麻丹丹, 吳補(bǔ)領(lǐng)

(廣東 廣州 510515: 1. 南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院; 2. 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院口腔科)

淫羊藿苷對人牙髓干細(xì)胞增殖及骨向分化的作用

麻丹丹1,2, 吳補(bǔ)領(lǐng)1,2

(廣東 廣州 510515: 1. 南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院; 2. 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院口腔科)

目的: 探討淫羊藿苷對人牙髓干細(xì)胞(hDPSCs)增殖及骨向分化的影響。方法：MTT檢測10-2～10-10mol/L淫羊藿苷對hDPSCs增殖能力的影響，并篩選出最佳濃度(10-5mol/L)；然后以10-5mol/L的淫羊藿苷作用于hDPSCs，并對其進(jìn)行礦化誘導(dǎo)。誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d后，用Real- time PCR檢測hDPSCs中ALP、DMP- 1、DSPP各礦化相關(guān)基因的表達(dá)水平；茜素紅染色觀察hDPSCs礦化結(jié)節(jié)的能力。結(jié)果：與對照組相比，10-2～10-3mol/L 的淫羊藿苷對hDPSCs增殖有一定的抑制作用(P<0.05)，而10-5mol/L和10-6mol/L的淫羊藿苷均能明顯促進(jìn)hDPSCs的增殖(P<0.05)，其中以10-5mol/L最好；Real- time PCR檢測及茜素紅染色觀察結(jié)果顯示，10-5mol/L淫羊藿苷可明顯促進(jìn)hDPSCs中各礦化相關(guān)基因的表達(dá)和礦化結(jié)節(jié)的形成。結(jié)論: 一定濃度范圍的淫羊藿苷可促進(jìn)hDPSCs的增殖和骨向分化。

淫羊藿苷; 牙髓干細(xì)胞; 增殖; 骨向分化

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.09.003

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(9):524]

干細(xì)胞礦化是形成組織工程牙齒的重要環(huán)節(jié)，近年來隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，參與牙齒礦化的干細(xì)胞已逐一被發(fā)現(xiàn)并認(rèn)識，牙髓干細(xì)胞就是形成牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的重要種子細(xì)胞。Gronthos等(2000)首次利用酶消化法成功分離、培養(yǎng)出了牙髓干細(xì)胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)，并發(fā)現(xiàn)DPSCs較骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有更高的克隆形成能力和增殖率，在體外誘導(dǎo)條件下，其不僅能形成分散而高密度的鈣化結(jié)節(jié)，同時(shí)還能分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞；將集落生長的DPSCs移植到免疫耐受小鼠體內(nèi)，能形成典型的牙本質(zhì)/牙髓復(fù)合體樣結(jié)構(gòu)[1]。目前的研究已證實(shí)，DPSCs可向骨組織、軟骨組織、神經(jīng)組織、脂肪組織、黑素細(xì)胞、角膜組織等方向分化[2-7]。在組織工程牙齒形成過程中，種子細(xì)胞、生物支架材料、生長因子是3個(gè)至關(guān)重要的因素。因此，在體外條件下要想使牙髓干細(xì)胞分化為牙本質(zhì)細(xì)胞并形成牙本質(zhì)乃至牙本質(zhì)/牙髓復(fù)合體，則需要有與體內(nèi)相似的生長因子微環(huán)境和三維生物學(xué)功能支架材料。特別是尋找有效的生長因子微環(huán)境以促進(jìn)hDPSCs增殖和分化尤為重要，并已成為研究的熱點(diǎn)。

淫羊藿苷是從淫羊藿的皂苷類物質(zhì)中提取的單體，也是淫羊藿的主要和有效的藥理成分，并可在臨床上用于治療骨質(zhì)疏松。體外研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的骨向分化[8]，但其對牙髓干細(xì)胞的骨向分化是否也有促進(jìn)作用，目前尚未見相關(guān)研究報(bào)道。本研究旨在探討淫羊藿苷對hDPSCs的增殖及骨向分化是否存在促進(jìn)作用，以期為牙髓組織修復(fù)及牙組織再生工程研究中尋找新的生長因子提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

