胸腺肽 α1重組技術(shù)相關(guān)的專利有 17項(xiàng)申請(qǐng)（表 1），國內(nèi)已有企業(yè)正在進(jìn)行藥品生產(chǎn)文號(hào)報(bào)批，重組人胸腺肽 α1技術(shù)有望實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。

表1 基因工程重組胸腺肽 α1的相關(guān)專利

2.4 即將產(chǎn)業(yè)化的專利技術(shù)

長春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司采用單體基因法構(gòu)建了工程菌（E.coli，oSTII/Tα1/W3110），并在 150 L發(fā)酵罐中進(jìn)行了高密度培養(yǎng)，目標(biāo)產(chǎn)物以單一組分分泌在細(xì)胞間質(zhì)中。發(fā)酵終止后收集菌體，采用低溫、低滲法裂解菌體，使用陰、陽離子交換層析進(jìn)行粗純，SephacrylS-100HR凝膠過濾層析法進(jìn)行精純，獲得了純度大于 98%的重組人胸腺肽 α1，折合每升發(fā)酵液可得到大于 110 mg的純品［17］。

該技術(shù)以酵母粉、葡萄糖等為原料，采用傳統(tǒng)發(fā)酵補(bǔ)料工藝生物合成胸腺肽 α1，其單一組分的純化過程較為簡單，步驟較少，較易獲得高純度產(chǎn)品。由于其具有較高的表達(dá)量、低廉的原材料成本，簡便的操控工藝，易于放大等特點(diǎn)，使工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)成為可能。

3 重組人胸腺肽 α1注冊(cè)現(xiàn)狀

1997年美國賽生（Sciclone）公司開發(fā)的胸腺肽 α1獲準(zhǔn)上市，并在 24個(gè)國家批準(zhǔn)用于慢性乙型肝炎的治療，在歐、美、日等國家和地區(qū)也用于治療丙型肝炎、肝細(xì)胞癌及免疫疾病。

據(jù)醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào)報(bào)道，2012年全國 22城市樣本醫(yī)院購入金額領(lǐng)先的 30個(gè)品種中，胸腺肽 α1位列第 18位，占比 0.73%［20］；2013上半年全國 22城市樣本醫(yī)院購入金額領(lǐng)先的 30個(gè)品種中胸腺肽 α1位列第 21位，占0.69%［21］，可見胸腺肽 α1是一種應(yīng)用較為廣泛的藥物。

查詢國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）網(wǎng)站（http:// www.sfda.gov.cn/），數(shù)據(jù)顯示國內(nèi)胸腺肽 α1原料藥生產(chǎn)批件有 4個(gè)，制劑生產(chǎn)批件有 10個(gè)，其中進(jìn)口制劑批件1個(gè)；重組人胸腺肽 α1新藥注冊(cè)申報(bào)有兩家，一家處于生產(chǎn)報(bào)批階段，另一家處于臨床研究階段。

基因工程重組技術(shù)解決了獲得高效表達(dá)胸腺肽 α1工程菌的難題，隨著生物技術(shù)上下游工藝水平的不斷提高，重組人胸腺肽 α1技術(shù)有望實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。2013年長春高新［9］已完成注射用重組人胸腺素 α1的臨床研究，獲批上市后將成為首個(gè)采用基因工程重組技術(shù)生產(chǎn)的胸腺肽 α1產(chǎn)品。深圳海王藥業(yè)有限公司研制的注射用重組人胸腺肽 α1于2009年 7月獲得臨床批件，目前正處于 II期臨床試驗(yàn)中。

4 展望

胸腺肽 α1是一種臨床應(yīng)用較廣的免疫調(diào)節(jié)劑，其在調(diào)節(jié)人體自身免疫能力，促使患者免疫平衡方面有很好的作用，廣泛用于自身免疫性疾病及腫瘤的防治。據(jù)國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì) 2013年公布的數(shù)據(jù)表明中國有近 1億乙肝病毒攜帶者［22］，《2012中國腫瘤登記年報(bào)》數(shù)據(jù)顯示 2009年全國新發(fā)腫瘤病例為 312萬例，腫瘤死亡率為 180.5/10萬，腫瘤防治形勢(shì)不容樂觀［23］。由于肝炎患者、癌癥患者的數(shù)量龐大且發(fā)病率不斷升高，預(yù)測(cè)免疫調(diào)節(jié)劑類藥物市場(chǎng)需求仍將平穩(wěn)增長。目前，固相合成仍是生產(chǎn)胸腺肽 α1的主要生產(chǎn)技術(shù)，基因工程重組技術(shù)正在成為新的研發(fā)熱點(diǎn)。在眾多開發(fā)的基因重組技術(shù)中，采用單體基因構(gòu)建工程菌是一種有競(jìng)爭力的技術(shù)，有望成為重組人胸腺肽 α1的主要技術(shù)發(fā)展方向。隨著首個(gè)重組人胸腺肽 α1藥品的上市，將會(huì)起到導(dǎo)向作用，從而促進(jìn)技術(shù)水平不斷提高，為工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)提供有力條件。

