鄒淑君，許樹軍，付起風，徐 暘*

（黑龍江中醫(yī)藥大學a.藥學院；b.實驗中心，黑龍江哈爾濱150040）

三種黃酮清除自由基活性的研究*

鄒淑君a，許樹軍b，付起風b，徐 暘a*

（黑龍江中醫(yī)藥大學a.藥學院；b.實驗中心，黑龍江哈爾濱150040）

為比較黃酮2、3位單雙鍵不同及3'、4'鄰位取代基不同對清除自由基活性的影響。采用UV-Vis光譜法測定了木犀草素、香葉木素及橙皮素對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）、超氧陰離子自由基（·）的清除作用。結果顯示3種黃酮化合物對兩種自由基都有一定的清除作用，清除效果隨濃度的增大而增大。但對自由基清除能力表現(xiàn)為木犀草素遠強于香葉木素、香葉木素與橙皮素無顯著差別。說明具有B環(huán)3'、4'鄰二羥基結構的黃酮清除自由基的能力明顯強于具有B環(huán)3'羥基、4'甲氧基結構的黃酮；黃酮C環(huán)2、3位單雙鍵不同對自由基清除能力影響不顯著。

黃酮；木犀草素；香葉木素；橙皮素；自由基；清除

自由基是機體正常代謝的產(chǎn)物，過量的活性氧會引起細胞的氧化及病變，從而造成機體的疾病、衰老等。因此，保證體內(nèi)活性氧的含量處于正常水平是保證健康的重要前提。除了機體自身的調(diào)整，還可以通過攝入一些具有抗氧化性的物質(zhì)來清除體內(nèi)過多的活性氧，維持體內(nèi)氧化和抗氧化的平衡。黃酮類化合物就是這樣一類具有抗氧化活性的物質(zhì)。測定黃酮類化合物體外清除自由基的能力，并研究結構與清除效果的關系，能夠為黃酮類化合物在藥物、食品及添加劑方面的選擇和應用提供一定的理論支持。

黃酮因其結構中往往含有多個酚羥基及大的離域共軛性而顯示明顯的自由基清除活性，黃酮類化合物中的羥基數(shù)目、羥基的位置、C環(huán)的不同等結構差異都對自由基清除活性有明顯的影響[1]，是值得深入探索的問題。為此，本研究利用DPPH自由基體系、鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的超氧陰離子自由基體系，借助紫外-可見吸收光譜法進行測試，選取木犀草素、香葉木素及橙皮素這3種黃酮類化合物（結構見圖1），考察黃酮清除自由基能力的構效關系。

圖1 3種黃酮的結構式Fig.1 Structures of three flavonoids

1 實驗部分

1.1 主要試劑、儀器

木犀草素、香葉木素及橙皮素（均為98%）（西安小草科技有限公司）；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH日本東京化成株式會社）；三羥甲基氨基甲烷（Tris 99.8%上海博宏生物科技有限公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

PB-20型pH計（德國賽多利斯儀器有限公司）；SK250LH型超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）；XS105DU型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；移液槍（美國Labnet公司）；UV-1601型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃酮對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）的清除作用測定3種黃酮首先加少量甲醇溶解后，用去離子水定容配制成5.0×10-4mol·L-1的初始溶液。實驗均以去離子水為參比，于517nm下測定。根據(jù)預實驗效果，將5.0×10-4mol·L-1的橙皮素及香葉木素液按比例稀釋獲得4.0×10-4、3.0× 10-4、2.0×10-4、1.0×10-4、4.0×10-5及1.0×10-5mol· L-1的樣品溶液供本實驗用，將木犀草素溶液稀釋獲得3.0×10-4、2.0×10-4、1.0×10-4、7.5×10-5、5.0×10-5、2.5×10-5、1.0×10-5、7.5×10-6及5.0×10-6mol· L-1的樣品溶液供實驗用。

第一組試驗取3mL去離子水與3mL 6.5×10-5mol·L-1的DPPH·溶液混合搖勻，于40℃恒溫避光靜置30min后測定吸光度A0為0.2667；第二組試驗分別取3mL不同濃度的樣品溶液，并分別加入3mL 6.5×10-5mol·L-1的DPPH·溶液，搖勻后于40℃恒溫避光靜置30min后測定吸光度Ai；第三組試驗取3mL不同濃度樣品溶液（與第二組樣品對應）與3mL去離子水混勻后測吸光度

