劉宇軒，米榮升，2，黃 燕，2，于慧珠，胡 盼，詹婷婷，周金林，2，陳兆國，2

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點開放實驗室 農(nóng)業(yè)部動物產(chǎn)品質(zhì)量安全生物性危害因子風(fēng)險評估實驗室（上海），上海 200241；2. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

基于微小隱孢子蟲重組CP15/60蛋白的間接ELISA檢測方法的建立及上海市豬隱孢子蟲感染情況調(diào)查

劉宇軒1，米榮升1，2，黃 燕1，2，于慧珠1，胡 盼1，詹婷婷1，周金林1，2，陳兆國1，2

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點開放實驗室 農(nóng)業(yè)部動物產(chǎn)品質(zhì)量安全生物性危害因子風(fēng)險評估實驗室（上海），上海 200241；2. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

為建立敏感、特異的豬隱孢子蟲感染血清學(xué)檢測方法，了解上海市豬隱孢子蟲感染情況，以純化的重組CP15/60（rCP15/60）為診斷抗原，建立了檢測隱孢子蟲感染的間接ELISA方法，并對上海市豬隱孢子蟲感染情況進行血清學(xué)調(diào)查。結(jié)果顯示，與Nested PCR方法檢測結(jié)果相比，本研究建立的rCP15/60-ELISA方法的陰陽性符合率為83.3%，敏感性為100%，特異性為80%；重復(fù)性試驗的變異系數(shù)在12.5%之內(nèi)；對341份豬田間血清進行檢測，陽性為194份，占56.89%，表明該方法可用于實驗室初步診斷和現(xiàn)場豬隱孢子蟲病的流行病學(xué)調(diào)查。

微小隱孢子蟲；重組CP15/60；間接ELISA；調(diào)查

隱孢子蟲病（cryptosporidiosis）是由隱孢子蟲（Cryptosporidium spp.）引起的以持續(xù)性腹瀉為主要臨床癥狀的一種全球性、水源性傳播的人獸共患寄生蟲病，嚴(yán)重時可導(dǎo)致人和動物死亡。其病情的嚴(yán)重程度與機體免疫狀況有關(guān)，免疫功能正常的人或動物在感染后會出現(xiàn)腹瀉癥狀，但可自愈；而免疫功能低下者，尤其是嬰幼兒和艾滋病患者，感染后病情嚴(yán)重，甚至危及生命［1］。自1907年Tyzzer［2］首次發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲以來，研究報道顯示在世界上大多數(shù)國家和地區(qū)存在該蟲，研究人員已注意到其在全球的感染數(shù)量被嚴(yán)重低估［3］。在欠發(fā)達(dá)地區(qū)以及高收入國家的研究均已證實，隱孢子蟲是引起人和動物腹瀉以及兒童營養(yǎng)不良的重要病原［3］。盡管對該病的防治已經(jīng)進行了大量的研究，但至今仍沒有一種有效的防治方法。因此，發(fā)展隱孢子蟲病病原檢測技術(shù)，及時了解疾病感染情況，對于預(yù)防和減少疾病危害具有重要意義。

酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）具有很高的特異性、敏感性、穩(wěn)定性和重復(fù)性，且操作簡便，已成為酶免疫測定技術(shù)中應(yīng)用最廣、研究最多和最完善的技術(shù)［4］。應(yīng)用該技術(shù)可在一天之內(nèi)檢查幾百甚至上千份樣品，特別適合于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查。用于ELISA診斷的隱孢子蟲抗原主要是卵囊和子孢子抗原，其中表面抗原的免疫原性和反應(yīng)原性研究最為深入，其編碼基因也被認(rèn)為是隱孢子蟲疫苗的重要候選基因。微小隱孢子蟲（Cryptosporidium parvum）子孢子表面蛋白CP15/60是公認(rèn)的具有保護性的抗原之一［5］，也是隱孢子蟲子孢子成份中反應(yīng)最強烈的蛋白之一［6］。Jenkins等［7］從微小隱孢子蟲噬菌體表達(dá)文庫中獲得編碼CP15/60的基因，含有該基因的重組質(zhì)粒免疫母牛后，血清和初乳中產(chǎn)生了很強的抗隱孢子蟲特異性抗體，免疫抑制的成年鼠口服免疫母牛的初乳后，對隱孢子蟲感染也產(chǎn)生了部分保護作用［8］。何宏軒等［9］將含有CP15/60的真核重組質(zhì)粒pcDNA3-15/60經(jīng)鼻粘膜免疫懷孕成年山羊，同樣發(fā)現(xiàn)抗CP15/60抗體存在于免疫山羊的血漿和初乳中，并能將免疫力傳給哺乳的羔羊，使羔羊?qū)ξ⑿‰[孢子蟲感染產(chǎn)生保護。在眾多的已知隱孢子蟲抗原中，CP15/60顯示出高度的免疫原性和反應(yīng)原性，被認(rèn)為是很有前途的免疫診斷和疫苗候選抗原［5］。

本實驗室在前期工作中克隆和表達(dá)了微小隱孢子蟲CP15/60基因，本研究以原核表達(dá)的重組CP15/60（recombinant CP15/60， rCP15/60）蛋白為抗原，建立檢測隱孢子蟲病的間接ELISA診斷方法，并應(yīng)用于現(xiàn)場分離的豬血清樣品檢測，評估其在隱孢子蟲病診斷和流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌株 含微小隱孢子蟲CP15/60基因的重組質(zhì)粒pET-28b-CP15/60及轉(zhuǎn)化了該重組質(zhì)粒的BL21（DE3）菌液由本實驗室制備保存［4］。

1.2 主要試劑 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購自Thermo公司；6× Protein Loading Buffer購自上海康穩(wěn)生物科技有限公司；Ni-NTA His Bind Resin層析柱購自Merck公司；胰蛋白胨、酵母提取物、脫脂奶粉購自英國OXOID公司；硫酸卡那霉素購自生工生物工程（上海）股份有限公司；DAB、TMB購自天根生化科技（北京）有限公司；過硫酸銨、丙烯酰胺、TEMED購自Sigma公司；兔抗豬IgG-HRP購自Abcam公司；硝酸纖維素膜購自Whatman公司；FastDNA SPIN Kit for Soil試劑盒購自MP公司；ELISA酶標(biāo)板為Costar公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 血清 隱孢子蟲感染豬血清、隱孢子蟲豬陰性血清及相應(yīng)糞便采自2月齡以內(nèi)的廣西巴馬小型豬，采用Nested PCR方法對每3 d采集1次的糞便連續(xù)多次重復(fù)檢測確定；豬附紅細(xì)胞體（Mycoplasma suis）陽性血清采自田間豬樣本，經(jīng)PCR檢測為豬附紅細(xì)胞體感染，間接ELISA檢測抗體陽性；弓形蟲（Toxoplasma gondii）感染豬血清、豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）感染豬血清、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染豬血清分別由上海獸醫(yī)研究所王權(quán)研究員、馬志永研究員和周艷君研究員饋贈；豬田間血清采自上海市長寧區(qū)、松江區(qū)和嘉定區(qū)某屠宰場成年育肥豬。

1.4 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)與重組蛋白純化 將10 mL pET-28b-CP15/60重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌加入到250 mL自轉(zhuǎn)錄培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)16h，離心收集菌體。加入10mL結(jié)合緩沖液重懸菌體，凍融3次后進行冰浴超聲，4℃、10000×g離心10min，收集上清，再次離心后，取上清用0.45 μm濾膜過濾除雜，利用Ni-NTA His BindResin層析柱純化rCP15/60蛋白，進行SDS-PAGE分析純度并用ThermoFisher公司的NanoDrop 2000c分光光度計測定蛋白濃度，－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 Western blot檢測 按文獻(xiàn)［4］報道的方法，用Western blot技術(shù)對純化的rCP15/60的反應(yīng)原性進行檢測，所用一抗血清為隱孢子蟲感染豬血清（1:100稀釋），二抗為HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG（1:1000稀釋），DAB顯色。