淫羊藿苷(北京中國藥品生物制品檢定所)；低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone，美國)；青/鏈霉素、胰蛋白酶(Gibco,美國)；I型膠原酶、dispase、MTT粉末(Sigma, 美國)；Trizol、Prime-Script RT reagent Kit、SYBR Premix DimerEraser kit (Takara, 美國)；超凈工作臺(Esco Airstream，新加坡)；酶聯(lián)免疫檢測儀(Tecan，瑞典)；CO2培養(yǎng)箱、離心機(jī)(Beckman Coulter，美國)；Stratagene MX3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)儀(Agilent，美國)。

1.2 hDPSCs的分離、培養(yǎng)和純化

于我院頜面外科門診選取18～25歲志愿者(知情同意)因正畸治療或阻生拔除的完整、健康第三磨牙，超凈工作臺內(nèi)劈開牙齒，無菌條件下取出牙髓并剪去其根尖端2 mm后，置于PBS緩沖液中反復(fù)漂洗至少3次。用眼科剪將牙髓組織剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊后，參照文獻(xiàn)[9]報(bào)道的改良組織塊酶消化法分離培養(yǎng)hDPSCs：首先將牙髓組織塊置于4 g/L膠原酶消化液中，37 ℃消化10 min使組織松散后，800 r/min離心10 min，棄上清；加入少量DMEM培養(yǎng)液，輕輕吹打使細(xì)胞懸液與松散組織混勻后，將其轉(zhuǎn)移至6孔板內(nèi)鋪平，并用蓋玻片壓于組織之上；然后補(bǔ)充DMEM培養(yǎng)液體至適量，并置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每隔3 d換液1次，待細(xì)胞生長匯合至80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。最后采用有限稀釋法純化hDPSCs，并將改良組織塊酶消化法分離培養(yǎng)的hDPSCs以1～2/孔的密度接種96孔板，常規(guī)培養(yǎng)7～14 d, 至出現(xiàn)細(xì)胞克隆后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.3 淫羊藿苷促進(jìn)hDPSCs增殖的最佳濃度篩選

取第3代hDPSCs以4×103/孔的密度接種于96孔板，常規(guī)條件(37 ℃、50 mL/L CO2)下培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，棄原培養(yǎng)液，并將細(xì)胞隨機(jī)分為10組(1個(gè)對照組和9個(gè)實(shí)驗(yàn)組)，每組復(fù)4孔。其中對照組加入不含淫羊藿苷的DMEM培養(yǎng)液；9個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別加入含淫羊藿苷終濃度為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol/L的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后分別于每孔中各加入20 μL MTT(5 mg/mL)，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h；然后棄去孔內(nèi)上清，并于每孔中各加入200 μL DMSO，搖床振蕩10 min至結(jié)晶充分溶解后，用酶聯(lián)免疫檢測儀測量各孔490 nm 波長的吸光值(OD)。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.4 10-5mol/L的淫羊藿苷對hDPSCs增殖能力影響的觀察

取第3代人hDPSCs，以4×104/孔的密度接種于96孔板中，常規(guī)條件下培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，棄原培養(yǎng)液，并將細(xì)胞隨機(jī)分為2組(對照組和實(shí)驗(yàn)組)。其中對照組加入不含淫羊藿苷的DMEM培養(yǎng)液；實(shí)驗(yàn)組根據(jù)1.3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果加入含淫羊藿苷終濃度為10-5mol/L的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后1、2、3、4、5、6、7 d各時(shí)間點(diǎn)取各組細(xì)胞(每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各4孔)，并于每孔中各加入20 μL MTT(5 mg/mL)繼續(xù)孵育4 h；然后棄去孔內(nèi)上清，并于每孔中各加入200 μL DMSO，搖床振蕩10 min至結(jié)晶充分溶解后，用酶聯(lián)免疫檢測儀測量490 nm波長處的吸光值(OD)。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.5 10-5mol/L淫羊藿苷對hDPSCs骨向分化能力影響的觀察