相同條件下，向10mL比色管加入pH值為8.2的Tris-HCl緩沖溶液5.0mL、濃度為4.0×10-4mol· L-1待測液分別為100、200、500、800、1000、1500、2000μL加去離子水定容至10mL，搖勻，做空白對照；另向10mL比色管加入pH值為8.2的Tris-HCl緩沖溶液5.0mL、同濃度的對應體積的待測液、及鄰苯三酚溶液0.3mL、最后加去離子水定容至10mL，迅速搖勻后測定吸光度，每30s記錄1次，直到反應啟動3min結束。經(jīng)計算處理獲取加樣品時鄰苯三酚自氧化速率νc[4，5]。

2 結果與討論

2.1 黃酮對DPPH自由基的清除作用

DPPH·溶液在517nm左右有特征吸收峰，當具有自由基清除能力的抗氧化劑存在時，由于抗氧化劑與DPPH·的單電子配對，繼而使其吸收逐漸消失，且其褪色程度與其接受的電子數(shù)成定量關系，因此可用紫外-可見分光光度法進行定量分析，樣品的抗氧化活性可以通過清除DPPH·的量來評價[6]。DPPH與抗氧化劑（AH）的反應如下式所示[7]：

DPPH·+AH→DPPH-H+A·

當有自由基清除劑存在時，DPPH·的單電子由于被配對，DPPH·濃度減小而使其顏色變淺，在517nm波長處的吸光度會減小。根據(jù)計算樣品溶液對DPPH·的清除率并作圖（A0為不加黃酮的DPPH的吸光度值,Aj為黃酮溶液的吸光度，Ai為加入黃酮后的DPPH溶液的吸光度值）。圖2即為3種黃酮類化合物對DPPH·的清除效果圖。

圖2 3種黃酮對DPPH·自由基的清除率Fig.2 Free radical scavenging rate of three kinds of flavonoids on DPPH·

由圖2可以看出，木犀草素對DPPH·有很強的清除能力，橙皮素和香葉木素對DPPH·也有較好的清除能力，隨著濃度的增加，清除率都呈上升趨勢，即在試驗濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)量-效關系。3種黃酮對DPPH·的半數(shù)清除率見表1。

表1 3種黃酮對DPPH·的半數(shù)清除率（Ec50）Tab.1 Ec50of Three kinds of flavonoids on DPPH·

黃酮類物質(zhì)的抗氧化作用一般與其分子結構中的羥基數(shù)目及位置等結構因素有關，根據(jù)測試結果可以看出，被測的3種黃酮類化合物依據(jù)Ec50得到的清除DPPH·的能力的強弱順序為：木樨草素遠強于橙皮素；橙皮素略強于香葉木素，但差異不明顯。相比之下，木犀草素在B環(huán)的3'和4'上的鄰位羥基使其具有很強的清除能力，香葉木素的3'和4'位上的鄰位羥基中的4'位羥基被甲氧基化，則對DPPH·的清除能力大大降低；C2~C3單雙鍵不同的香葉木素和橙皮素相比，二者沒有顯著差異。

2.2 黃酮對超氧陰離子自由基的清除作用

測試不加樣品的鄰苯三酚自氧化，初始記錄吸光度值為0.063，然后每30s記錄一次吸光度值，前3min的記錄值分別是：0.172、0.262、0.336、0.399、0.450、0.493。以時間為橫坐標，322nm處吸光度為縱坐標，利用OriginPro8.5軟件進行數(shù)據(jù)線性回歸計算處理得到其斜率即為鄰苯三酚自氧化速率ν0=0.00201s-1。

測試加樣品的鄰苯三酚自氧化，以初始記錄為起點，然后每30s記錄一次吸光度值，取前3min的記錄值，以時間為橫坐標，322nm處吸光度為縱坐標。利用OriginPro8.5進行處理得到加入不同濃度的樣品后的鄰苯三酚自氧化速率νc。按實驗用量計算測試時樣品濃度，根據(jù)清除率P=（[ν0-ν）c/ν0]× 100%計算，得各濃度下不同樣品對超氧陰離子自由基的清除率并作圖，圖2為3種黃酮對·自由基清除作用效果圖。

圖3 3種黃酮對·自由基的清除率Fig.3 Free radical scavenging rate of three kinds of flavonoids on

