王少輝，劉萍萍，魏建超，邵東華，史子學(xué)，李蓓蓓，馬志永

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

上海市動物源性食品中單增李斯特菌的流行病學(xué)及生物被膜形成能力研究

王少輝，劉萍萍，魏建超，邵東華，史子學(xué)，李蓓蓓，馬志永

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

為了解上海市動物源性食品中單增李斯特菌的污染狀況，在上海市不同超市和農(nóng)貿(mào)市場采集479份動物源性食品樣品，依據(jù)國標(biāo)方法進(jìn)行菌株分離，并對分離菌株的耐藥性、血清型及生物被膜形成能力進(jìn)行測定。結(jié)果共分離鑒定34株單增李斯特菌，分離率為7.1%（34/479）。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示單增李斯特菌分離株的耐藥率雖然不高，但日趨嚴(yán)重，對氨芐青霉素和萬古霉素均敏感，對頭孢曲松的耐藥性最高（55.88%），林可霉素次之（41.18%）。血清型鑒定表明單增李斯特菌分離株以血清型1/2a（3a）型為主（76.47%），血清型1/2c（3c）次之（17.65%），而致病性強(qiáng)的血清型4b（4d、4e）僅占2.94%。生物被膜形成能力實(shí)驗(yàn)表明，所有的菌株均能形成生物被膜，其中76.47%（26/34）分離株生物被膜形成能力微弱。上海市動物源性食品中單增李斯特菌污染情況較為嚴(yán)重，主要流行1/2a（3a）血清型，耐藥率日趨嚴(yán)重，均可形成生物被膜。因此，應(yīng)加強(qiáng)對動物源性食品中單增李斯特菌的監(jiān)控。

單增李斯特菌；耐藥性；血清型；生物被膜

單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）又稱單增李斯特菌，是一種胞內(nèi)寄生的革蘭陽性桿菌。LM是重要的人獸共患病原菌，是危害嚴(yán)重的食源性疾病致病菌之一。近年來，由LM引起的食物中毒的情況日趨嚴(yán)重，在歐美等地由此菌造成的食物污染程度和病例已大大超過沙門菌［1-3］。李斯特菌病雖發(fā)病率不高，但其致死率（20%～30%）遠(yuǎn)高于其他常見食源性病原菌［4，5］。因此，應(yīng)加強(qiáng)對食品中LM的檢測及監(jiān)控，為該病的防控提供理論依據(jù)。

本研究依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)對上海市的超市和農(nóng)貿(mào)市場的動物源性食品進(jìn)行了抽樣調(diào)查，并對分離得到的LM菌株進(jìn)行血清型及生物被膜形成能力分析，更深入了解動物源性食品中LM的流行情況，為預(yù)防人感染 LM 提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品收集和標(biāo)準(zhǔn)菌株 2011年6月～2012年6月分別在上海市大型超市、農(nóng)貿(mào)市場、菜市場采集生肉類、散裝熟肉制品、生奶等各類食品共479份樣品，用于菌株分離鑒定。LM菌株10403s、EGDe、英諾克李斯特菌（L.innocua）（ATCC33090）由浙江大學(xué)方維煥教授惠贈［6］；單增李斯特菌CVCC 53004購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心。

1.2 試劑和儀器 腦心浸液培養(yǎng)基（Brain Heart Infusion，BHI）、PALCAM選擇性培養(yǎng)基均購自青島海博生物技術(shù)公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、2×PCR MasterMix及DNA Marker均購自天根（北京）生物科技有限公司；藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司；PCR儀購自Applied Biosystems公司；核酸電泳儀購自北京市六一儀器廠；凝膠成像分析儀購自Bio-Rad公司；多功能酶標(biāo)儀購自BioTek公司。

1.3 LM的分離鑒定 參照國標(biāo)（GB/T4789.30-2008）方法略加修改后進(jìn)行LM的分離及鑒定。將樣品進(jìn)行預(yù)增菌，取增菌液劃線接種于PALCAM選擇性瓊脂平板，培養(yǎng)24～48 h，挑選黑色或者灰綠色疑似單菌落，37℃培養(yǎng)。然后采用PCR方法擴(kuò)增LM溶血素基因hly，引物見表1。

表 1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 細(xì)菌基因組的提取 根據(jù)DNA提取試劑盒根生化科技有限公司）說明書提取LM的基因組，-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將LM分離株以1:100比例接種于5 mL BHI培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，取菌液致密劃線于BHI瓊脂平板表面，將藥敏片貼于培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑。根據(jù)美國臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)判定LM分離株的藥物敏感性。