1.6 間接ELISA檢測方法的建立

1.6.1 重組抗原最適包被濃度和血清最佳稀釋度的確定 通過方陣實驗確定抗原最適包被濃度和血清最佳稀釋度。用0.05mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液（pH9.6）將重組抗原依次稀釋成0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μg/mL，分別包被酶標(biāo)板，每孔100 μL，4℃包被過夜。用PBST洗滌酶標(biāo)板3次，每次5min，然后用5%脫脂奶粉37℃封閉2h。再用PBST洗滌酶標(biāo)板3次，以1:100、1:200、1:400、1:800稀釋的陽性血清以及陰性血清為一抗，37℃作用45min。PBST洗滌3次后，加入100 μL HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG（1:800稀釋），37℃作用30min。每孔加入100μL TMB-H2O2避光顯色15min，再加入50μL 2mol/L硫酸終止反應(yīng)，測定450nm波長處的光密度值（OD450），選擇陽性O(shè)D450＞1.0、陰性O(shè)D450較小、P/N值較大的抗原包被濃度、血清稀釋度組合作為最適包被濃度和血清最佳稀釋度。

1.6.2 酶標(biāo)二抗最適稀釋度的確定 用重組抗原最適稀釋濃度包被酶標(biāo)板，陽、陰性血清按最佳濃度稀釋，酶標(biāo)二抗稀釋成1:400、1:800、1:1600、1:3200共4個梯度，進行ELISA測定，并重復(fù)3次，以P/N值最大時的酶標(biāo)二抗稀釋度為最適稀釋度。

1.6.3 rCP15/60-ELISA判定標(biāo)準(zhǔn)的確定 參考Case等［10］的方法來確定陰陽性標(biāo)準(zhǔn)臨界值。收集60份經(jīng)Nested PCR法檢測糞便DNA為陰性的豬血清樣品，用Nested PCR間接ELISA法檢測，重復(fù)3次，并設(shè)陽性對照。測定OD450值后求出所有陰性血清樣品的OD450平均值（）和標(biāo)準(zhǔn)差（s）。以O(shè)D450（樣本）值x≥+4 s時判為陽性；OD450（樣本）值x＜+3 s時判為陰性；當(dāng)+3s≤OD450（樣本）值＜+4 s時判為

1.7 重復(fù)性試驗

1.7.1 批內(nèi)重復(fù)性試驗 在相同試驗條件下，用同一批制備的rCP15/60包被酶標(biāo)板，選取抗體效價不同的4份陽性血清和4份陰性血清，用rCP15/60-ELISA方法檢測，測定OD450，每份血清樣品平行做8個重復(fù)，按以下公式計算變異系數(shù)（coefficient of variance，CV）：CV=［樣本 OD450值標(biāo)準(zhǔn)差（s）/樣本 OD450值平均數(shù)（）］×100%。

1.7.2 批間重復(fù)性試驗 以4批不同時間純化的重組蛋白作為抗原分別包被酶標(biāo)板，利用rCP15/60-ELSIA技術(shù)，對抗體效價不同的4份陽性血清和4份陰性血清進行檢測，測定OD450，每份樣品重復(fù)3次，取平均值，同1.7.1觀察其CV值。

1.8 敏感性、特異性試驗 從田間同時收集豬的糞便及血清樣品，其中血清用rCP15/60-ELISA技術(shù)檢測；糞便利用FastDNA SPIN Kit for Soil試劑盒提取DNA，按Chen等［11］報道的方法進行Nested PCR檢測，按祖立闖等［12］報道的方法計算其陰陽性符合率、敏感性、特異性。

