付 燕，熊若虹，袁瓊嘉，李 雪

1.Chengdu Sport University，Chengdu Sichuan 610041;2.Southwest University for Nationalities，Chengdu Sichuan 610041

運(yùn)動(dòng)性月經(jīng)失調(diào)是女運(yùn)動(dòng)員因長時(shí)間超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)而引起的一種運(yùn)動(dòng)性病癥。研究發(fā)現(xiàn)它不僅與女運(yùn)動(dòng)員的生殖功能下降有關(guān)，而且與心血管疾病、骨質(zhì)疏松等病癥也緊密相關(guān)［1-8］，嚴(yán)重影響到女運(yùn)動(dòng)員的競技水平與身心健康。因此，如何防治運(yùn)動(dòng)性月經(jīng)失調(diào)受到越來越多的國內(nèi)外有關(guān)學(xué)者的關(guān)注和重視。國內(nèi)有許多學(xué)者嘗試運(yùn)用祖國傳統(tǒng)中醫(yī)藥方法如中藥制劑、針灸等對運(yùn)動(dòng)性月經(jīng)失調(diào)進(jìn)行防治，并顯示出它的潛力［9-11］。但是，關(guān)于其具體作用機(jī)制目前研究較少，沒能提供充分的科學(xué)依據(jù)，使其不能得到有效推廣。本課題應(yīng)用中藥蓯蓉菟絲子煎劑對長期力竭游泳運(yùn)動(dòng)大鼠進(jìn)行干預(yù)，借助HE染色、透射電鏡等技術(shù)觀察蓯蓉菟絲子湯干預(yù)下長期力竭運(yùn)動(dòng)大鼠卵巢形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，探討該方劑對運(yùn)動(dòng)性月經(jīng)失調(diào)的預(yù)防效果及作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級3月齡健康雌性 SD大鼠36只，體重206.21±15.12g，未曾交配，購自成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證:SYXK(川)2012-179。大鼠常規(guī)分籠飼養(yǎng)，自然光照，自由飲水、攝食，國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料飼養(yǎng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)用藥

所用中藥蓯蓉菟絲子煎劑為熊若虹教授經(jīng)驗(yàn)方。方中以肉蓯蓉、菟絲子為主要成分，配伍紫河車、枸杞、當(dāng)歸等。所有中藥材購于四川省醫(yī)藥公司中藥材采購站。按處方稱取116g生藥材，置于陶瓷煎鍋內(nèi)，加水至淹沒藥面5cm(約1 000ml)，浸泡1小時(shí)后武火煮沸，再用文火煎60分鐘，濾出藥液;再加入開水300mL，繼續(xù)文火煎30分鐘后將藥液濾出。將兩次濾藥合并，靜置沉淀，再濾過，加熱濃縮濾液至100mL，最終制成濃度為1.16g原生藥/mL的水煎劑［12］。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組和干預(yù)措施

將36只大鼠隨機(jī)分成三組:安靜對照組(Q組)、運(yùn)動(dòng)對照組(S組)、中藥干預(yù)組(M組)，每組12只。S組和M組大鼠進(jìn)行3天適應(yīng)性游泳運(yùn)動(dòng)后，每日負(fù)重(負(fù)重量為自身體重的3%)進(jìn)行一次大強(qiáng)度游泳運(yùn)動(dòng)，每周運(yùn)動(dòng)6天休息1天，持續(xù)5周。每次運(yùn)動(dòng)終止標(biāo)準(zhǔn)為:游泳動(dòng)作出現(xiàn)明顯失調(diào)，原地打轉(zhuǎn)、不能再堅(jiān)持或沉入水底超過10秒不能回到水面，撈出水后表現(xiàn)為呼吸急促、靜臥不動(dòng)，翻正反射減弱甚至消失［12-14］。大強(qiáng)度游泳運(yùn)動(dòng)期間，M組大鼠每日灌喂一次蓯蓉菟絲子煎劑，劑量為25mL/kg體重，Q組和S組大鼠則每日灌喂一次同容積劑量的生理鹽水。每日早晨7∶00-8∶00時(shí)制備大鼠陰道脫落細(xì)胞涂片，用瑞氏染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察，以監(jiān)測大鼠動(dòng)情周期的變化。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在成都體育學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2.2 標(biāo)本制備與指標(biāo)檢測

標(biāo)本采集于S組和M組大鼠持續(xù)5周的大強(qiáng)度游泳運(yùn)動(dòng)結(jié)束后的24-72小時(shí)內(nèi)、各大鼠處于動(dòng)情間期時(shí)進(jìn)行。將大鼠用20g/L的戊巴比妥腹腔注射的方法進(jìn)行麻醉后，在股動(dòng)脈處取血2mL，并分離出兩側(cè)卵巢，將兩卵巢分別固定于10%中性甲醛溶液和3%戊二醛溶液中，以備制作卵巢光鏡切片和電鏡切片。

(1)卵巢光鏡切片的制備與觀察。

將固定在10%中性甲醛溶液中的卵巢于24h后取出，充分水洗后用70%-100%乙醇梯度脫水，二甲苯透明、浸臘、包埋，5μm厚連續(xù)切片，將切片緊貼于APES處理過的載玻片上，常規(guī)蘇木精-伊紅染色［16］，用普通光學(xué)顯微鏡觀察卵巢的組織形態(tài)。每個(gè)卵巢間斷取片3張，在低倍鏡下計(jì)數(shù)生長卵泡(包括初級、次級卵泡)、成熟卵泡、閉鎖卵泡以及新鮮黃體數(shù)，取平均值。