1.5.1 分組處理和礦化誘導(dǎo)

取第3代對數(shù)生長期hDPSCs接種于35 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿，并將其隨機(jī)分為2組(實(shí)驗(yàn)組和對照組)。其中實(shí)驗(yàn)組加入含淫羊藿苷終濃度為10-5mol/L的DMEM培養(yǎng)基；對照組加入正常DMEM培養(yǎng)基，一并置于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；待細(xì)胞生長密度達(dá)70%左右時(shí)，分別換用礦化誘導(dǎo)液(含10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、5 mg/mL維生素C磷酸酯、10-5mol/L地塞米松)的DMEM進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。每隔3 d換液1次，連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d。

1.5.2 Realtime-PCR檢測礦化相關(guān)基因的表達(dá)

取上述礦化誘導(dǎo)21 d的各組hDPSCs，分別經(jīng)Trizol裂解后提取細(xì)胞總RNA，并運(yùn)用Prime-Script RT reagent Kit將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后以cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參照，用Stratagene MX3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)儀分別檢測各組ALP、DMP-1、DSPP各礦化相關(guān)基因的表達(dá)。PCR反應(yīng)體系及參數(shù)均嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書，所用引物由上海生工生物公司合成，具體引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.5.3 茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況

取上述礦化誘導(dǎo)21 d的各組hDPSCs，用40 g/L多聚甲醛室溫下固定10 min，并經(jīng)PBS沖洗2遍后，用20 g/L 茜素紅染色10 min；PBS沖洗5次，倒置顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況并拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿苷促hDPSCs增殖的最佳濃度篩選結(jié)果

MTT法分別檢測10-2～10-10mol/L 9個(gè)濃度的淫羊藿苷對hDPSCs增殖能力的影響，結(jié)果顯示：10-2、10-3mol/L兩個(gè)濃度組的OD值均明顯低于對照組(P<0.05)，說明這兩個(gè)濃度的淫羊藿苷對hDPSCs的增殖能力均有一定抑制作用；10-5、10-6mol/L兩個(gè)濃度組的OD值均明顯高于對照組(P<0.05)，說明這兩個(gè)濃度的淫羊藿苷對hDPSCs的增殖能力均有一定促進(jìn)作用，其中以10-5mol/L組最好，故以該濃度的淫羊藿苷用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；而其余各濃度組的OD值與對照組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

*與對照組相比P<0.05

2.2 10-5mol/L淫羊藿苷對hDPSCs增殖能力的影響

以10-5mol/L的淫羊藿苷分別作用于hDPSCs 1～7 d，MTT檢測結(jié)果顯示：淫羊藿苷作用組(實(shí)驗(yàn)組)和對照組的OD值均隨著培養(yǎng)時(shí)間延長而逐漸升高，其中以實(shí)驗(yàn)組升高最明顯，從第3天開始其各時(shí)間點(diǎn)的OD值均明顯高于對照組(P<0.05)，說明10-5mol/L濃度的淫羊藿苷在7 d觀察期內(nèi)對hDPSCs增殖具有促進(jìn)作用(圖2)。

圖2 10-5 mol/L淫羊藿苷對hDPSCs增殖

2.3 10-5mol/L淫羊藿苷對hDPSCs骨向分化能力的影響

10-5mol/L淫羊藿苷作用組(實(shí)驗(yàn)組)和對照組hDPSCs經(jīng)礦化誘導(dǎo)21 d后，Real- time PCR顯示，實(shí)驗(yàn)組hDPSCs中各礦化相關(guān)基因(ALP、DSPP、DMP- 1)的表達(dá)水平均明顯高于對照組(P<0.05)(圖3)。茜素紅染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組hDPSCs所形成的礦化結(jié)節(jié)較對照組更大、更致密(圖4)。以上結(jié)果說明，10-5mol/L的淫羊藿苷對hDPSCs的骨向分化具有促進(jìn)作用。

