王明遠(yuǎn) 宋西正 李國(guó)棟 (青海省人民醫(yī)院，青海 西寧 810001)

腰椎間盤退變(IVDD)為腰背疼痛的主要原因之一，多數(shù)研究者認(rèn)為營(yíng)養(yǎng)、遺傳、力學(xué)、免疫等多種因素共同作用導(dǎo)致該病的發(fā)生〔1〕。其中力學(xué)因素的作用最為直接，主要由于人類的直立行走。同時(shí)在行走過(guò)程中，椎間盤易受到損傷，當(dāng)髓核物質(zhì)暴露于體液環(huán)境中，會(huì)激活機(jī)體中自身免疫反應(yīng)和炎性因子，將退變信號(hào)傳至細(xì)胞核，影響核內(nèi)基因表達(dá)，影響椎間盤中關(guān)鍵組分的合成和降解〔2〕。因此，研究者希望通過(guò)對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)通路進(jìn)行有效干預(yù)來(lái)減緩IVDD的病情發(fā)展〔3〕。但目前對(duì)于IVDD相關(guān)基因和調(diào)控退變信號(hào)傳導(dǎo)的通路仍未明確，嚴(yán)重影響到IVDD的細(xì)胞生物學(xué)治療進(jìn)展。本研究通過(guò)篩選退變腰椎間盤中的特異性表達(dá)microRNA的靶基因，旨在探討JNK信號(hào)傳導(dǎo)通路在IVDD中的分子生物學(xué)機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取腰椎退行性疾病患者10例為研究組，術(shù)中均切除退變髓核組織塊。排除合并腫瘤、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、感染性疾病者;近3個(gè)月內(nèi)接受免疫制劑治療者;其中男7例，女3例，年齡58～71歲，L4～5間盤4例、L5～S1間盤6例，突出型5例、疝出型5例;其中5例用于篩選實(shí)驗(yàn)，5例用于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。選取腰椎爆裂性骨折接受前路減壓髓核切除術(shù)患者4例為對(duì)照組，術(shù)中均切除正常髓核組織塊。腰椎間盤影像學(xué)檢查均未顯示出退變改變，年齡均＜25歲;其中男3例，女1例，年齡18～24歲，均為L(zhǎng)1～2間盤組織;其中2例用于篩選實(shí)驗(yàn)，2例用于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

1.2 儀器與試劑 熒光定量PCR檢測(cè)儀(瑞士羅氏公司，LightCycler 480型);雙光子熒光顯微鏡(德國(guó)Lavision Biotec公司);倒置顯微鏡(日本尼康公司，TE2000-U型);全自動(dòng)酶標(biāo)儀(瑞士 TECAN公司，GENIOS M200型);CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)SHEL LAB公司，2406型)。DMEM培養(yǎng)基(上海卡邁舒科技實(shí)業(yè)有限公司);胎牛血清(濰坊瑞華生物科技有限公司);EDTA、胰蛋白酶(美國(guó)Sigma公司);Trizol試劑(上海科敏生物科技有限公司);RNA保存液(上海逍鵬生物科技有限公司);microRNA qPCR引物、試劑盒(美國(guó)Signosis公司)。

1.3 microRNA篩選方法

1.3.1 髓核細(xì)胞分離、培養(yǎng)、鑒定 分別采用含青霉素和無(wú)青霉素的D-Hanks溶液將髓核組織各沖洗3遍;將髓核組織用剪刀剪碎后使用0.25%的胰蛋白酶和0.2%的Ⅱ型膠原酶在37℃條件下聯(lián)合消化1 h，每5 min輕搖1次，2 000 r/min離心5 min，棄去上清液。使用DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞吹勻，再次離心，重復(fù)3次。細(xì)胞計(jì)數(shù)后按1×106接種在培養(yǎng)瓶中，加入10 ml含青霉素100 U/ml、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中。放入5%的CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每2～3 d換1次培養(yǎng)液，并進(jìn)行傳代。當(dāng)?shù)?代細(xì)胞爬片到80%融合時(shí)，取出并進(jìn)行瑞氏染色、Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色等，置于關(guān)鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察。

1.3.2 數(shù)據(jù)校正及差異探針篩選 先預(yù)處理使用microRNA微陣列芯片方法獲得的篩選結(jié)果，將實(shí)驗(yàn)中存在的隨機(jī)誤差對(duì)數(shù)據(jù)分析帶來(lái)的影響消除;校正后的信號(hào)值采用穩(wěn)定多列陣分析(RMA)歸一化法獲得。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用聚類分析軟件Cluster3.0以及RAM對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行篩選。計(jì)算得到兩樣本間校正之后的熒光強(qiáng)度比值;將2作為閾值篩選差異microRNA，其中比值＜0.5為下調(diào)microRNA，＞2為上調(diào)microRNA。

1.4 顯著性高表達(dá)microRNA的驗(yàn)證方法 將進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的7例標(biāo)本處理后進(jìn)行標(biāo)記，其中對(duì)照組2例正常標(biāo)本標(biāo)記為1～2號(hào)，研究組5例標(biāo)本標(biāo)記為3～7號(hào)。將標(biāo)記好的樣本放于4℃冰箱中保存過(guò)夜，之后取出2 000 r/min離心10 min，棄去保存液后置于－80℃冰箱中保存。依次進(jìn)行總RNA提取和microRNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用無(wú)菌蒸餾水將得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋5倍后進(jìn)行下游實(shí)時(shí)qPCR實(shí)驗(yàn)。采用染料法進(jìn)行相對(duì)定量PCR分析，重復(fù)進(jìn)行3次，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果

