趙思遠(yuǎn)，盧士玲

(石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子，832000)

生物胺(biogenic amines，BA)是一類(lèi)含有雜環(huán)結(jié)構(gòu)、芳香族和脂肪族有機(jī)物，廣泛存在于食品和生物體中，尤其在發(fā)酵肉制品中。主要分為單胺、二胺和多胺。適量的生物胺對(duì)人體有一定的調(diào)節(jié)作用，如調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、促進(jìn)代謝、控制血壓、清除自由基等［1］。而過(guò)量的生物胺則會(huì)給人體帶來(lái)一些不良影響，如引起頭暈、心悸、血壓改變、呼吸困難等應(yīng)激反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)對(duì)神經(jīng)和心血管系統(tǒng)造成損傷，引起腦出血，甚至死亡［2］。還有一些生物胺，如腐胺、尸胺等能夠與亞硝酸鹽反應(yīng)生成亞硝胺等致癌物質(zhì)［3］。

生物胺氧化酶可催化生物胺發(fā)生脫氫反應(yīng)，形成過(guò)氧化氫、氨和醛，以減少生物胺在生物體中的含量，從而降低毒害作用。如色胺生成吲哚乙醛，組胺生成咪唑乙醛，苯乙胺生成對(duì)羥基苯乙醛等，酪胺生成苯乙醛。反應(yīng)由單胺氧化酶介導(dǎo)，該酶不論在微生物或者哺乳動(dòng)物體內(nèi)均廣泛存在，起到代謝生物胺，維持機(jī)體生物胺處于低生理濃度的生理功能［4］。

雙水相萃取是利用溶質(zhì)在兩水相之間分配系數(shù)的不同來(lái)進(jìn)行萃取的一種方法，該體系具有含水量高，萃取環(huán)境和操作條件溫和，不易使蛋白質(zhì)在萃取過(guò)程中失活，易于按比例放大和進(jìn)行連續(xù)性操作等優(yōu)點(diǎn)［5］，通過(guò)調(diào)整雙水相系統(tǒng)中一系列參數(shù)就可選擇性地萃取目標(biāo)蛋白酶［6］。因此，近些年，采用雙水相萃取技術(shù)提取酶、抗生素、氨基酸天然產(chǎn)物等小分子物質(zhì)日益受到關(guān)注［7－8］，對(duì)于酶的萃取有很好的具有良好的應(yīng)用潛力［9］。

鼠李糖乳桿菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，可產(chǎn)生生物胺氧化酶［10］。本實(shí)驗(yàn)采用聚乙二醇/硫酸銨雙水相體系萃取鼠李糖乳桿菌在培養(yǎng)過(guò)程產(chǎn)生的生物胺氧化酶。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus GG，LGG)，石河子大學(xué)食品學(xué)院畜產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試劑與儀器

聚乙二醇400、聚乙二醇6000，天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司;聚乙二醇2000，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;(NH4)2SO4，天津永晟精細(xì)化工有限公司;MRS培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;考馬斯亮藍(lán)G-250(分析純)，上海化學(xué)試劑供應(yīng)站;牛血清蛋白，美國(guó)BIOSHARP公司。

立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠;DNP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;美國(guó)Sonics＆materials VCX500超聲波細(xì)胞破碎儀;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，力康發(fā)展有限公司;日本島津紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)UVmini－1240。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 生物胺氧化酶(粗酶)的提取

選取活性較好的鼠李糖乳桿菌，在MRS液體培養(yǎng)基中活化2次。用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)對(duì)鼠李糖乳桿菌進(jìn)行破碎，在冰浴中進(jìn)行，500 W，破碎3 s，間隔2 s，破碎10 min。破碎后，將其置于冷凍離心機(jī)中，4℃，7 500 r/min 離心15 min。

1.3.2 雙水相相圖的繪制［11］

分別配制40%的PEG溶液和40%的(NH4)2SO4溶液。稱(chēng)取一定質(zhì)量的PEG溶液(P)置于三角瓶中，加入(NH4)2SO4，直至開(kāi)始出現(xiàn)渾濁為止，記錄加入的(NH4)2SO4質(zhì)量(Q)。再向體系中加入水，直至渾濁消失，記錄水的質(zhì)量(W)。再次向體系中加入(NH4)2SO4和水，溶液再次變?yōu)闇啙徇M(jìn)而又變?yōu)槌吻?。如此循環(huán)，形成不同的成相點(diǎn)。計(jì)算成相點(diǎn)繪制PEG和(NH4)2SO4形成的雙水相體系的相圖:

X/%=P/(P+Q+W)×100

Y/%=Q/(P+Q+W)×100

X，在某成單相點(diǎn)時(shí)硫酸按占總量的質(zhì)量百分?jǐn)?shù);Y，在某單相點(diǎn)時(shí)，PEG占總量的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。

以X為橫坐標(biāo)，Y為縱坐標(biāo)，X對(duì)Y作圖得到PEG/硫酸銨雙水相系統(tǒng)相圖(圖1)，相圖中曲線以下為單相區(qū)(含曲線)，曲線以上為雙相區(qū)。

1.3.3 雙水相萃取生物胺氧化酶［12］

稱(chēng)取一定量聚乙二醇、(NH4)2SO4和蒸餾水于小燒杯中，加入2 mL的粗酶液，使雙水相體系總質(zhì)量為10.00 g，充分振蕩使成相物質(zhì)溶解，并調(diào)節(jié)體系pH，靜置10 min，離心10 min，2 000 r/min，使兩相達(dá)到相分離［13］。稱(chēng)取上相和下相的體積。由此可得到:

相比:R=Vt/Vb

分配系數(shù):K=Ut/Ub

回收率:Y=R/(1+RK)

Vt、Vb分別為雙水相體系中上相與下相的體積，Ut、Ub為上相與下相的酶活。

1.3.4 酶活性的測(cè)定［14－15］

取2 mL PBS(0.1 mol/L，pH 7.0)、0.1 mL 過(guò)氧化物酶溶液(1 mg/mL)及0.2 mL PAO提取液?；旌弦河?0℃水浴預(yù)保溫2 min后分別加入0.1 mL生物胺混合液(20 mmol/L)起動(dòng)反應(yīng)，并用分光光度計(jì)連續(xù)測(cè)定波長(zhǎng)430 nm處光密度值的變化。

生物胺氧化酶酶活力定義:以混合生物胺作為底物，1 min引起吸光值變化0.001所需要的酶量，用0.001ΔOD430/min 為1 個(gè)酶活力單位(U)［16］。

1.3.5 蛋白含量的測(cè)定［17］

采用Bradford Protein Assay(考馬斯亮藍(lán)G-250)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=8.495 2x+0.016 6，單位:mg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚乙二醇/硫酸銨雙水相體系相圖

圖1為一定濃度不同分子質(zhì)量的聚乙二醇(PEG400、PEG2000、PEG6000)與 一 定 濃 度 的(NH4)2SO4所形成的雙水相體系相圖。根據(jù)該圖可以確定聚乙二醇/硫酸銨雙水相體系成相的基本情況，從而確定實(shí)驗(yàn)操作的基本條件，當(dāng) PEG和(NH4)2SO4分別高于某一濃度時(shí)(位于圖1中雙結(jié)線的上方)才能分相形成雙水相系統(tǒng)。當(dāng)(NH4)2SO4的濃度一定時(shí)，隨著PEG分子質(zhì)量的增大，所需PEG的濃度越低，越容易與(NH4)2SO4形成雙水相體系。

圖1 不同分子質(zhì)量的聚乙二醇與硫酸按的雙水相相圖Fig.1 Phase diagram of different kind of molecular mass PEG/(NH4)2SO4in aqueous two-phase system

2.2 不同分子質(zhì)量的PEG對(duì)生物胺氧化酶萃取的影響

選擇同一濃度不同分子質(zhì)量的PEG與同一濃度的(NH4)2SO4配制雙水相體系，并對(duì)相同體積的生物胺氧化酶粗酶液進(jìn)行萃取。選擇分子質(zhì)量為2 000的PEG，生物胺氧化酶在上相的酶活最高，其比酶活也較高。

2.3 不同濃度的PEG對(duì)萃取的影響

選用同一濃度的(NH4)2SO4與不同濃度的PEG2000配制雙水相體系，并對(duì)生物胺氧化酶粗酶液進(jìn)行萃取。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1。選擇濃度需遠(yuǎn)離雙水相相圖的雙結(jié)線，否則不利于成相，但濃度若高于40%則可能導(dǎo)致酶失去活性［7］。

表1 PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)生物胺氧化酶分配行為的影響Table 1 Effect of PEG concentration on partitioning behaviour of biogenic amine oxidase