圖3 10-5 mol/L淫羊藿苷對hDPSCs中礦化相關(guān)基因(ALP、DMP- 1、DSPP)表達(dá)的影響(*P<0.05)

實(shí)驗(yàn)組 對照組

圖4 10-5mol/L淫羊藿苷對hDPSCs形成礦化結(jié)節(jié)的影響(×4)

3 討論

人體中的硬組織，如牙齒、骨骼，都是生物礦化過程的產(chǎn)物。在體內(nèi)生理?xiàng)l件下，通過細(xì)胞的參與、調(diào)節(jié)，以及各種生物活性因子的有序作用，即可生成具有特殊形態(tài)和功能的硬組織(礦化組織)。而在體外利用物理或化學(xué)的方法，只能合成類似的礦化物，且需要相當(dāng)苛刻的條件。因此，在生理?xiàng)l件下的礦化過程中，細(xì)胞和各種生物活性因子的調(diào)控起著決定性作用。但如何在體外條件下重現(xiàn)細(xì)胞及各種生物活性因子的調(diào)控作用，一直是生物礦化研究領(lǐng)域密切關(guān)注并亟待解決的問題。自Gronthos等[1](2000)發(fā)現(xiàn)牙髓干細(xì)胞以來，學(xué)者對其展開了深入研究，并以牙髓干細(xì)胞為模型尋找促進(jìn)礦化的方法，探討礦化機(jī)制。細(xì)胞因子是牙組織工程的重要組成部分，尋求有效廉價(jià)的細(xì)胞生長因子對實(shí)現(xiàn)牙組織再生尤為關(guān)鍵。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，一定濃度范圍的淫羊藿苷對hDPSCs的增殖具有促進(jìn)作用，與文獻(xiàn)報(bào)道的淫羊藿苷對其他細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用相符合。Pei等發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷對人牙周膜細(xì)胞的增殖作用存在濃度依賴性和時(shí)間依賴性[10]。Cao等發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷可明顯增加MC3T3- E1細(xì)胞的S期比例，并使其 G1期的比例降低，提示淫羊藿苷可以促進(jìn)該細(xì)胞的增殖[11]。Fan等發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷在10-9～10-6mol/L濃度范圍內(nèi)可以促進(jìn)BMMSCs的增殖，當(dāng)其濃度超過10-5mol/L時(shí)則會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，淫羊藿苷的濃度為10-5mol/L 和10-6mol/L 時(shí)，對hDPSCs的增殖均有促進(jìn)作用，其中10-5mol/L尤為明顯，說明不同細(xì)胞對淫羊藿苷的耐受性有差異。

