王振偉，王振強(qiáng)

（黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南開封475000）

甲殼低聚糖制備及其抗氧化活性研究

王振偉，王振強(qiáng)

（黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南開封475000）

甲殼低聚糖是殼聚糖降解后的產(chǎn)物，其與殼聚糖相比分子量更小，水溶性更好，生物利用度更高。采用超聲波協(xié)同α-淀粉酶處理殼聚糖制備甲殼低聚糖，以還原糖含量作為產(chǎn)品制備收得率的指標(biāo)，通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化制備工藝。結(jié)果表明，最佳工藝條件為：酶濃度1 000 U/g、酶解溫度55℃、反應(yīng)時(shí)間50 min、pH 5.2。在該條件下獲得的降解產(chǎn)物還原糖濃度為2.25 mg/mL，制備效果優(yōu)于單獨(dú)超聲波和酶解降解方法。對(duì)此方法制備的甲殼低聚糖的體外抗氧化活性進(jìn)行研究，與抗壞血酸對(duì)比，其對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子（O2-·）均有較強(qiáng)的清除能力。

甲殼低聚糖；超聲波；α-淀粉酶；抗氧化活性

殼聚糖是天然含氮多糖類生物活性物質(zhì)，在食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有廣泛用途。大量研究表明，殼聚糖的生理活性、功能性質(zhì)與分子量密切相關(guān)，不同分子量的殼聚糖性質(zhì)差異很大，而其許多功能要在分子量很小時(shí)才能體現(xiàn)出來(lái)。甲殼低聚糖是殼聚糖降解后的衍生物，與殼聚糖相比，具有分子量小、水溶性好、生物利用度高等獨(dú)特活性［1］。目前，甲殼低聚糖的制備方法主要有物理法、化學(xué)法和生物法三大類。物理法包括超聲波法、微波法和γ射線法等，具有無(wú)污染、反應(yīng)易控、產(chǎn)品品質(zhì)高等優(yōu)點(diǎn)，但目前多處于研究階段?；瘜W(xué)法雖然已用于工業(yè)化生產(chǎn)，但此法降解所得的產(chǎn)品聚合度分布范圍較寬，難以分離純化，并會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染；生物法在酶解過程中，不需加入其他反應(yīng)試劑，無(wú)其他副反應(yīng)，酶解過程易于控制，對(duì)環(huán)境無(wú)污染，優(yōu)于化學(xué)制備過程［2］。

實(shí)驗(yàn)通過超聲波協(xié)同酶解技術(shù)來(lái)研究殼聚糖的降解，制備得到功能性甲殼低聚糖。通過摸索研究超聲波協(xié)同淀粉酶酶解條件對(duì)殼聚糖降解效果的影響，進(jìn)行工藝技術(shù)的優(yōu)化，從而達(dá)到高效降解殼聚糖的目的。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

殼聚糖：優(yōu)級(jí)純，脫乙酰度，80%～95%，北京中生瑞泰科技有限公司；淀粉酶：生物試劑，3 700 U/g，北京奧博星生物技術(shù)有限公司，其它試劑均為分析純。

TU-1810紫外-可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；超聲波清洗器：江蘇昆山超聲儀器有限公司；HC-3018R冷凍離心機(jī)：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司。

1.2 方法

1.2.1 甲殼低聚糖制備

準(zhǔn)確稱取一定量的殼聚糖，溶于0.2 mol/L不同pH的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，濃度為2 g/100 mL，攪拌均勻形成均一膠體后，加入與殼聚糖不同比例的α-淀粉酶，分別在不同超聲波功率、不同溫度下反應(yīng)一定時(shí)間，溫度提高至90℃滅酶活，離心取上清液，測(cè)定還原糖含量（甲殼低聚糖產(chǎn)率計(jì)算依據(jù)）［3-4］。

1.2.2 還原糖含量測(cè)定

采用DNS法測(cè)定樣品中還原糖濃度［5］。取待測(cè)樣品1.5 mL，置于沸水浴中煮沸2 min，加入2 mL的DNS試劑，以流水迅速冷卻，用水定容至25 mL，搖勻。以試劑空白調(diào)零，在540 nm處測(cè)定吸光度值，與鹽酸氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)做對(duì)照，即可計(jì)算出樣品中還原糖的含量（mg/mL）。

1.2.3 抗氧化活性檢測(cè)