PEG在低濃度時(shí)對(duì)酶活性有一定的促進(jìn)作用，隨著濃度的增大對(duì)酶活性的抑制作用增大。由數(shù)據(jù)可知，隨著PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，其萃取萃取率、酶的分配系數(shù)以及純化倍數(shù)均有增加。但PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大，其黏度越大，增強(qiáng)了溶質(zhì)在相間和相內(nèi)傳遞的阻力，使酶不易進(jìn)入上相，分配系數(shù)降低，不易選擇過(guò)高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的 PEG。因此，選擇 25%的PEG2000最為合適。

2.4 不同濃度的(NH4)2SO4對(duì)萃取的影響

選用不同濃度的(NH4)2SO4與同濃度的PEG2000配制雙水相體系，并對(duì)生物胺氧化酶粗酶液進(jìn)行萃取。無(wú)機(jī)鹽的鹽析作用是雙水相成相的主要原因之一，增大無(wú)機(jī)鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，無(wú)機(jī)鹽的鹽析作用加強(qiáng)，酶更趨向分配于上相，但過(guò)多的無(wú)機(jī)鹽對(duì)酶的活性影響很大，所以無(wú)機(jī)鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不易太大。由表2可以看出選擇10%的(NH4)2SO4對(duì)生物胺氧化酶進(jìn)行萃取最為合適，萃取率達(dá)到93.4%。當(dāng)(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于8%成相困難，隨著(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，萃取率和純化倍數(shù)均有增加，但當(dāng)(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到14%時(shí)，體系中開(kāi)始有少量晶體析出，使得部分酶吸附在相界面處，分配系數(shù)下降，純化倍數(shù)降低。

表2 (NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)生物胺氧化酶分配行為的影響Table 2 Effect of(NH2)SO4concentration on partitioning behaviour of biogenic amine oxidase

2.5 pH值對(duì)萃取的影響

pH值可以改變蛋白質(zhì)表面氨基酸殘基電荷的種類(lèi)和多少，從而影響蛋白質(zhì)與體系的氫鍵和靜電作用，改變系統(tǒng)上下兩相的電位差，導(dǎo)致蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)改變進(jìn)而影響酶在雙水相中的分配行為。體系的pH值與蛋白質(zhì)的pI相差越大，蛋白質(zhì)在兩相中的分配越不平衡。需要將pH控制在生物胺氧化酶穩(wěn)定的范圍內(nèi)，本實(shí)驗(yàn)中的生物胺氧化酶為混合酶，pI約為7.0～7.4。由表3可以看出，對(duì)不同pH值的雙水相體系進(jìn)行萃取實(shí)驗(yàn)，當(dāng)pH值為7.5時(shí)，得到最大萃取率，分配系數(shù)K與純化倍數(shù)P也均高于其他pH值的PEG/硫酸銨雙水相體系。

表3 pH值對(duì)生物胺氧化酶分配行為的影響Table 3 Effect of pH value on partitioning behaviour of biogenic amine oxidase

2.6 溫度對(duì)萃取的影響

由表4可以看出，本實(shí)驗(yàn)中，溫度對(duì)萃取的影響并不明顯，綜合萃取率、分配系數(shù)和純化倍數(shù)3個(gè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，選擇30℃為最佳萃取溫度。

表4 溫度對(duì)生物胺氧化酶分配行為的影響Table 4 Effect of temperature on partitioning behaviour of biogenic amine oxidase

2.7 響應(yīng)面結(jié)果分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取4因素3水平用Box-Behnken法進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析。4因素分別為:PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)、pH值(C)、溫度(D)，分別選取3水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如表5。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表6，圖2和圖3為3D響應(yīng)面圖。

表5 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素水平表Table 5 Factors and levels of Box-Behnken Design

對(duì)萃取率進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果的回歸分析。模型P=0.000 1＜0.05，說(shuō)明模型擬合程度極高，其中AD＞AB＞AC＞BC＞CD＞BD，溫度與PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的交互作用最強(qiáng)，而溫度與硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及pH的交互影響則最弱。綜合4個(gè)因素，溫度對(duì)萃取率影響顯著，其次是pH值。經(jīng)數(shù)據(jù)分析，其決定系數(shù)R2=0.979 1，說(shuō)明該方程與實(shí)際情況擬合良好，較好地反映了生物胺氧化酶的提取率與PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值和溫度之間的關(guān)系。圖3為萃取率的響應(yīng)面分析圖。經(jīng)回歸擬合后，試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值Y(萃取率)的影響可用以下回歸方程表示:

Y=－1 090.510 00+7.086 67A+19.483 33B+227.533 33C+9.859 33D+0.125 00AB－0.120 00AC－0.020 000AD－0.100 000BC－0.050 000BD+0.010 00CD－0.132 40A2－1.019 38B2－15.010 00C2－0.146 10D2

表6 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 6 Arrangement and results of Box-Behnken Design

模型P=0.000 1＜0.05，說(shuō)明模型擬合程度極高，其中AC、AD＞BD＞AB＞BC＞CD，說(shuō)明PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)與pH值以及溫度交互作用最強(qiáng)，而pH值與溫度交互作用最弱。綜合4個(gè)因素，PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)和溫度對(duì)純化倍數(shù)影響顯著，其次是(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH值。決定系數(shù)R2=0.994 2，說(shuō)明該方程與實(shí)際情況擬合極好，較好地反映了生物胺氧化酶的純化倍數(shù)與PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值和溫度之間的關(guān)系。圖4為萃取率的響應(yīng)面分析圖。經(jīng)回歸擬合后，試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值P(純化倍數(shù))的影響可用以下回歸方程表示:

P=－138.447 25+2.671 33A+3.225 42B+22.098 33C+0.620 27D－0.018 500AB+0.156 00AC+9.200 00E－003AD－0.050 000BC－0.010 500BD+2.000 00E－003CD－0.078 240A2－0.108 50B2－1.711 00C2－0.012 910D2

圖2 萃取率(Y)的響應(yīng)面分析Fig.2 Response surface analysis on Y

圖3 純化倍數(shù)(P)的響應(yīng)面分析Fig.3 Response surface analysis on P

最大萃取率的實(shí)驗(yàn)條件為(條件1):質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的PEG2000、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的(NH4)2SO4、pH值為7.5、溫度為30℃;得到最大純化倍數(shù)的實(shí)驗(yàn)條件為(條件2):質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的PEG2000、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的(NH4)2SO4、pH值為7.5、25℃。對(duì)2種實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以條件1進(jìn)行萃取得到萃取率為96.5%，純化倍數(shù)為2.38;以條件2進(jìn)行萃取得到萃取率為95.2%，純化倍數(shù)為2.36。因此，選擇條件1為最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件。

3 結(jié)論

經(jīng)過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析，用聚乙二醇/硫酸銨雙水相體系對(duì)生物胺氧化酶進(jìn)行萃取時(shí)，結(jié)果較為理想，該實(shí)驗(yàn)萃取條件與其他氧化酶及蛋白在同一范圍內(nèi)［7－8，11－13，17］，因此也同樣具有放大潛能。

聚乙二醇的分子質(zhì)量越大越容易分相，但由于分子質(zhì)量增大同時(shí)會(huì)增大PEG的濃黏度，導(dǎo)致分相時(shí)間增長(zhǎng)，導(dǎo)致生物胺氧化酶難以進(jìn)入上相;PEG的濃度增大也同樣增加了PEG相的黏度，延緩分相，降低生物胺氧化酶的分配系數(shù)和純化倍數(shù);(NH4)2SO4容易結(jié)晶析出，吸附部分生物胺氧化酶于分相界面處;pH值不能與生物胺氧化酶的等電點(diǎn)pI相差過(guò)大，否則影響酶的萃取;溫度會(huì)影響 PEG和(NH4)2SO4的狀態(tài)和分相速度以及酶的活性，因此這些因素對(duì)生物胺氧化酶的萃取都有重要影響。經(jīng)過(guò)響應(yīng)面分析，PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值和溫度4個(gè)因素交互作用時(shí)，其中硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取的影響略弱，其他均強(qiáng)。

最終得到優(yōu)化的萃取鼠李糖乳桿菌所產(chǎn)生物胺氧化酶的條件為:質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的PEG2000、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的(NH4)2SO4、pH值為7.5、溫度為30℃，實(shí)驗(yàn)的萃取率為96.5，純化倍數(shù)為2.38。在下一步的實(shí)驗(yàn)中，可模擬工藝生產(chǎn)條件，大量萃取生物胺氧化酶，并對(duì)其工藝生產(chǎn)條件進(jìn)行優(yōu)化。

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