李浡，李雙石，蘭蓉，王曉杰，郭珊

（北京電子科技職業(yè)學(xué)院，北京100029）

葡萄梗多酚物質(zhì)的提取和成分分析

李浡，李雙石*，蘭蓉，王曉杰，郭珊

（北京電子科技職業(yè)學(xué)院，北京100029）

分別采用溶劑浸提法、索氏回流法、超聲提取法及微波提取法提取葡萄梗中的多酚物質(zhì)，并利用高效液相色譜技術(shù)分析葡萄梗中多酚物質(zhì)的組成及其含量。測定的加標(biāo)回收率在94.5%～98.5%，RSD在1.3%～2.1%，該方法的準(zhǔn)確度及精密度較好。結(jié)果表明，葡萄梗中含量較高的多酚成分為綠原酸（5.70 mg/g～13.24 mg/g）和白藜蘆醇（2.22 mg/g～6.71 mg/g），微波提取法提取5 min的葡萄梗中多酚物質(zhì)的效果較好，本研究可為葡萄梗多酚物質(zhì)的提取提供參考。

葡萄梗；多酚；高效液相色譜法

多酚活性物質(zhì)是一類具有生物活性的天然化合物，是植物在生長發(fā)育中重要的次生代謝產(chǎn)物，具有清除自由基和抗氧化等生物活性作用［1］，還具有提高免疫功能，抗衰老［2］，預(yù)防心腦血管疾病、抗突變、抗腫瘤、消炎、防治冠心病與中風(fēng)等多種藥理功能［3］。葡萄中含有大量的多酚物質(zhì)，主要集中在葡萄皮、籽、梗中，而關(guān)于葡萄梗中的多酚物質(zhì)的研究報(bào)道并不多［2，4-5］。葡萄梗作為生產(chǎn)葡萄酒第一道工序中的廢棄物，由于大量被丟棄，對環(huán)境造成一定的污染。因此提取葡萄梗中的多酚物質(zhì)，既能減少環(huán)境污染，又能充分利用資源。

高效液相色譜法（HPLC）是測定多酚物質(zhì)的常用檢測方法，目前關(guān)于測定多酚的流動(dòng)相主要有甲醇和乙腈兩種。本文主要利用乙腈-冰醋酸水溶液作為流動(dòng)相，優(yōu)化流動(dòng)相條件，對溶劑浸提、微波、超聲、索氏等不同提取方法提取的葡萄梗樣品中的多酚物質(zhì)。參照有關(guān)葡萄酒渣的多酚物質(zhì)檢測文獻(xiàn)［2，6-8］，故確定對葡萄梗中的兒茶素、阿魏酸、綠原酸、槲皮素、白藜蘆醇、沒食子酸、鞣花酸等多酚物質(zhì)進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

將赤霞珠葡萄梗樣品烘箱烘干后，研碎，過60目篩即得供試原材料葡萄梗樣品。

兒茶素、阿魏酸、綠原酸、槲皮素、白藜蘆醇、沒食子酸、鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；乙腈（色譜純）、冰醋酸（色譜純），北京化工廠；水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200高效液相色譜分析儀：美國安捷倫公司；Hypersil C18柱（5μm，250 mm×4.6 mm i.d）；9960A超聲清洗器：美國CBL光電子技術(shù)有限公司；KQ2200DB型超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司

1.3 試驗(yàn)條件

流動(dòng)相：A：乙腈，B：1%冰醋酸的水溶液；采用梯度洗脫程序：0～8.0 min，20%A；8.0 min～12.0 min，30% A；12.0 min～22.0 min，40%A；22.0 min～32.0 min，12% A；流速：1.0 mL/min；柱溫為：25℃；檢測波長：280 nm。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品兒茶素、沒食子酸、槲皮素、白藜蘆醇、鞣花酸、阿魏酸、綠原酸各10.0 mg，用甲醇溶解配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，備用。

1.5 樣品的制備

1.5.1 有機(jī)溶劑提取法

將原料與60%乙醇按料液比（g∶mL）1∶16.5混勻后，于50℃水浴分別浸提30 min和60 min。浸提完成后，3 000 r/min，離心5 min，收集上清液，即得葡萄梗多酚樣品。

1.5.2 索氏提取法

將原料與60%乙醇按料液比（g∶mL）1∶16.5混勻后，加熱70℃分別回流60 min及120 min，回流溶液減壓回收乙醇至無味，即得葡萄梗多酚樣品。

1.5.3 超聲輔助有機(jī)溶劑提取法

將原料與60%乙醇按料液比（g∶mL）1∶16.5混勻后，于50℃，分別超聲提取30 min和60 min后3 000 r/min離心5 min，收集上清液，即得葡萄梗多酚樣品。