［1］ Xiao L，Yu X，Wang XD，et al.Thymosin α1 application status in the comprehensive treatment of malignant tumors.Med J West China，2010，22（3）:561-563.（in Chinese）

肖凌，余曦，汪曉東，等.胸腺肽α1在惡性腫瘤綜合治療中的應(yīng)用現(xiàn)狀.西部醫(yī)學(xué)，2010，22（3）:561-563.

［2］ Li WY，Lu HM，Guo Q，et al.Effects of thymosin α1 immune effector molecules of mouse.J Sichuan Univ（Med Sci Ed），2014，45（3）: 400-404.（in Chinese）

李煒曄，陸惠敏，郭強(qiáng)，等.胸腺肽α1對(duì)小鼠機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響.四川大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2014，45（3）:400-404.

［3］ Shui HF.Effects of thymosin α1 combined chemotherapy for patients with lung cancer and immune function.Chin J Mod Drug Appl，2014，8（10）:131-132.（in Chinese）

水會(huì)鋒.胸腺肽α1聯(lián)合化療對(duì)肺癌患者療效及免疫功能的影響.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2014，8（10）:131-132.

［4］ Goldstein AL，Low TL，McAdoo M，et al.Thymosin alpha1:isolation and sequence analysisofan immunologically active thymic polypeptide.Proc NatlAcad Sci U SA，1977，74（2）:725-729.

［5］ Cao QG，He SC，Zhong LJ，et al.Discussion on the factors influencing the yield and activity of thymosin.J Taishan Med Coll，2003，24（2）:181-182.（in Chinese）

曹強(qiáng)庚，何淑才，仲立軍，等.影響胸腺肽收率和活性因素的探討.泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，24（2）:181-182.

［6］ Lin Y，Zhong HL，Shen QC，et al.Optimized technology for extracting thymosin by response surface methodology.Biotechnology，2010，20（5）:62-66.（in Chinese）林瑩，鐘恒祿，沈前程，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化小牛胸腺肽提取工藝.生物技術(shù)，2010，20（5）:62-66.

［7］ Liu B，Tang B.Preparation of high-purity thymosin α1.CIESC J，2013，64（7）:2497-2502.（in Chinese）

劉標(biāo)，湯斌.高純胸腺肽α1的制備.化工學(xué)報(bào)，2013，64（7）:2497-2502.

［8］ Ma Y，Zhao YF.Polypeptide fragment connection:a new method for synthesis of protein.Chinese Science Bulletin，2002，47（16）:1201-1205.（in Chinese）

麻遠(yuǎn)，趙玉芬.多肽片段連接:合成蛋白質(zhì)的一種新方法.科學(xué)通報(bào)，2002，47（16）:1201-1205.

［9］ ChangchunHigh-techIndustrial（Group）Co.，Ltd.Changchun High-tech:2014 Semi-annual report.（2014-08-22）［2014-09-18］. http://app.finance.ifeng.com/data/stock/ggzw/000661/14728315. （in Chinese）

長春高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司.長春高新:2014年半年度報(bào)告.（2014-08-22）［2014-09-18］.http://app.finance.ifeng.com/data/ stock/ggzw/000661/14728315.

［10］Xue XC，Yan Z，Li WN，et al.Construction，expression，and characterization of thymosin alpha 1 tandem repeats in Escherichia coli.Biomed Res Int，2013，2013:720285.

［11］Northeast Pharm Group Co.，Ltd.A recombinant human thymosin alpha 1 and preparation method.China，CN103789321A.2014-05-14. （in Chinese）

東北制藥集團(tuán)股份有限公司.一種重組人胸腺肽α1的制備方法.中國，CN103789321A.2014-05-14.