1.9 交叉反應(yīng)試驗 用rCP15/60包被酶標(biāo)板，然后分別用1:100稀釋的豬附紅細(xì)胞體感染豬血清、弓形蟲感染豬血清、豬瘟病毒感染豬血清、豬藍(lán)耳病病毒感染豬血清作為一抗，按rCP15/60-ELISA方法，加入對應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗，檢測血清交叉反應(yīng)情況，每份血清平行做3個重復(fù)。

1.10 田間樣品檢測 2012年7月從上海市長寧區(qū)某屠宰場采集成年育肥豬血清167份，同年10月從上海市松江區(qū)和嘉定區(qū)某屠宰場采集成年育肥豬血清67份和107份，共341份，應(yīng)用建立的rCP15/60-ELISA技術(shù)對其進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 rCP15/60蛋白的表達(dá)與純化 重組質(zhì)粒pET-28b -CP15/60轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)表達(dá)16h后，經(jīng)SDS-PAGE電泳，出現(xiàn)了大小約21kDa的明顯條帶，與預(yù)計大小相同表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA His Bind Resin層析柱純化后，得到了較純的目的蛋白（圖1），濃度為2.4 mg/mL。

圖 1 重組蛋白的 SDS-PAGE 電泳Fig.1 SDS-PAGE electrophoresis of the expressed recombinant protein

2.2 重組蛋白的Western blot分析 結(jié)果顯示，rCP15/60能與隱孢子蟲感染豬血清反應(yīng)，而與未感染隱孢子蟲的陰性豬血清無反應(yīng)（圖2）。

圖 2 重組蛋白的 Western blot 分析Fig. 2 Western blot analysis of the expressed recombinant protein

2.3 間接ELISA檢測方法的建立

2.3.1 重組抗原最適包被濃度、血清最佳稀釋度、酶標(biāo)抗體工作濃度的確定 通過方陣試驗確定了抗原最適包被濃度為2 μg/mL，一抗血清最佳稀釋度為1:100（表1），兔抗豬IgG-HRP酶標(biāo)二抗工作濃度為1:800（表2）。

2.3.2 陰、陽性臨界值的確定 60份陰性豬血清樣本OD450平均值（）和標(biāo)準(zhǔn)差（sd）分別0.270 844與0.052 524+4s=0.480 49+3s=0.428 41。當(dāng)樣品OD450值x≥0.480 49時判為陽性；當(dāng)樣品OD450值x＜0.428 41時判為陰性；當(dāng)樣品OD450值介于0.428 41（含0.42841）與0.48049之間則判為疑似。對可疑樣本重檢時，當(dāng)OD450值x≥+3.5s=0.45445為陽性，OD450值x ＜+3.5s=0.45445為陰性。

表1 棋盤法篩選抗原和一抗工作濃度Table 1 Determination of the most appropriate concentration of antigen and primary antibody using chessboard method

表 2 二抗工作濃度的確定Table 2 Determination of the most appropriate concentration of rabbit anti-pig IgG/HRP

2.4 重復(fù)性試驗結(jié)果 批內(nèi)重復(fù)性試驗的CV為3.47%～8.52%，均小于10%；不同批次重組抗原的批間重復(fù)性試驗CV為6.25%～12.5%，均小于15%（表3）。

表3 重復(fù)性試驗結(jié)果Table3 The results of repetition test

2.5 rCP15/60-ELISA的敏感性、特異性試驗 應(yīng)用rCP15/60-ELISA技術(shù)對采集的18份血清樣品進行檢測，檢測出陽性6份，陰性12份，陽性率為33.33%。對應(yīng)宿主的糞便樣品DNA用nested PCR法檢測，結(jié)果陽性樣品為3份，陰性樣品為15份，陽性率為16.67%。rCP15/60-ELISA技術(shù)檢測陽性率高于Nested PCR法檢測結(jié)果，rCP15/60-ELISA相對于Nested PCR的陰陽性符合率為83.3%，敏感性為100%，特異性為80%（見表4）。