1.6 血清型分型 參照文獻(xiàn)［7，8］中方法，根據(jù)lmo0737、lmo1118、ORF2819、ORF2110、prs五個基因序列設(shè)計(jì)并合成引物（表1），采用PCR方法對LM分離株進(jìn)行血清型分型。

1.7 生物被膜形成能力分析 將LM在相同條件下培養(yǎng)，調(diào)節(jié)OD600=0.3，然后1:100稀釋，加入96孔聚苯乙烯微孔板，每孔200 μL，每個樣品6個重復(fù)，37℃靜置培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)液，無菌PBS清洗3次除去浮游菌體，然后加入200 μL結(jié)晶紫染色1 h。PBS清洗3次，自然風(fēng)干，加入200 μL 95%乙醇作用5～10 min，測定OD595，以無菌培養(yǎng)基作為陰性對照。

參照Stepanovic等［9］的方法，分析各個菌株生物被膜形成能力。以陰性對照的平均OD值加上3倍的標(biāo)準(zhǔn)差（s）即ODc為基準(zhǔn)，OD＜ODc為不形成生物被膜；1ODc＜OD＜2ODc為弱生物被膜形成能力；2ODc＜OD＜4ODc為形成生物被膜能力中等；OD＞4ODc則為強(qiáng)生物被膜形成能力。

2 結(jié)果

2.1 LM 在動物源性食品中的分布 對上海市超市和農(nóng)貿(mào)市場的479份動物源性食品樣品進(jìn)行分析，經(jīng)預(yù)增菌、顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)、PCR鑒定（圖1），最終分離得到34株LM，分離率為7.1%（34/479）。通過分析顯示LM主要分布于雞肉產(chǎn)品中，在牛肉產(chǎn)品中分離率較低（表2）。

表 2 LM 在不同樣品中的分布Table 2 Distribution of LM strains in the different samples

圖 1 單增李斯特菌 hly 基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The PCR amplification result of hly gene of Listeria monocytogenes

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 選用β-內(nèi)酰胺類抗生素、氨基糖苷類抗生素、四環(huán)素類抗生素、氯霉素類抗生素、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、喹諾酮類藥物抗菌藥物對分離得到的LM分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果見表3。結(jié)果表明LM分離株對氨芐青霉素和萬古霉素均敏感；對頭孢曲松的耐藥性最高（55.88%），林可霉素次之（41.18%）。

2.3 LM的血清型分型 采用PCR方法對LM菌株進(jìn)行血清型分型，結(jié)果顯示血清型1/2a（3a），占76.47%（26/34）；血清型1/2c（3c）占17.65%（6/34）；血清型1/2b（3b、7）和血清型4b（4d、4e）各占2.94%（1/34）（表4）。結(jié)果表明，上海市動物源性食品中主要污染致病性較弱的1/2a（3a）血清型LM。

2.4 生物被膜形成能力分析 利用96孔微孔板法定量分析LM的生物被膜形成能力，結(jié)果顯示所有的LM分離株能形成生物被膜，其中5.9%（2/34）LM分離株具有強(qiáng)生物被膜形成能力；17.6%（6/34）LM分離株具有中等生物被膜能力；76.47%（26/34）LM分離株具有微弱形成生物被膜能力（圖2，表4）。

表 3 LM 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of antibiotic sensitivity test of LM isolates

表 4 單增李斯特菌的血清型、生物被膜形成能力及來源分析Table 4 The serotype， biofilm-forming capacity and source of LM strains

圖 2 單增李斯特菌的生物被膜形成能力Fig.2 The biofilm formation capacities of the LM strains

3 討論

LM是四大食源性病原菌（其他三個為沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7、空腸彎曲桿菌）之一，能引起人畜李斯特菌病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多等癥狀［5］。近年來，由LM引起的食物中毒的情況日趨嚴(yán)重，在歐美等地由LM造成的食物污染程度和病例已大大超過沙門菌［1-3］。本研究對上海市動物源性食品中LM流行狀況進(jìn)行了分析，479份樣品經(jīng)預(yù)增菌、分離鑒定，最終分離得到34株LM，分離率為7.1%（34/479）。所采集的5類樣品中均分離到了LM，其中雞的副產(chǎn)品中分離率最高（表2）。國內(nèi)不同研究人員對全國各地食品中LM污染情況進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果表明LM分離率不盡相同，但在生肉中分離率都較高［10］。靳曉燕等［11］的研究結(jié)果顯示保定地區(qū)生肉污染率高達(dá)32.4%。國外研究人員對不同樣品中的LM污染情況進(jìn)行了分析，顯示不同地區(qū)的食品中均不同程度存在LM污染［3，12，13］。由此表明，LM在食品中污染較為嚴(yán)重，威脅著食品安全和人類健康。

