肖會敏，康小剛，鮑沈平，楊 倩，謝艷華，王四旺

（第四軍醫(yī)大學(xué)：1藥學(xué)院藥物研究所，2西京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西西安710032；3沈陽軍區(qū)司令部門診部，遼寧沈陽110000）

UFLC法同時測定參花膠囊中9個成分的含量

肖會敏1，康小剛2，鮑沈平3，楊 倩1，謝艷華1，王四旺1

（第四軍醫(yī)大學(xué)：1藥學(xué)院藥物研究所，2西京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西西安710032；3沈陽軍區(qū)司令部門診部，遼寧沈陽110000）

目的：建立UFLC法同時測定參花膠囊中綠原酸、羥基紅花色素A、芍藥苷、丹酚酸B、甘草酸、甘草苷、迷迭香酸、隱丹參酮、丹參酮ⅡA的含量，為制劑質(zhì)量控制提供理論依據(jù)．方法：色譜柱：Kromasil C18（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0．5%磷酸水溶液（每1000 mL含2．0 g磷酸二氫鉀）梯度洗脫；流速：1．0 mL／min；檢測波長：230 nm（芍藥苷、甘草酸），270 nm（甘草苷、隱丹參酮、丹參酮ⅡA），330 nm（綠原酸、羥基紅花黃色素A、迷迭香酸、丹酚酸B）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5 μL．結(jié)果：在上述色譜條件下，9個成分的峰具有良好的分離度；綠原酸、羥基紅花色素A、芍藥苷、甘草苷、迷迭香酸、丹酚酸B、甘草酸、丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮ⅡA的線性范圍分別為 7．00～70．00、40．00～400．00、62．50～625．00、13．00～130．00、8．80～88．00、50．00～500．00、48．00～480．00、5．00～50．00和8．20～820．00 mg／L，相關(guān)系數(shù)分別為0．9999、0．9994、0．9998、0．9996、0．9994、0．9995、0．9995、0．9994和0．9994；9個對照品的平均加樣回收率均在98．6%～99．20%之間，RSD均在0．5%～2．0%之間；10批制劑中綠原酸、羥基紅花色素A、芍藥苷、甘草苷、迷迭香酸、丹酚酸B、甘草酸、隱丹參酮、丹參酮ⅡA的平均含量（mg／粒）與RSD（%）值分別為0．243、0．80，2．139、0．65，1．321、0．57，0．316、1．55，0．414、1．79，8．815、0．10，1．033、0．16，0．173、1．19，0．487、0．79．結(jié)論：9個成分的含量測定方法簡便、穩(wěn)定可靠、準(zhǔn)確，可作為參花膠囊質(zhì)量評價方法之一．

參花膠囊；高效液相色譜；甘草苷；迷迭香酸；綠原酸；羥基紅花色素A；芍藥苷；丹參酮ⅡA

0 引言

參花膠囊由丹參、川芎、紅花、赤芍、菊花、山楂、甘草七味中藥組成．本組方主要用于活血化瘀、行氣止痛等．方中丹參主要活性成分有丹參酮類、丹酚酸類［1］．川芎所含有效成分為四甲基吡嗪、阿魏酸、揮發(fā)油等［2］．紅花主要有黃酮類如紅花黃色素、羥基紅花黃色素A等［3］．赤芍的化學(xué)成分主要為單萜及單萜苷類化合物如芍藥苷、羥基芍藥苷等［4］．菊花主要成分為揮發(fā)油成分、黃酮類化合物和綠原酸等［5］．山楂的成分有黃酮類、有機(jī)酸類等［6］．甘草中活性物質(zhì)有甘草苷、甘草酸等［7］．本處方由水提與醇沉等工藝制成．為分析該方中的功效成分，本研究采用快速液相色譜（UFLC）法對其進(jìn)行分析，對該制劑中9個成分即綠原酸、羥基紅花色素A、芍藥苷、丹酚酸B、甘草酸、甘草苷、迷迭香酸、隱丹參酮、丹參酮ⅡA進(jìn)行定量分析．

1 儀器和試藥

島津高效液相色譜儀，型號Prominence UFLC，配LC-20AD雙泵，SPD-M20A二極管陣列檢測器，SIL-20ACHT自動進(jìn)樣器，CTO-20A柱溫箱，LC／Labsolui-on色譜工作站，日本島津公司；電子分析天平，型號RD-200，德國塞多利斯公司；KQ-300DE數(shù)控超聲波發(fā)生器，昆山超聲儀器有限公司．乙腈、甲醇，色譜級，美國Honeywell公司；水為自制超純水，由美國Millipore純水儀，美國millipore公司；其余為分析純．綠原酸、羥基紅花色素A、芍藥苷、丹酚酸B、甘草酸、甘草苷、迷迭香酸、丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮ⅡA對照品均購自中國藥品生物制品檢定研究院；參花膠囊（批號 20090908，2009091，20090928，20130601，20130602，20130603，20130604，20130605，20130606，20130607）由第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物研究所研制．