2.6 交叉反應(yīng)試驗結(jié)果 以rCP15/60蛋白包被酶標(biāo)板，與豬附紅細(xì)胞體感染豬血清、弓形蟲感染豬血清、豬瘟病毒感染豬血清、豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染豬血清反應(yīng)，OD450分別為0.178、0.356、0.146、0.053，均低于0.428 41。陽性對照OD450為0.976，陰性對照OD450為0.143。

2.7 田間樣品檢測 341份豬田間血清樣品檢測結(jié)果顯示，陽性為194份，占56.89%，其中長寧區(qū)屠宰場陽性102份，占61.08%；松江區(qū)屠宰場陽性32份，占47.76%；嘉定區(qū)屠宰場陽性60份，占56.07%（表5）。從不同時間來看，7月采集樣品167份，陽性102份，占61.08%；10月采集樣品174份，陽性92份，占52.87%。

表 4 微小隱孢子蟲感染不同檢測方法檢測結(jié)果比較Table 4 Comparison of different methods for detecting Cryptosporidium

表 5 不同屠宰場場豬隱孢子蟲感染情況Table 5 The Cryptosporidium infection situation of pigs from different slaughterhouse

3 討論

建立高敏感、特異強、重復(fù)性好的免疫學(xué)診斷技術(shù)，對于人和動物隱孢子蟲病的防控具有重要意義。盡管有不少抗原已被用于建立隱孢子蟲病免疫學(xué)診斷技術(shù)，但迄今尚無比較理想的隱孢子蟲病免疫學(xué)診斷試劑盒。本研究利用重組表達(dá)的CP15/60蛋白，建立了檢測豬隱孢子蟲感染的間接ELISA技術(shù)。對批內(nèi)和批間抗原的重復(fù)性檢測顯示，兩者分別小于10%和15%，提示重復(fù)性良好。同時，相對于Nested PCR技術(shù)，rCP15/60-ELISA的敏感性為100%，特異性為80%，陰陽性符合率為83.3%，符合率較高。其中有部分ELISA檢測陽性的樣品，Nested PCR檢測為陰性，這可能原因有兩個：第一，當(dāng)每克糞便有200個以上卵囊時，Nested PCR法才能檢測到，而每克糞便中卵囊量小于200個時，Nested PCR法檢測不出［13］。在本研究中，豬感染隱孢子蟲后，可能糞便中卵囊不足以被檢測出，所以部分樣品ELISA檢測為陽性而Nested PCR檢測為陰性。第二，豬感染隱孢子蟲一段時間后，糞便中已停止排出卵囊，而體內(nèi)卻已產(chǎn)生抗體，導(dǎo)致抗體能夠檢出而糞便卵囊沒有檢測到。ELISA和 nested PCR的檢測對象不同，反映不同的感染現(xiàn)象，在做流行病學(xué)調(diào)查時，如能將兩種方法結(jié)合使用，更能準(zhǔn)確的反應(yīng)出隱孢子蟲的真實感染情況。

Chen等［11］用Sheather's蔗糖漂浮法和改良抗酸染色法對上海市12個豬場豬隱孢子蟲感染情況進行調(diào)查，結(jié)果顯示上海市豬的平均感染率為34.4%，不同豬場普遍存在隱孢子蟲感染，但各場間感染率差異很大，在14.1%～90.6%之間。其中上海市嘉定區(qū)3個豬場的感染率分別為80.0%、63.0%和14.1%；上海市松江區(qū)某豬場隱孢子蟲感染率為82.61%。本文采用CP15/60-ELISA方法對嘉定區(qū)和松江區(qū)的豬場進行檢測，結(jié)果陽性率分別為56.07%和47.76%，其中前者在上次調(diào)查結(jié)果范圍之內(nèi)，后者比前次調(diào)查結(jié)果低，這可能與檢測豬年齡較大有關(guān)，但仍然提示上海市不同地域豬隱孢子蟲感染率普遍較高。不同場之間感染率略有差別，長寧區(qū)某屠宰場豬的陽性率高于嘉定區(qū)和松江區(qū)，這可能與豬個體差異、飼喂條件、生長環(huán)境以及運輸過程中的差異有關(guān)，具體的原因有待于進一步分析。從不同月份來看，感染率要高于秋季，這與隱孢子蟲病在溫暖潮濕季節(jié)多發(fā)的流行特點相吻合。上海市溫暖潮濕的季節(jié)較長，因此要特別注意本病的流行，加強管理，做好衛(wèi)生，降低損失。在后續(xù)的研究中，本實驗室將繼續(xù)采集更多的樣品進行檢測，并與利用其他抗原建立的免疫學(xué)診斷方法進行比較，以更好地評價其診斷效果，為最終構(gòu)建試劑盒，應(yīng)用于生產(chǎn)實踐奠定基礎(chǔ)。同時，將進一步對其他動物樣品，比如牛、雞、鼠等進行檢測，觀察對這些動物樣品的檢測效果，擴大其使用范圍，為動物隱孢子蟲病防控提供技術(shù)支持。