從圖3可以看出，3種黃酮對超氧陰離子自由基都具有顯著的清除能力，在測試濃度范圍內(nèi)，清除率也呈濃度依賴性。且相同濃度下木犀草素對超氧陰離子的清除率明顯高于其它兩種。表2是3種黃酮對·自由基的半數(shù)清除率數(shù)據(jù)。

表2 3種黃酮對·自由基的半數(shù)清除率（Ec5）0Tab.2 Ecof Three kinds of flavonoids on·50

表2 3種黃酮對·自由基的半數(shù)清除率（Ec5）0Tab.2 Ecof Three kinds of flavonoids on·50

Ec50（mol·L-1）橙皮素9.09×10-5香葉木素8.49×10-4木犀草素4.31×10-6

3 結論

通過對比實驗，證明木犀草素、香葉木素、橙皮素對DPPH·、·都具有一定的清除作用。且隨著濃度的增加，清除率呈上升趨勢，即呈現(xiàn)量-效關系。清除DPPH·和·的能力均顯示木犀草素明顯強于香葉木素及橙皮素；而香葉木素與橙皮素之間的差別不明顯。從構效關系來分析，本實驗研究的結果為：（1）C2~C3之間的單雙鍵對DPPH·、·自由基清除能力影響不顯著；（2）B環(huán)3'、4'位鄰位羥基是對清除DPPH·、·自由基有突出作用的特征結構，其中4'位羥基被甲氧基化后，則對自由基的清除能力顯著下降，這一點與文獻報導相一致[8]。

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圖4 PEW熱穩(wěn)定性Fig.4 Thermal stability of PEW

可以看出，當溫度達到220℃時仍然沒有失重，230℃恒溫30 min后失重僅有1.07%，達到266℃失重5.87%。說明通過水裂解制得的PEW有較高的熱穩(wěn)定性。

3 結論

（1）裂解溫度對產(chǎn)品的影響最大，其次是反應時間的影響。裂解溫度的升高和反應時間的延長都使得反應體系獲得了更高的能量，容易使PE大分子發(fā)生斷鏈從而得到低分子量PE，繼而使產(chǎn)品性能發(fā)生了較大的變化。

（2）PEW產(chǎn)品的相對粘均分子量、熔程表現(xiàn)規(guī)律一致，即相對粘均分子量和熔程隨裂解溫度增加、時間延長而減小。在裂解溫度為370℃，反應時間60min，溶劑加入量50%的條件下，得到白色粉末狀的PEW，產(chǎn)品質(zhì)量收率為91.93%，熔程在104~110℃，酸值為0.0143，粘均分子量為3426.4，且熱穩(wěn)定性較高，在220℃仍然沒有失重，266℃僅失重5.87%，符合工業(yè)生產(chǎn)要求。

參考文獻

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Study on free radical scavenging activity of three kinds of flavonoids*

ZOU Shu-jun，XU Shu-jun，F(xiàn)U Qi-feng，XU Yang*
（a.Medicine School;b.Expenimental Center,Heilongjiang Univenity of Chinese Medicine，Harbin 150040，China）

In order to compare the free radical scavenging ability of hesperidin，diosmetin and luteolin,the scavenging reaction to 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical（DPPH·）and superoxide free radical（·）of hesperidin，diosmetin and luteolin were tested by UV-Vis spectrophotometry.The result show that three kinds of flavonoids are able to scavenge the two kinds of free radicals,and the scavenying capacity show a concentrationdependent manner.The scavenying activity of DPPH·and·of luteolin is significantly stronger than that of hesperidin and diosmetin．And the scavenying activity difference between hesperidin and diosmetin is not obvious．In flavonoids，B ring 3、4-two hydroxy is an important structural characteristic of free radical scavenging.Single or double bond between C2-C3 didn't has significant effect on free radical scavenging capacity.

flavonoids；diosmetin；luteolin；hesperetin；free radical；scavenging

TS201

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20150504

2015-03-12

黑龍江省教育廳資助項目（No.12531648）；黑龍江中醫(yī)藥大學?；鹂蒲姓n題（201103）

鄒淑君（1974-），女,副教授，黑龍江中醫(yī)藥大學在站博士后工作人員，研究方向:藥物分析。

徐暘：女,副教授，研究方向:藥物分析。