1.5.4 微波輔助有機(jī)溶劑提取法

將原料與60%乙醇按料液比（g∶mL）1∶16.5混勻后，置于400 W～500 W微波條件下分別處理30 s、1 min和5 min，后于50℃水浴浸提60 min。浸提完成后，3 000 r/min離心5 min，收集上清液，即得葡萄梗多酚樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化色譜條件

本實(shí)驗(yàn)嘗試選擇乙腈-水、乙腈-冰醋酸溶液、甲醇-水等溶液作為流動(dòng)相，其中甲醇方案因文獻(xiàn)整體反應(yīng)效果比乙腈差，故放棄。乙腈-水的分離效果也較差，最后選定乙腈和1%的冰醋酸溶液作為流動(dòng)相。對不同的流動(dòng)相條件進(jìn)行測定，具體的洗脫條件見表1。

表1 流動(dòng)相洗脫條件Table 1 The elution conditions of？mobile phase

根據(jù)多酚標(biāo)準(zhǔn)品混合物以及葡萄梗提取樣品的出峰情況，選擇最佳的梯度洗脫條件，條件4的譜圖分離最好，圖1為多酚混合標(biāo)準(zhǔn)品的分離譜圖，基本達(dá)到基線分離。

圖1 多酚混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of polyphenol standards

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測限的測定

根據(jù)液相色譜優(yōu)化的梯度條件，對不同濃度的沒食子酸、兒茶素、阿魏酸、槲皮素、綠原酸、白藜蘆醇、鞣花酸等混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別進(jìn)樣。根據(jù)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別作出這7種標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出相應(yīng)的回歸方程，線性相關(guān)系數(shù)及最低檢測限見表2。

表2 多酚標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)以及最低檢測限Table 2 The equations of linear regression，correlation coefficients and lowest detectable limits of polyphenol standards

2.3 加標(biāo)回收率和精密度的測定

為了測定方法的準(zhǔn)確性，在一定量的樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)樣品，平行測定5次，計(jì)算出加標(biāo)回收率以及精密度，結(jié)果詳見表3。

表3 加標(biāo)回收率及精密度測定Table 3 Recoveries and precision

2.4 樣品的測定

根據(jù)1.5樣品制備得到的9種樣品，按照優(yōu)化的液相色譜條件，得到葡萄梗中多酚物質(zhì)的液相色譜圖，樣品1的譜圖見圖2。

圖2 樣品1的液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of sample 1

分別測定不同方法制備得到的葡萄梗樣品中多酚含量，結(jié)果見表4。

表4 多酚物質(zhì)含量（mg/g）Table 4 The contents of polyphenols in samples（mg/g）

由表4可知，不同提取方法測得的多酚物質(zhì)的含量各不相同。在葡萄梗樣品中測得的7種多酚物質(zhì)，綠原酸和白藜蘆醇的含量較高，含量分別為5.70 mg/g～13.24 mg/g和2.22 mg/g～6.71 mg/g。白藜蘆醇是葡萄梗中含量較高的物質(zhì)，只是不同地區(qū)不同品種的葡萄之間含量差異很大，Karacabey［9］以及Raynea［10］等測定的葡萄藤莖中白藜蘆醇的含量為3.45 mg/g～4.25 mg/g，與本文測定的白藜蘆醇含量比較接近。白藜蘆醇是具有芪類結(jié)構(gòu)的一種非黃酮類多酚化合物，是植物受到應(yīng)激時(shí)自身合成的一種抗毒素［11］。白藜蘆醇不但能提高植物抗病性，還具有抗氧化、保護(hù)心血管、抗癌、抗糖尿病、保護(hù)神經(jīng)、抗衰老和抗肥胖等生理及藥理作用［12-14］。

關(guān)于葡萄梗中綠原酸的含量還未見相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。綠原酸是一種重要的生物活性物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用［15］。

兒茶素和阿魏酸含量次之，分別為0.53 mg/g～2.95 mg/g和0.87 mg/g～3.27 mg/g，沒食子酸和槲皮素的含量較低，分別為0.57 mg/g～1.84 mg/g和0.20 mg/g～1.43 mg/g，鞣花酸的含量最低，甚至在個(gè)別樣品中未檢出。