2 方法和結(jié)果

2．1 色譜條件［8］色譜柱為Kromasil C18（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0．5%磷酸水溶液溶液（B，每1000 mL溶液中含2．0 g磷酸二氫鉀），梯度洗脫，0～15 min，A 5%→21%；15～45 min，A 21%→42%；45～75 min，A 42%→100%；75～80 min，A 100%．記錄時間為80 min．體積流量：0．8 mL／min；柱溫：30℃；檢測波長：分別為230 nm（芍藥苷、甘草酸）、270 nm（甘草苷、隱丹參酮、丹參酮ⅡA）、330 nm（綠原酸、羥基紅花黃色素A、迷迭香酸、丹酚酸B）；進(jìn)樣量：5 μL．

2．2 混合對照品溶液與供試品溶液的制備

2．2．1 混合對照品溶液的配制 精密稱取綠原酸7．00 mg、迷迭香酸8．80 mg、丹參酮ⅡA 8．20 mg置于10 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，即得3個對照品混合溶液（A溶液）．另精密稱取羥基紅花色素A 4．00 mg、芍藥苷6．25 mg、甘草酸4．80 mg、甘草苷13．00 mg、隱丹參酮5．00 mg、丹酚酸B 5．00 mg置于10 mL量瓶中，精密加入A溶液1．00 mL，再加70%甲醇至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液（含9個對照品），作為儲備液（B溶液）．

2．2．2 供試品溶液的制備 取10粒本品內(nèi)容物，稱取0．5 g，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加70%甲醇適量，超聲30 min，放涼，加70%甲醇至刻度，濾過（0．45 μm濾膜），濾液作為供試品溶液．

2．3 線性關(guān)系的考察 分別精密量取B溶液0．10、0．20、0．40、0．80，1．00 mL對照品溶液于1 mL量瓶中并加70%甲醇稀釋至刻度即得，用0．45 μm微孔濾膜濾過，進(jìn)樣．分別以各對照品的濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算，得線性方程，結(jié)果見表1，表明各對照品在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好．

表1 各對照品的線性方程及其濃度范圍

2．4 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述線性對照品溶液（0．20 mL B溶液加70%甲醇定容至1 mL），重復(fù)進(jìn)樣5次，結(jié)果測得相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）：綠原酸為0．81%，羥基紅花色素 A為 0．87%，芍藥苷為0．95%，丹酚酸B為0．95%，甘草酸為0．78%，甘草苷為0．83%，迷迭香酸為 0．92%，隱丹參酮為0．62%，丹參酮ⅡA為0．98%，表明儀器精密度良好．

2．5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品（批號20090908）5份，分別按“2．2．2”項(xiàng)下方法制備供試品，按“2．1”項(xiàng)下條件測定．測得平均含量與RSD值結(jié)果：綠原酸為0．24 mg／g與1．13%，羥基紅花色素A為2．12mg／g與1．07%，芍藥苷為1．31 mg／g與1．02%，丹酚酸B為8．80 mg／g與1．25%，甘草酸為1．03 mg／g與1．11%，甘草苷為0．31 mg／g與1．31%，迷迭香酸為0．40 mg／g與1．03%，隱丹參酮為0．17 mg／g與0．94%，丹參酮ⅡA為0．48 mg／g與1．42%．表明該方法重復(fù)性良好．

2．6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取上述線性對照品溶液（0．20 mL B溶液加70%甲醇定容至1 mL），在第0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣．結(jié)果，綠原酸、羥基紅花色素A、芍藥苷、丹酚酸B、甘草酸、甘草苷、迷迭香酸、隱丹參酮、丹參酮ⅡA的峰面積的RSD值分別為1．18%、1．03%、1．23%、1．07%、1．32%、1．14%、1．29%、1．37%、1．41%，表明該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定．

2．7 加樣回收率試驗(yàn) 取10粒本品（批號20090908，其中綠原酸、羥基紅花色素A、芍藥苷、丹酚酸B、甘草酸、甘草苷、迷迭香酸、隱丹參酮、丹參酮ⅡA平均含量分別為0．24、2．12、1．31、8．80、1．03、0．48、0．40、0．17、0．48 mg／g）內(nèi)容物，混勻，稱取粉末0．5 g，精密稱定，分別加（精密稱取綠原酸2．40 mg、羥基紅花色素A 20．00 mg、芍藥苷12．00 mg、甘草苷3．20 mg、迷迭香酸4．00 mg、丹酚酸B 40．00 mg、甘草酸10．00 mg、隱丹參酮2．00 mg、丹參酮ⅡA 4．8 mg，加70%甲醇定容至20 mL，搖勻，即得）混合對照品溶液1．0 mL或2．0 mL或4．0 mL，照“2．2．2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，重復(fù)制樣6份，按照“2．1”項(xiàng)下色譜條件測定．結(jié)果詳見表2，表明該方法回收率良好．