ALP是參與骨、牙齒等硬組織形成、代謝和再生的一種重要物質(zhì)，其在硬組織形成過程中促進(jìn)鈣化的作用較為肯定；一般認(rèn)為，ALP主要是通過提供磷酸根和去除鈣化抑制物而促進(jìn)鈣化進(jìn)行的。有研究發(fā)現(xiàn)，ALP在牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過程中會明顯升高，誘導(dǎo)后的牙髓細(xì)胞中ALP的表達(dá)量與成骨細(xì)胞相當(dāng)，且明顯高于非礦化組織；提示， ALP可以作為監(jiān)測hDPSCs成牙本質(zhì)向分化的一個(gè)標(biāo)志[13]。DSPP和DMP- 1目前被認(rèn)為是hDPSCs成牙本質(zhì)向分化時(shí)的相對特異性標(biāo)志物，其不僅參與調(diào)控牙本質(zhì)的發(fā)育，同時(shí)還能誘導(dǎo)牙本質(zhì)中礦物晶體成核，并調(diào)控晶體生長的形態(tài)、速度和尺寸。本結(jié)果顯示，10-5mol/L的淫羊藿苷可上調(diào)hDPSCs中礦化相關(guān)基因(ALP、DSPP、DMP- 1)的表達(dá)，說明一定濃度的淫羊藿苷可明顯促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的成牙本質(zhì)向分化。Wu等發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷可以明顯提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)的骨向分化能力，淫羊藿苷作用后的BMMSCs中堿性磷酸酶活性，以及I型膠原、骨鈣素、骨橋素等礦化相關(guān)基因的表達(dá)水平均升高；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷是通過影響ERK、p38和JNK MAPK等分子通路而影響B(tài)MMSCs礦化能力的[14]。Luo等發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷可以恢復(fù)切除卵巢大鼠的BMMSCs的礦化能力，并能提高雌激素相關(guān)通路因子如雌激素受體α、孕酮受體trefoil 因子等的表達(dá)[15]。該結(jié)果提示，淫羊藿苷可能通過調(diào)控雌激素通路而恢復(fù)切除卵巢大鼠的BMMSCs的礦化能力。Sun等從類固醇相關(guān)性股骨頭壞死病人的骨頭中分離出BMMSCs，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，該BMMSCs的增殖、骨向分化能力均明顯減低，而氧自由基水平及脂肪向分化能力均增加；經(jīng)淫羊藿苷作用后，不僅可提高該BMMSCs的骨向分化能力，同時(shí)還能有效減低其氧自由基的水平[16]。Pei等報(bào)道，淫羊藿苷可以提高人牙周膜細(xì)胞中骨橋素、核心結(jié)合因子α1及骨鈣素的表達(dá)水平；下調(diào)細(xì)胞核因子κB受體活化因子配基的含量[10]。本實(shí)驗(yàn)通過茜素紅染色觀察發(fā)現(xiàn)，10-5mol/L的淫羊藿苷可促進(jìn)牙髓干細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)，進(jìn)一步證實(shí)了淫羊藿苷對牙髓干細(xì)胞成骨向分化的促進(jìn)作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了淫羊藿苷在10-2～10-3mol/L濃度范圍內(nèi)對hDPSCs的增殖能力有一定的抑制作用，而當(dāng)濃度為10-5～10-6mol/L時(shí)則對牙髓干細(xì)胞的增殖能力具有一定的促進(jìn)作用，并能促進(jìn)牙髓干細(xì)胞表達(dá)成骨相關(guān)基因(ALP、DMP-1、DSPP)及形成礦化結(jié)節(jié)的能力，但具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

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The effect of icariin on the proliferation and osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells

MA Dan- dan*, WU Bu- ling

(*SchoolofStomatology,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

AIM: To explore the potential role of icariin in the regulation of proliferation and osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells (hDPSCs). METHODS: hDPSCs were treated by icariin at 10-2mol/L～10-10mol/L respectively. MTT assay was employed to evaluate the proliferative effect of icariin on hDPSCs. Real time-PCR and Alizarin Red S were performed to examine the impact of icariin on osteogenic differentiation of hDPSCs. RESULTS: 10-2mol/L～10-3mol/L icariin inhibited the proliferation of hDPSCs. 10-5mol/L icariin promoted the proliferation of hDPSCs. In addition, 10-5mol/L icariin could up-regulate osteogenic differentiation related genes and could promote mineralized nodule formation. CONCLUSION: Icariin can enhance proliferation and osteogenic differentiation of hDPSCs at a certain concentration range.

icariin; dental pulp stem cells; proliferation; osteogenic differentiation

2015-05-19

國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(81400495)

麻丹丹(1982-)，女，漢族，黑龍江人。博士，醫(yī)師

吳補(bǔ)領(lǐng)，E-mail: bulingwu@aliyun.com.cn

R780.2

A

1005-2593(2015)09-0524-05