綜上所述，本研究采用重組表達(dá)的CP15/60蛋白，建立了檢測豬隱孢子蟲感染的rCP15/60-ELISA方法，經(jīng)與Nested PCR法比較，顯示該方法具有較好的敏感性、特異性和重復(fù)性。診斷抗原rCP15/60易純化、產(chǎn)量高、操作簡便、生產(chǎn)成本低，為rCP15160-ELISA試劑盒研發(fā)奠定了堅實基礎(chǔ)。

致謝:本論文受上海市閔行區(qū)高層次人才科研項目資助；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所馬志永研究員、周艷君研究員和王權(quán)研究員分別為本研究提供了豬瘟病毒感染豬血清、豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染豬血清和弓形蟲感染豬血清，特此表示衷心的感謝。

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DEVELOPMENT OF INDIRECT ELISA WITH RECOMBINANT CP15/60 OF CRYPTOSPORIDIUM PARVUM AND SEROLOGICAL SURVEY OF PIG CRYPTOSPORIDIOSIS IN SHANGHAI

LIU Yu-xuan1， MI Rong-sheng1，2， HUANG Yan1，2， YU Hui-zhu1， HU Pan1， ZHAN Ting-ting1，ZHOU Jin-lin1，2， CHEN Zhao-guo1，2
（1. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Animal Products on Biohazards （Shanghai）， Ministry of Agriculture， Key Laboratory of Animal Parasitology， Ministry of Agriculture， Shanghai Veterinary Research Institute， CAAS， Shanghai 200241， China； 2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses， Yangzhou 225009，China）

To develop sensitive and specific serological detection method of pig Cryptosporidium infection and understand the situation of Cryptosporidium infection in pigs in Shanghai， an indirect ELISA method were developed to detect Cryptosporidium infection in pigs with the recombinant CP15/60 （rCP15/60） protein as diagnostic antigen. The reproducibility， sensitivity and specificity of the method were evaluated. The situation of pigs Cryptosporidium infection were serological detected with the developed method. The result showed that comparing with Nested PCR detection results， the negative and positive coincidence， sensitivity and specificity were 83.3%，100% and 80%， respectively. The coefficient of variability of reproducibility was≤12.5%. Total of 194 （56.89%） sera were positive in 341 sera collected from pigs in field in Shanghai. These results indicated that the method was suitable to be used as laboratory primary diagnosis and field serological survey of porcine cryptosporidiosis.

Cryptosporidium parvum； recombinant CP15/60； indirect ELISA； survey

S852.723

A

1674-6422 （2015）04-0037-07

2015-03-03

國家科技重大專項項目（2012ZX10004220）；2015年國家畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估項目（GJFP201500803）；家畜疫病家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室開放基金課題（SKLVEB2013KFKT017）；上海市科技興農(nóng)重點攻關(guān)項目（滬農(nóng)科攻字［2005］第1-10號［2005］第3-4號）

劉宇軒，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

陳兆國，E-mail:zhaoguochen@shvri.ac.cn