2.5 不同提取方法對多酚物質(zhì)提取含量的影響

近年來，國內(nèi)外對葡萄梗中活性物質(zhì)提取工藝研究大多集中在有機(jī)溶劑提取法，超聲波輔助提取法和生物酶法也有少量應(yīng)用［8］。微波作為一種新型的應(yīng)用技術(shù)近年來廣泛應(yīng)用于植物化學(xué)領(lǐng)域，它具有加熱速度快、控制方便、受熱體系溫度均勻、節(jié)約能量等優(yōu)點(diǎn)［16］。由表4可知，微波提取隨著時(shí)間的增加，提取的多酚物質(zhì)含量也隨之增加，選擇微波時(shí)間為5 min為最佳提取時(shí)間。微波輔助溶劑提取的溫度是50℃，過高的溫度對多酚物質(zhì)的提取反而不利。微波提取5 min提取的葡萄梗中多酚物質(zhì)的含量較高，如綠原酸、槲皮素、沒食子酸、白藜蘆醇。其中綠原酸和白藜蘆醇的含量分別達(dá)到13.24 mg/g和6.71 mg/g，該方法可以考慮作為提取葡萄梗的多酚物質(zhì)主要方法。

超聲輔助有機(jī)溶劑提取法也是近幾年來廣泛應(yīng)用的提取方法，隨著提取時(shí)間的增加，提取多酚物質(zhì)的含量也隨著增加。超聲輔助法提取60 min的多酚物質(zhì)中，提取的阿魏酸和兒茶素的含量比較高，提取的白藜蘆醇含量也比較接近微波法提取的含量。超聲提取法也可以考慮作為提取葡萄梗多酚物質(zhì)的選擇方法。

有機(jī)溶劑提取法和索氏提取法作為傳統(tǒng)的提取方法，提取的多酚物質(zhì)含量普遍低于上述兩種提取方法。

3 結(jié)論

采用4種提取方法制備葡萄梗多酚提取液，結(jié)果表明，微波輔助提取法制備的多酚提取物中綠原酸、槲皮素、沒食子酸和白藜蘆醇的含量較高，超聲輔助提取法提取物中阿魏酸和兒茶素的含量較高，有機(jī)溶劑提取法和索氏提取法提取的多酚物質(zhì)含量低于上述兩種方法。

探討高效液相色譜技術(shù)檢測葡萄梗樣品中多酚成分組成方法，優(yōu)化液相色譜條件，選擇最佳梯度洗脫條件，用于測定兒茶素、阿魏酸、綠原酸、槲皮素、白藜蘆醇、沒食子酸和鞣花酸7種多酚的含量。加標(biāo)回收率和RSD表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

葡萄梗樣品多酚成分分析結(jié)果表明綠原酸和白藜蘆醇的含量較高，兒茶素和阿魏酸含量次之，槲皮素的含量較低，鞣花酸的含量最低，個(gè)別樣品中未檢出。

多酚物質(zhì)提取和成分分析研究為葡萄梗廢棄物的充分開發(fā)和天然資源的深度利用提供了參考依據(jù)。

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Extraction and Characterization of Polyphenols in Grape Stems

LI Bo，LI Shuang-shi*，Lan Rong，Wang Xiao-jie，Guo Shan
（Beijing Polytechnic，Beijing 100029，China）

Polyphenols of Grape stems were extracted with the methods of organic solvent extraction，soxhlet extraction，ultrasonic extraction and microwave extraction.After optimizing mobile phase，contents of polyphenols were detected by High Performance Liquid Chromatography（HPLC），equation of linear regression of seven standard material of Polyphenols were determined.The recovery rate was from 94.5%to 98.5%and the relative standard deviation（RSD）was from 1.3%to 2.1%，the method was accurate and sentitive.The contents of chlorogenic acid（5.70 mg/g～13.24 mg/g）and resveratrol（2.22 mg/g～6.71 mg/g）were higher of all the components.The method of microwave extraction for 5 min exhibited better extraction efficiency which would be used for extraction of polyphenols.

grape stems；polyphenols；High Performance Liquid Chromatography（HPLC）

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.013

2014-07-25

北京市屬高等學(xué)校人才強(qiáng)教計(jì)劃資助項(xiàng)目（PXM2014_ 014306_000051）；北京市教育委員會(huì)科技計(jì)劃面上項(xiàng)目專項(xiàng)資助課題（SQKM201210858001）；北京市屬高等學(xué)校教學(xué)名師資助項(xiàng)目（PXM2014_014306_000075）；北京電子科技職業(yè)學(xué)院院內(nèi)重點(diǎn)課題（YZKB2013008）

李浡（1973—），女（漢），副教授，博士，研究方向：食品生物技術(shù)。

*通信作者：李雙石