1）清除超氧陰離子（O2-·）的能力檢測(cè)［6］

采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定。首先向裝有4.0 mL Tris-HCl緩沖溶液（50 mmol/L，pH8.2）的試管中，分別加入5 mL蒸餾水或一定濃度的甲殼低聚糖溶液，混勻后于25℃水浴30 min，取出后加入25℃水浴預(yù)熱過的3 mmol/L鄰苯三酚0.5 mL，迅速振蕩混勻，于波長(zhǎng)322 nm處每隔30 s記錄一次吸光值。計(jì)算線形范圍內(nèi)每30 s吸光值的增加速率。

式中：ΔA0/Δt表示未加入甲殼低聚糖樣品鄰苯三酚自氧化的反應(yīng)速率；Δi/Δt表示加入甲殼低聚糖樣品后的反應(yīng)速率。

2）清除DPPH自由基能力檢測(cè)［7］

取2 mL DHHP溶液，加入2 mL同一溶劑溶解的甲殼低聚糖，充分混合。室溫放置30 min后在517 nm處測(cè)定吸光度。DPPH自由基的清除率計(jì)算方法為：

式中：Ai為樣品液2 mL和DPPH溶液（2× 10-4mol/L）2 mL測(cè)定的吸光度；Ae為溶劑2 mL和DPPH溶液2 mL測(cè)定的吸光度；Aj為樣品液2 mL和溶劑2 mL測(cè)定的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素條件確定

2.1.1 反應(yīng)體系pH對(duì)殼聚糖酶解的影響

調(diào)整反應(yīng)體系的pH分別為4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4和5.6，固定酶濃度為1 000 U/g，超聲功率100 W，反應(yīng)時(shí)間50 min，反應(yīng)溫度50℃，研究pH對(duì)淀粉酶酶解殼聚糖的效果，結(jié)果如圖1所示。

圖1 pH對(duì)甲殼低聚糖制備的影響Fig.1 Effects of pH value on yields of chito-oligosaccharides

從圖1中可以看出反應(yīng)體系pH對(duì)酶解效果有顯著影響。酶解產(chǎn)物中還原糖濃度隨著pH的上升呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，pH在5.0左右的范圍內(nèi)，可以達(dá)到較好的酶解效果。該α-淀粉酶的適用pH范圍為5.0～7.0，圖中可看出在超聲波協(xié)同下，該酶作用殼聚糖的最適pH為5.0。

2.1.2 酶濃度影對(duì)殼聚糖酶解效果的影響

所用α-淀粉酶酶活為3 700 U/g，研究酶與底物之間的比例（E/S）對(duì)甲殼低聚糖產(chǎn)率的影響，底物濃度固定為2 g/100 mL，改變?chǔ)?淀粉酶用量，分別為200、400、600、800、1 000、1 200 U/g和1400 U/g，超聲功率100 W，反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間50 min，反應(yīng)體系pH 5.2，研究酶濃度對(duì)殼聚糖降解的影響，結(jié)果如圖2所示。

從圖2中可以看出，隨著α-淀粉酶濃度的上升，還原糖含量不斷升高。當(dāng)酶濃度大于1 000 U/g后，還原糖含量又稍微下降。酶濃度對(duì)殼聚糖的降解效果有一定的影響，在酶濃度達(dá)到飽和濃度之前，酶解效果隨著酶濃度的升高而增強(qiáng)，而當(dāng)酶與底物的結(jié)合接近飽和時(shí)，酶解效果則不再明顯提高。

2.1.3 溫度對(duì)殼聚糖酶解效果的影響

酶濃度固定為1 000 U/g，超聲功率100 W，反應(yīng)時(shí)間50 min，反應(yīng)體系pH 5.2，改變反應(yīng)溫度分別為45、50、455、60、65、70℃，研究反應(yīng)溫度對(duì)殼聚糖降解的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖2 酶濃度對(duì)甲殼低聚糖制備的影響Fig.2 Effects of amylase addition on yields of chitooligosaccharides

圖3 超聲酶解溫度對(duì)甲殼低聚糖制備的影響Fig.3 Effects of enzymolysis temperature on yields of chitooligosaccharides

從圖3中可以看出，酶解產(chǎn)物中還原糖濃度隨著溫度的上升呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，溫度在55℃左右的范圍內(nèi)，可以達(dá)到較好的降解效果。該α-淀粉酶的適用溫度范圍為50℃～70℃，從圖可看出在超聲波協(xié)同下，該酶作用殼聚糖的最適溫度為55℃。可能是開始時(shí)隨著溫度升高能使反應(yīng)物的能量增加，分子間碰撞的頻率也增加，從而提高酶解速率，但是當(dāng)溫度過高，超過了酶的最適溫度時(shí)，酶活性將降低，導(dǎo)致水解速度下降。