近年來，由于抗生素的廣泛過量使用導(dǎo)致細(xì)菌（包括各類食源性病原菌）的耐藥性日益嚴(yán)重，給臨床用藥帶來很大困難。本研究對LM分離株的耐藥性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明LM分離株對多數(shù)抗生素耐藥性不高，其中對氨芐青霉素和萬古霉素菌完全敏感。與其他研究［14］相比，LM對抗生素的耐藥性逐漸增加，可能是由為動物養(yǎng)殖過程中抗生素的不合理使用導(dǎo)致的。血清分型是一種傳統(tǒng)的細(xì)菌分型方法，LM分為16個血清型，其中血清型4b毒力最強(qiáng)，引起絕大多數(shù)暴發(fā)病例，而血清型1/2a通常在食品中分離率最高［15，16］。本研究采用PCR方法對分離得到的LM進(jìn)行分型，結(jié)果表明動物源性食品中LM主要是血清型1/2a（3a），占總分離株的76.47%，血清型1/2c（3c）次之，而致病力最強(qiáng)的4b較少，與國內(nèi)外報(bào)道的結(jié)果基本一致［3，12，13］。生物被膜是細(xì)菌為適應(yīng)外界環(huán)境變化而選擇的一種與浮游形式不同的生長方式，主要由附著于惰性或活性實(shí)體表面的細(xì)菌細(xì)胞和包裹著細(xì)菌的水合性基質(zhì)所組成的結(jié)構(gòu)性細(xì)菌群落。生物被膜一旦形成將很難清除，不僅能增強(qiáng)LM對藥物的抵抗力，還可以提高LM在食品的加工、消毒處理過程中的抵抗力，威脅食品安全等［17，20］。研究表明，血清型1/2a、1/2c的生物被膜形成能力較強(qiáng)，但是不同血清型之間的生物被膜形成能力之間沒有太大區(qū)別［21］。本研究表明，LM分離株均能夠形成生物被膜，有利于LM在食品加工、存儲環(huán)境中長期定殖生存，從而不斷地污染動物源性食品。

通過對上海市動物源性食品的檢測，發(fā)現(xiàn)LM污染情況較為嚴(yán)重，主要流行1/2a（3a）血清型，且耐藥性日趨嚴(yán)重，已經(jīng)嚴(yán)重威脅食品安全。生物被膜實(shí)驗(yàn)表明所有的LM分離株能夠形成生物被膜，從而導(dǎo)致食品不斷被LM污染。因此，應(yīng)加強(qiáng)對食品中LM的監(jiān)控，為該病的防控提供理論依據(jù)。

［1］Soto Beltran M， Gerba C P， Porto Fett A， et al. Prevalence and characterization of Listeria monocytogenes， Salmonella and Shiga toxin-producing Escherichia coli isolated from small Mexican retail markets of queso fresco［J］. Int J Environ Health Res， 2014: 1-9.

［2］Osaili T M， Al-Nabulsi A A， Shaker R R， et al. Prevalence of Salmonella serovars， Listeria monocytogenes， and Escherichia coli O157:H7 in Mediterranean ready-to-eat meat products in Jordan［J］. J Food Prot， 2014， 77（1）: 106-111.

［3］Awaisheh S S. Survey of Listeria monocytogenes and other Listeria sp. contamination in different common ready-to-eat food products in Jordan［J］. Pak J Biol Sci， 2009， 12（23）: 1491-1497.

［4］Liu D. Identification， subtyping and virulence determination of Listeria monocytogenes， an important foodborne pathogen［J］. J Med Microbiol， 2006， 55（Pt 6）: 645-659.

［5］Mammina C， Aleo A， Romani C， et al. Characterization of Listeria monocytogenes isolates from human listeriosis cases in Italy［J］. J Clin Microbiol， 2009， 47（9）: 2925-2930.

［6］Becavin C， Bouchier C， Lechat P， et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD， 10403S，and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity［J］. MBio， 2014，5（2）: e00969-14.

［7］Kerouanton A， Marault M， Petit L， et al. Evaluation of a multiplex PCR assay as an alternative method for Listeria monocytogenes serotyping［J］. J Microbiol Methods， 2010，80（2）: 134-137.

［8］Doumith M， Buchrieser C， Glaser P， et al. Differentiation of the major Listeria monocytogenes serovars by multiplex PCR［J］. J Clin Microbiol， 2004， 42（8）: 3819-3822.

［9］Stepanovic S， Cirkovic I， Ranin L， et al. Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface［J］. Lett Appl Microbiol， 2004， 38（5）: 428-432.