2．8 含量測定 各批次樣品中綠原酸、羥基紅花色素A、芍藥苷、丹酚酸B、甘草酸、甘草苷、迷迭香酸、隱丹參酮、丹參酮ⅡA含量測定：精密稱10批樣品，分別按“2．2．2”項(xiàng)下方法制備供試品，按“2．1”項(xiàng)下條件測定．結(jié)果，綠原酸、羥基紅花色素A、芍藥苷、丹酚酸B、甘草酸、甘草苷、迷迭香酸、隱丹參酮、丹參酮ⅡA的平均含量（mg／粒，0．4g／粒）分別為0．243，2．139，1．321，0．316，0．414，8．815，1．033，0．173和0．487 mg／粒，RSD分別為0．80%，0．65%，0．57%，1．55%，1．79%，0．10%，0．16%，1．19%和0．79%；色譜圖見圖1．

3 分析和討論

3．1 波長的選擇 使用二極管陳列檢測器對參花膠囊樣品進(jìn)行全波長掃描，主要依據(jù)每個化合物的最大吸光值與分離度，確定綠原酸、羥基紅花黃色素A、迷迭香酸、丹酚酸B檢測波長為330 nm，芍藥苷與甘草酸檢測波長為230 nm，甘草苷、隱丹參酮及丹參酮ⅡA檢測波長為270 nm．

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

圖1 不同波長的對照品與供試品UFLC色譜圖

3．2 色譜條件的選擇 采用梯度洗脫，選擇不同品牌的反相C18色譜柱如Phenomenex Luna C18、Kro-masil C18、Ultimate○R XB C18等進(jìn)行過比較，選擇不同規(guī)格如（250 mm×4．6 mm，5 μm）、（150 mm× 4．6 mm，5 μm）、（75 mm×4．6 mm，5 μm）等進(jìn)行比較，選擇不同流動相系統(tǒng)如甲醇-水、乙腈-水、乙腈-醋酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液及乙腈-0．5%磷酸水溶液（1000 mL溶液中含2．0 g磷酸二氫鉀）等，結(jié)果采用Kromasil C18（250 mm×4．6 mm，5 μm）與流動相系統(tǒng)乙腈-0．5%磷酸水溶液（1000 mL溶液中含2．0 g磷酸二氫鉀），其圖譜上各個色譜峰的分離度較好，保留時間適中，因此將此條件作為檢測色譜條件．

3．3 供試品制備方法 對供試品的制備方法進(jìn)行考察如溶劑選擇（甲醇、水、不同濃度的甲醇）、提取方法（超聲及超聲時間、浸漬、加熱回流）等，由于浸漬提取時間過長，加熱回流提取多種物質(zhì)被破壞（與超聲提取比較相應(yīng)時間范圍內(nèi)未見色譜峰出現(xiàn)）、而超聲提取時間短色譜信息豐富．綜合上述各因素選擇70%甲醇超聲30 min提取，得到較理想的色譜峰信息（如峰面積大、分離度好等）．

3．4 7個化合物轉(zhuǎn)移率 建立方法的目的是為了檢測制劑中的有效成分，而有效成分才是制劑臨床療效的保證．因此，筆者用2．1項(xiàng)色譜條件對藥材與對應(yīng)制劑（批號20130601～20130607）中綠原酸、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、芍藥苷、甘草酸、甘草苷、丹參酮ⅡA的含量進(jìn)行計(jì)算，得出其轉(zhuǎn)移率分別為70．37%、94．12%、95．25%、32．35%、32．95%、39．91%、89．35%．結(jié)果表明芍藥苷、甘草酸、甘草苷三個轉(zhuǎn)移率不高，但中藥作為一個復(fù)雜的分子體系，藥效是多分子多靶點(diǎn)共同作用的結(jié)果，所以還需要對該制劑物效基礎(chǔ)進(jìn)行深入研究．

綜上所述，經(jīng)過試驗(yàn)建立了參花膠囊的UFLC含量測定方法，同時測定了10批次該制劑中的9個成分，含量均一．上述方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、操作簡單，易于實(shí)施，同時為規(guī)范和優(yōu)化本品的生產(chǎn)工藝，保證質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性，為達(dá)到用藥安全、穩(wěn)定的目的提供了理論依據(jù)，因此該方法可作為評價參花膠囊質(zhì)量的有效方法之一．