2.1 髓核細(xì)胞鑒定 瑞氏染色后顯示細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈淡紫色，形態(tài)良好且邊緣清晰;甲苯胺藍(lán)染色后顯示細(xì)胞核呈陽(yáng)性，細(xì)胞質(zhì)淡染，提示能夠合成糖胺多糖;番紅O染色顯示細(xì)胞核較小，細(xì)胞質(zhì)淡染，分散分布;Ⅱ型膠原免疫組化染色顯示細(xì)胞呈棕色，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，見圖1。

圖1 髓核細(xì)胞鑒定(×200)

2.2 差異性表達(dá)的microRNA 微陣列的基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析與篩選顯示，研究組和對(duì)照組比值＞2的上調(diào)microRNA共包含20種，其中microRNA.494和microRNA.513a.5p表現(xiàn)為明顯高表達(dá)，比值分別為2.835 1、2.115 7。

2.3 聚類分析和靶基因預(yù)測(cè) 對(duì)差異性表達(dá)的microRNA行聚類分析，結(jié)果顯示，microRNA.494和microRNA.513a.5p在1號(hào)對(duì)照組中表達(dá)水平較低，在3號(hào)和4號(hào)研究組中表達(dá)水平較高，在2號(hào)研究組中表達(dá)水平中等。采用Targetscan6.2軟件進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)顯示，人退變髓核細(xì)胞中microRNA.494和microRNA.513a.5p均為高表達(dá)，預(yù)測(cè)靶基因分別為MKK4、JunD。

2.4 靶基因GO和信號(hào)傳導(dǎo)通路分析 將差異性表達(dá)的靶基因進(jìn)行GO分析顯示，研究組相比于對(duì)照組上調(diào)的靶基因在相關(guān)生物學(xué)過(guò)程中有9個(gè)最明顯的GO term富集度;對(duì)差異基因、靶基因進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)通路分析顯示，MKK4和JunD均參與了JNK信號(hào)通路，且分別處于JNK信號(hào)通路的上游和下游。

2.5 microRNA.494和microRNA.513a.5p驗(yàn)證和表達(dá)量 不同樣品中的PCR擴(kuò)增和溶解曲線microRNA.494和microRNA.513a.5p均顯示為單峰，且產(chǎn)物具有特異性，無(wú)產(chǎn)物二聚體生成。將對(duì)照組中1號(hào)正常標(biāo)本為對(duì)照檢測(cè)Ct值，并采用2-△△Ct法計(jì)算差異倍數(shù)，其中對(duì)照組中兩例標(biāo)本之間差異無(wú)明顯變化，2-△△Ct分別為0.89、3.24。研究組5例標(biāo)本與對(duì)照組中標(biāo)本1相比差異均表現(xiàn)為高倍數(shù)表達(dá)，2-△△Ct均值在 microRNA.494中為 12.445 0±8.042 0，在 microRNA.513a.5p中為48.477 0±37.163 6。

3 討論

microRNA通過(guò)DNA轉(zhuǎn)錄形成，但無(wú)法翻譯為蛋白質(zhì)，在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中對(duì)其他基因的功能進(jìn)行調(diào)節(jié)〔4〕。因此，在其他蛋白質(zhì)編碼基因的產(chǎn)生方面microRNA具有重要的調(diào)控作用。當(dāng)炎性因子經(jīng)細(xì)胞膜上的受體將細(xì)胞中的信號(hào)傳導(dǎo)通道激活后，使細(xì)胞核中的基因表達(dá)情況發(fā)生改變，加速了椎間盤中的蛋白多糖及膠原等重要成分的降解，同時(shí)抑制了以上成分的合成，進(jìn)而導(dǎo)致椎間盤中的水分喪失〔5〕。因此，基因治療需要在明確介導(dǎo)細(xì)胞中基因表達(dá)變化的信號(hào)傳導(dǎo)通路的基礎(chǔ)上才能取得理想的效果。

本研究提示，JNK信號(hào)通路在腰椎間盤退變的病情進(jìn)展中起到關(guān)鍵作用，且受到microRNA.494和microRNA.513a.5p的調(diào)控。相關(guān)研究也顯示，以上兩種microRNA在人體細(xì)胞的老化過(guò)程中有著明顯的調(diào)節(jié)作用〔6〕。

JNK信號(hào)傳導(dǎo)途徑在細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，且能夠被多種細(xì)胞外應(yīng)激信號(hào)激活。除應(yīng)激反應(yīng)之外，該信號(hào)通路還能被白細(xì)胞介素(IL)-1、生長(zhǎng)因子激活〔7〕。JNK蛋白激酶中存在3個(gè)編碼基因，分別為JNK1～3。其中JNK1、JNK2基因在全身范圍內(nèi)均有表達(dá)，在病理過(guò)程中起到重要作用，特別是免疫系統(tǒng);JNK3僅表達(dá)于心臟、腦、睪丸，在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用，特別是神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔8〕。

MKK4為MAPK信號(hào)通路的重要成分，可激活JNK通路起到誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、限制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的效果。JunD能夠被JNK通路激活，起到防止細(xì)胞凋亡的效果。microRNA.513a.5p能夠通過(guò)激活MKK4來(lái)正向調(diào)節(jié)JNK通路;microRNA.494通過(guò)激活JunD來(lái)負(fù)向調(diào)節(jié)JNK通路。以上可能為人類機(jī)體的一種自我保護(hù)機(jī)制，在退變間盤中同時(shí)存在有凋亡和抗凋亡兩種機(jī)制，形成一種動(dòng)態(tài)平衡，使得退變無(wú)法在短時(shí)間內(nèi)完成。

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