2.1.4 超聲酶解時(shí)間對(duì)殼聚糖酶解效果影響

酶濃度固定為1 000 U/g，超聲功率100 W，反應(yīng)時(shí)溫度50℃，反應(yīng)體系pH 5.2，控制酶解的時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60、70、80、90 min，研究反應(yīng)時(shí)間對(duì)殼聚糖降解的影響，結(jié)果如圖4所示。

從圖4可以看出，隨著降解的不斷進(jìn)行還原糖含量不斷上升，超聲酶解前30 min，還原糖含量上升的速度較快，60 min時(shí)還原糖濃度升到2.01 mg/mL，隨后還原糖濃度變化平緩，且有下降趨勢(shì)。說(shuō)明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，超聲波協(xié)同α-淀粉酶降解殼聚糖的反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行，只是達(dá)到一定時(shí)間后，反應(yīng)速率逐漸減慢。

2.1.5 超聲波功率對(duì)殼聚糖酶解效果的影響

圖4 超聲酶解時(shí)間對(duì)甲殼低聚糖制備的影響Fig.4 Effects of enzymolysis time under ultrasonic wave on yields of chito-oligosaccharides

酶濃度固定為1 000 U/g，，反應(yīng)時(shí)溫度50℃，反應(yīng)體系pH 5.2，控制酶解時(shí)間為50 min，改變超聲波功率為20、40、60、80、100、120、140 W，研究超聲功率對(duì)殼聚糖降解效果的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 超聲波功率對(duì)甲殼低聚糖制備的影響Fig.5 Effects of ultrasonic power on yields of chitooligosaccharides

從圖5可知，超聲功率從小變大，還原糖含量不斷上升，說(shuō)明超聲波對(duì)α-淀粉酶的酶活在一定范圍內(nèi)具有促進(jìn)作用，在超聲功率為100 W時(shí)，還原糖濃度升到最大。隨后還原糖濃度開始降低，酶活呈下降趨勢(shì)，這是由于酶的酶學(xué)活性依賴于酶分子的構(gòu)象結(jié)構(gòu)，而超聲波的空化作用改變了α-淀粉酶酶分子的構(gòu)象，影響酶的酶學(xué)活性。由此本實(shí)驗(yàn)條件下最佳超聲功率為100 W。

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，超聲功率能夠提升淀粉酶活性，功率100 W時(shí)達(dá)到最大，因此選擇超聲功率為100 W。同時(shí)甲殼低聚糖產(chǎn)率還受超聲時(shí)間、酶解溫度、酶濃度、pH4個(gè)因素交叉影響。選擇此四個(gè)因素為考察因素，各取3個(gè)水平，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，不考慮各因素間的相互影響。超聲波協(xié)同淀粉酶降解殼聚糖的因素水平設(shè)計(jì)見表1。

超聲波協(xié)同淀粉酶降解條件的正交試驗(yàn)結(jié)果見表2所示。

從表中可以看出，在9個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)組中，第4組的降解效果最好，酶解產(chǎn)物中的還原糖濃度最高，達(dá)2.23 mg/mL。由極差分析可知，影響酶解效果的因素主次為：A＞D＞C＞B，即：酶濃度＞pH＞反應(yīng)時(shí)間＞溫度。超聲波協(xié)同淀粉酶降解殼聚糖制備甲殼低聚糖的最優(yōu)工藝組合為A2B2C2D3，即酶濃度1 000 U/g、酶解溫度55℃、反應(yīng)時(shí)間50 min、pH5.2。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 L9（34）正交試驗(yàn)Table 2 Results of L9（34）orthogonal test

2.3 產(chǎn)率比較

分別采用超聲波降解（功率100 W，時(shí)間50 min，溫度55℃，體系pH 5.2），α-淀粉酶降解（酶濃度1 000 U/g，時(shí)間50 min，溫度55℃，體系pH5.2），超聲波協(xié)同α-淀粉酶（超聲功率100 W，酶濃度1 000 U/g，酶解溫度55℃，反應(yīng)時(shí)間50 min，pH5.2）制備甲殼低聚糖，每種方法制備均做3次平行試驗(yàn)取平均值，對(duì)不同方式制備甲殼低聚糖的效果進(jìn)行比較。

由表3結(jié)果可知，超聲波協(xié)同復(fù)合酶制備甲殼低聚糖，與單純超聲波法和酶法降解相比，有較高的產(chǎn)率，同時(shí)采用超聲波協(xié)同酶法制備甲殼低聚糖，能夠大大節(jié)省單純酶解的時(shí)間，因此有著明顯的優(yōu)勢(shì)。