［1］徐麗君，黃光英．丹參的化學(xué)成分及其藥理作用研究概述［J］．中西醫(yī)結(jié)合研究，2009，1（1）：45-48．

［2］金玉青，洪遠(yuǎn)林，李建蕊，等．川芎的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］．中藥與臨床，2013，4（3）：44-48．

［3］徐如英，童樹洪．紅花的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］．中國藥業(yè)，2010，19（20）：86-87．

［4］阮金蘭，趙鐘祥，曾慶忠，等．赤芍化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展［J］．中國藥理學(xué)通報，2003，19（9）：965-970．

［5］張清華，張 玲．菊花化學(xué)成分及藥理作用的研究進(jìn)展［J］．食品與藥品，2007，9（2A）：60-63．

［6］吳士杰，李秋津，肖學(xué)風(fēng)，等．山楂化學(xué)成分及藥理作用的研究［J］．藥物評價研究，2010，33（4）：316-319．

［7］劉育辰，陳有根，王 丹，等．甘草化學(xué)成分研究［J］．藥物分析雜志，2011，31（7）：1251-1255．

［8］肖會敏，何 悅，王四旺，等．紫參片的HPLC指紋圖譜研究及5個成分含量測定［J］．藥物分析雜志，2012，32（10）：1756-1761．

Determination of nine components in Shen-hua Capsules by UFLC

XIAO Hui-Min1，KANG Xiao-Gang2，BAO Shen-Ping3，YANG Qian1，XIE Yan-Hua1，WANG Si-Wang11
Institute of Materia，School of Pharmacy，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，China；2Department of Neu-rology，Xijing Hospital of the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，China；3Out-Patient Department，Shenyang Mili-tary Region Headquarters，Shenyang 110000，China

AIM：To establish an UFLC method for simultaneous determination of Chlorogenic acid，Safflomin A，Paeoniflorin，Salvianolic acid B，Glycyrrhizic Acid，Liquiritin，Rosmarinic acid，Cryptotanshinone，TanshinoneⅡA in Shenhua Capsule，and thus provide theoretical basis for quality control of pharmaceu-tical preparations．METHODS：The Kromasil C18（250 mm× 4．6 mm，5 μm）was used，and the column temperature was maintained at 30℃．The UV detection wavelength was at 230 nm（Paeoniflorin，Glycyrrhizic Acid），270 nm（Liquiritin，Crypto-tanshinone，TanshinoneⅡA），and 330 nm（Chlorogenic acid，Safflomin A，Rosmarinic acid，Salvianolic acid B）．A gradient e-lution of acetonitri-0．5%phosphoric acid（per 1000 mL contai-ning 2．0 g Potassium Phosphate Monobasic）was adopted at the flow rate of 1．0 mL／min．The injection volume was 5 μL．RE-SULTS：The good resolution was achieved among the 9 active in-gredients．The linear ranges and RSDs of Chlorogenic acid，Saf-flomin A，Paeoniflorin，Salvianolic acid B，Glycyrrhizic Acid，Liquiritin，Rosmarinic acid，Cryptotanshinone，TanshinoneⅡA were 7．00～70．00 mg／L（r＝0．9999），40．00～400．00 mg／L（r＝0．9994），62．50～625．00 mg／L（r＝0．9998），13．00～130．00 mg／L（r＝0．9996），8．80～88．00 mg／L（r＝0．9994），50．00～500．00 mg／L（r＝0．9995），48．00～480．00 mg／L（r＝0．9995），5．00～50．00 mg／L（r＝0．9994）and 8．20～820．00 mg／L（r＝0．9994）respectively．The average recoveries（n＝6）were between 98．6%and 99．20%，and RSDs were be-tween 0．50%and 1．20%．The average amount of Chlorogenic acid，Safflomin A，Paeoniflorin，Salvianolic acid B，Glycyrrhizic Acid，Liquiritin，Rosmarinic acid，Cryptotanshinone，TanshinoneⅡA in 10 batches of preparation were 0．243，2．139，1．321，0．316，0．414，8．815，1．033，0．173，and 0．487 mg／capsule，with average RSD value being 0．80，0．65，0．57，1．55，1．79，0．10，0．16，1．19，and 0．79 respectively．CONCLUSION：The method is reliable，simple and accurate，and can be used as one of the quality evaluation methods of Shenhua Capsule．

Shenhua Capsule；HPLC；Liquiritin；Rosmarinic acid；Chlorogenic acid；Safflomin A；Paeoniflorin；TanshinoneⅡA

R286．0

A

2095-6894（2015）05-141-04

2015-04-24；接受日期：2015-05-13

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目重大科技難題攻關(guān)（2011KTZB03-01-02）

肖會敏．碩士，主管藥師．研究方向：中藥學(xué)物效基礎(chǔ)．Tel：029-84772165 E-mail：xhm_0908＠163．com

王四旺．E-mail：wangsiw＠fmmu．edu．cn