［12］Zhang HY，Chen PF，Xu JM，et al.Separation and purification of Escherichia coli-expressed human thymosin-α1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography. Protein Expr Purif，2011，77（2）:140-145.

［13］Chen PF，Li HF，Lu QF，et al.Thermo-inductively prokaryotic expression in a soluble form and easy purification of thymosin α1. J YunnanAgricultural Univ，2012，27（2）:183-187.（in Chinese）

陳培富，李紅芳，魯瓊芬，等.胸腺肽α1的溫度誘導(dǎo)原核可溶性表達(dá)與簡易純化.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，27（2）:183-187.

［14］Liu ZL，Tao CL，Shen XN，et al.Construction and expression of recombinant Tα1 pMAL-C2x-Tα1/TB1 engineering strain.Chin J Comp Med，2012，22（7）:13-16.（in Chinese）

劉中祿，陶翠蘭，莘旭妮，等.重組胸腺素α1 pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌的構(gòu)建與表達(dá).中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2012，22（7）:13-16.

［15］Shenzhen Neptunus Interlong Bio-technique Co.，Ltd.A recombinant thymosin alpha 1 and preparation method.China，CN102660568A. 2012-09-12.（in Chinese）

深圳市海王英特龍生物技術(shù)股份有限公司.一種重組胸腺肽α1的制備方法.中國，CN102660568A.2012-09-12.

［16］Lao X，Liu M，Chen J，et al.A tumor-penetrating peptide modification enhances the antitumor activity of thymosin alpha 1.PLoS One，2013，8（8）:e72242.

［17］GeneScience Pharmaceuticals Co.，Ltd.Nα-de-acetylation of human expression vector thymosin α1 monomer，engineering bacteria and its preparation method.China，CN1316028C.2007-05-16.（in Chinese）

長春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司.Nα-脫乙?；诵叵偎卅?單體的表達(dá)載體、工程菌及其制備方法.中國，CN1316028C.2007-05-16.

［18］Xiong YY，Tang B.Expression and purification of thymosin α1 in Pichia pastoris.J Anhui Polytechnic Univ，2013，28（2）:4-6.（in Chinese）

熊燕燕，湯斌.胸腺肽α1在畢赤酵母中的表達(dá)及純化.安徽工程大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，28（2）:4-6.

［19］Liu ZL，Tao CL，Shen XN，et al.Fermentation，purification and drug efficacy study of recombinant thymosin alpha1.Chin J Vet Sci，2013，33（3）:414-417.（in Chinese）

劉中祿，陶翠蘭，莘旭妮，等.重組胸腺素α1的發(fā)酵、純化及藥效研究.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，33（3）:414-417.

［20］Gan RF.Market moderate recovery antineoplastic first rod.Medicine Economic News，2013-04-24（A03）［2014-08-20］.http://www.yyjjb. com/html/2013-04/24/content_190448.htm.（in Chinese）

干榮富.市場(chǎng)溫和復(fù)蘇 抗腫瘤藥首棒.醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào)，2013-04-24 （A03）［2014-08-20］.http://www.yyjjb.com/html/2013-04/24/content_ 190448.htm.

［21］Gan RF.The first half of 2013 total of 22 sample hospitals in medication.Shanghai Med Pharm J，2013，34（21）:36-40.（in Chinese）

干榮富.2013年上半年22地區(qū)樣本醫(yī)院用藥總體分析.上海醫(yī)藥，2013，34（21）:36-40.

［22］Hepatitis B virus carriers worldwide nearly 100 million of China's 350 million.XinhuaNet，（2013-07-26）［2014-09-20］.http://news.xinhuanet. com/health/2013-07/26/c_116704573.htm.（in Chinese）

乙肝病毒攜帶者全球3.5億我國近1億.新華網(wǎng)，（2013-07-26）［2014-09-20］.http://news.xinhuanet.com/health/2013-07/26/c_116704 5 3.htm.

［23］He J，Chen WQ.Chinese cancer registry annual report 2012.Beijing: Military Medical Science Press，2012.（in Chinese）

赫捷，陳萬青.2012中國腫瘤登記年報(bào).北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2012.

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.02.016

213022常州，江蘇太平洋美諾克生物藥業(yè)有限公司，Email：mjunw09@163.com

2014-07-25