［10］Chen J， Zhang X， Mei L， et al. Prevalence of Listeria in Chinese food products from 13 provinces between 2000 and 2007 and virulence characterization of Listeria monocytogenes isolates［J］. Foodborne Pathog Dis， 2009， 6（1）: 7-14.

［11］靳曉燕， 韓軍， 于宏偉， 等. 食品中單核增生性李斯特菌污染狀況研究［J］.中國食品學(xué)報(bào)， 2009， 9（1）: 226-231.

［12］Kotzekidou P. Survey of Listeria monocytogenes，Salmonella spp. and Escherichia coli O157:H7 in raw ingredients and ready-to-eat products by commercial real-time PCR kits［J］. Food Microbiol， 2013， 35（2）: 86-91.

［13］Gombas D E， Chen Y， Clavero R S， et al. Survey of Listeria monocytogenes in ready-to-eat foods［J］. J Food Prot， 2003，66（4）: 559-569.

［14］張麗萍， 張克儉， 高濤， 等. 食源性LM血清分型及耐藥性的研究［J］. 實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)， 2013， 20（5）: 611-613.

［15］Benjelloum O， Sanchez Alvarez J E， Rodriguez Suarez C，et al. Listeria monocytogenes: an infrequent cause of peritonitis in peritoneal dialysis［J］. Nefrologia， 2011， 31（3）: 362-365.

［16］Ward T J， Usgaard T， Evans P. A targeted multilocus genotyping assay for lineage， serogroup， and epidemic clone typing of Listeria monocytogenes［J］. Appl Environ Microbiol， 2010， 76（19）: 6680-6684.

［17］Takahashi H， Miya S， Igarashi K， et al. Biofilm formation ability of Listeria monocytogenes isolates from raw ready-to-eat seafood［J］. J Food Prot， 2009， 72（7）: 1476-1480.

［18］Rodriguez A， Autio W R， McLandsborough L A. Effect of biofilm dryness on the transfer of Listeria monocytogenes biofilms grown on stainless steel to bologna and hard salami［J］. J Food Prot， 2007， 70（11）: 2480-2484.

［19］Wong A C. Biofilms in food processing environments［J］. J Dairy Sc， 1998， 81（10）: 2765-2770.

［20］Schlegelova J， Karpiskova S. Microbial biofilms in the food industry［J］. Epidemiol Mikrobiol Imunol， 2007， 56（1）: 14-19.

［21］Harvey J， Keenan K P， Gilmour A. Assessing biofilm formation by Listeria monocytogenes strains［J］. Food Microbiol， 2007， 24（4）: 380-392.

EPIDEMIOLOGY AND BIOFILM-FORMATION CAPACITY OF LISTERIA MONOCYTOGENES FROM ANIMAL ORIGIN FOOD IN SHANGHAI

WANG Shao-hui， LIU Ping-ping， WEI Jian-chao， SHAO Dong-hua，SHI Zi-xue， LI Bei-bei， MA Zhi-yong
（Shanghai Veterinary Research Institute， CAAS， Shanghai 200241， China）

This study was performed to investigate the contamination of Listeria monocytogenes （LM） in animal origin food in Shanghai， which gained further insights on the public health risk caused by this food borne pathogen. A total of 479 animal origin food samples were screened for LM. Then， the antibiotic sensitivity， serotype and biofilm formation of each isolate were determined. The results showed that 34 LM strains were isolated from 479 samples， which accounted for 7.1%. The antibiotics resistance tests showed that resistant rate of LM isolates were not high. All LM isolates were sensitive to ampicillin and vancomycin. However， 55.88% isolates were resistant rate to ceftriaxone， followed by lincomycin （41.18%）. Serotying results showed that 76.47% LM strains were belonged to serovar 1/2a（3a）， followed by serovar 1/2c（3c）. Whereas， only one isolate （2.94%） was the pathogenic serotype 4b（4d、4e）. Bioilm formation assays showed that all the LM isolates could produce biofilm， in which 76.47%（26/34）were weak biofilm producers. These results indicated that animal origin food was contatiminated by LM， and the biofilm will increase the chances of LM contamination. Thus， it is necessary to inspect and survey the contamination by LM on farms and in abattoirs to reduce the incidence of foodborne infections in humans.

Listeria monocytogenes； resistance antibiotics； serotype； biofilm

S852.615

A

1674-6422 （2015）04-0031-06

2015-03-04

國家自然科學(xué)基金（81201266）

王少輝，男，副研究員，主要從事畜禽細(xì)菌性傳染病研究

馬志永，E-mail:zhiyongma@shvri.ac.cn