2.4 抗氧化活性結(jié)果分析

2.4.1 清除超氧陰離子（O2-·）能力

清除超氧陰離子（O2-·）能力見圖6。

表3 不同制備方法還原糖含量比較Table 3 Comparison of yields of chito-oligosaccharides obtained by different methods

圖6 超氧陰離子（O2-·）清除能力比較Fig.6 Comparison of scavenging superoxide capacity of chitooligosaccharides and ascorbic acid

從圖6可以看出，甲殼低聚糖具備清除超氧陰離子的能力，且隨著濃度的增加，對(duì)超氧陰離子的清除率迅速提升，當(dāng)濃度達(dá)到1.2 mg/mL時(shí)，對(duì)超氧陰離子的清除率接近80%，當(dāng)甲殼低聚糖濃度升到1.6 mg/mL時(shí)，對(duì)超氧陰離子的清除率能接近100%。與VC清除超氧陰離子的能力相比，VC的抗氧化能力更強(qiáng)。但超氧陰離子自由基能與甲殼低聚糖分子中的氨基和羥基反應(yīng)而被清除，因此甲殼低聚糖對(duì)自由基的清除作用可能更為穩(wěn)定和徹底。

2.4.2 清除DPPH自由基能力

清除DPPH自由基能力見圖7。

圖7 清除DPPH自由基能力比較Fig.7 Comparison of scavenging DPPH capacity of chitooligosaccharides and ascorbic acid

將制備的甲殼低聚糖配制成 0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.008、0.006、0.004、0.002、0.001 mg/mL的溶液，配制同樣濃度的抗壞血酸溶液，進(jìn)行清除DPPH自由基能力檢測(cè)。圖7可知，甲殼低聚糖和抗壞血酸濃度分別達(dá)到0.02、0.04 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到90%，之后增長(zhǎng)緩慢。超聲協(xié)同酶法制備的甲殼低聚糖與抗壞血酸相比，有較強(qiáng)的清除DPPH自由基能力。

3 結(jié)論

1）超聲波能夠提升淀粉酶的活性，超聲波協(xié)同α-淀粉酶，能夠有效降解殼聚糖制備甲殼低聚糖。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知，影響降解效果的因素主次為：酶濃度＞pH＞反應(yīng)時(shí)間＞溫度。最優(yōu)工藝組合為：酶濃度1 000 U/g、酶解溫度55℃、反應(yīng)時(shí)間50 min、pH5.2。

2）分別采用超聲波降解，α-淀粉酶降解，超聲波協(xié)同α-淀粉酶降解等3種方法制備甲殼低聚糖，對(duì)制備效果進(jìn)行比較，結(jié)果表明超聲波協(xié)同復(fù)合酶制備甲殼低聚糖，與單純超聲波法和酶法降解相比，有較高的產(chǎn)率，同時(shí)采用超聲波協(xié)同酶法制備甲殼低聚糖，能夠大大節(jié)省單純酶解的時(shí)間，因此有著明顯的優(yōu)勢(shì)。

3）研究超聲波協(xié)同酶法制備的甲殼低聚糖的體外抗氧化活性，與抗壞血酸相比，對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子（O2-·）均有較強(qiáng)的清除能力。超氧陰離子自由基是一種兩性離子自由基，能與甲殼低聚糖分子中的氨基和羥基反應(yīng)，清除作用可能更為穩(wěn)定和徹底。

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Study on Preparation of Chito-oligosaccharides and Its Antioxidant Activity

WANG Zhen-wei，WANG Zhen-qiang
（Yellow River Conservancy Technical Institute，Kaifeng 475000，Henan，China）

Chito-oligosaccharides is the degradation product of Chitosan，which has small molecular weight，good water-soluble and a higher oavailability.In this experiment chitosan was degraded by α-amylase under ultrasonic wave，measuring degradation effect with the index of reducing sugar concentration.The orthogonal experiments were conducted obtain the optimal hydrolysis conditions.The results showed that the optimal technological condition was as follows：amylase addition 1 600 U/g，enzymolysis temperature 55℃，enzymolysis time under ultrasonic wave 50 min and pH 5.2.In these conditions，the concentration of reducing sugar was determined to 2.25 mg/mL，and the effect was better than the preparation effect by ultrasonic method and enzymatic hydrolysis respectively.The antioxidative activities of chito-oligosaccharides prepared by this method were studied.The results showed that chito-oligosaccharides demonstrated significant scavenging effects on DPPH and superoxide（O2-·）compared with ascorbic acid.

chito-oligosaccharides；ultrasonic wave；α-amylase；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.006

2014-01-24

黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院科研基金項(xiàng)目（2012QNKY011）

王振偉（1980—），男（漢），講師，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。