(2)卵巢電鏡切片的制備與觀察。

將固定在3%戊二醛溶液中的卵巢于48h后取出，PBS液充分換洗后用1%四氧化鋨固定1h，PBS液沖洗，30%-100%丙酮梯度脫水，環(huán)氧丙烷浸泡5h，Epon812定向包埋，半薄切片光學(xué)定位后用超薄切片機(jī)切片，片厚50nm，將其貼附于載網(wǎng)上，用醋酸鈾及枸櫞酸鉛進(jìn)行雙重染色［16］，然后用透射電鏡觀察卵巢細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

(3)血液標(biāo)本的制備與測定。

將動(dòng)脈血離心后取其血漿，采用放射免疫分析法測定血漿中雌二醇(estradiol，E2)和孕激素(progesterone，P)濃度，所使用的試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，具體操作按照免疫試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSSfor Windows 17.5軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)值以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”(±s)表示，應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行組間差異比較，P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)期間，S組和M組各有2只大鼠死亡，其死亡原因均為游泳過程中嗆水而致。最終，Q組12只、S組10只、M組10只納入結(jié)果分析。

2.1 大鼠一般情況

Q組、M組大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間總體發(fā)育良好，毛發(fā)光潔，活潑好動(dòng)，反應(yīng)靈敏;S組大鼠在大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練期間逐漸出現(xiàn)拱背穹起、反應(yīng)遲鈍、精神萎靡、易受驚嚇、攝食減少等現(xiàn)象。在大強(qiáng)度游泳運(yùn)動(dòng)/中藥干預(yù)前以及干預(yù)期間的第1周末，三組大鼠體重?zé)o顯著性差異;從第2周末開始至取材前，S組大鼠體重顯著性低于Q組(P＜0.05);M組大鼠從第3周末開始至取材前，顯著性高于S組(P＜0.05)(見圖1)。在訓(xùn)練的開始階段，兩組大鼠運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間無顯著性差異，但隨著大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)的持續(xù)進(jìn)行，S組大鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)間逐漸縮短，而M組大鼠在整個(gè)訓(xùn)練期間則無明顯變化;從大強(qiáng)度訓(xùn)練的第3周至取材前，M組大鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)間顯著性長于S組(P＜0.05)(見圖2)。

圖1 大鼠體重變化

圖2 大鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)間變化

2.2 大鼠動(dòng)情周期變化情況

在大強(qiáng)度游泳運(yùn)動(dòng)持續(xù)2-4周左右時(shí)，S組大鼠開始陸續(xù)出現(xiàn)動(dòng)情周期紊亂現(xiàn)象，開始以動(dòng)情周期縮短(≤3天)為主要表現(xiàn)，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閯?dòng)情周期延長(≥6天)為主，部分大鼠甚至表現(xiàn)為持續(xù)動(dòng)情間期。取材前各組大鼠動(dòng)情周期變化情況見表1。

2.3 卵巢大體形態(tài)觀察

Q組大鼠卵巢呈卵圓型，淡紅色，亮澤，形態(tài)飽滿，表面可見多個(gè)突起的大小不等的結(jié)節(jié);與Q組相比，S組大鼠卵巢顏色較為蒼白，有萎縮，表面結(jié)節(jié)較少;而M組卵巢形態(tài)與安靜對照組相似，飽滿亮澤，表面可見多個(gè)大小不等的結(jié)節(jié)突起。

2.4 卵巢組織形態(tài)觀察

Q組大鼠卵巢皮質(zhì)較厚，內(nèi)有豐富的處于不同發(fā)展階段的卵泡以及新鮮黃體，間質(zhì)內(nèi)血管豐富。S組大鼠卵巢皮質(zhì)較薄，典型生長卵泡、成熟卵泡以及新鮮黃體都較Q組少(P＜0.05;P＜0.01)，而閉鎖卵泡則明顯增多(P＜0.05)較多卵泡明顯發(fā)育不良，外形扭曲，顆粒層細(xì)胞層次較少，排列紊亂，間質(zhì)內(nèi)有不同程度的纖維化以及淋巴細(xì)胞浸潤，血管分布較少。與S組相比，M組大鼠各級生長卵泡和成熟卵泡的數(shù)量以及新鮮黃體的數(shù)量都表現(xiàn)出不同程度增加(P＜0.05;P＜0.01)，偶可見到發(fā)育不良的囊狀擴(kuò)張的卵泡，間質(zhì)血管豐富，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤及纖維化。(見圖3、表2)

圖3 大鼠卵巢組織形態(tài)結(jié)構(gòu)(蘇木精-伊紅染色，×200)

表2 各組大鼠卵巢卵泡和黃體的比較(±s)

表2 各組大鼠卵巢卵泡和黃體的比較(±s)

注:*與Q組相比，P＜0.05;＊＊與Q組相比，P＜0.01;◆與S組相比，P＜0.05;◆◆與S組相比，P＜0.01。

組別 n 生長卵泡 成熟卵泡 閉鎖卵泡 新鮮黃體Q 12 9.89±2.03 3.34±0.96 5.24±1.65 5.05±1.35 S 10 4.57±2.49*＊ 1.68±0.73＊＊ 9.02±2.94* 2.90±1.21*M 10 8.96±2.18◆ 3.67±1.08◆ 6.04±2.55◆◆ 5.26±1.37◆◆

2.5 卵巢顆粒細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

Q組大鼠卵巢卵泡顆粒細(xì)胞的細(xì)胞核多為圓形，體積較大，核仁明顯，核染色質(zhì)均勻分布在胞核中;胞漿中可見許多分布均勻的管狀嵴線粒體和交織成網(wǎng)的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，少量脂滴散在分布在胞漿中;在顆粒細(xì)胞之間，還可觀察到有橋粒、縫隙連接等細(xì)胞連接。S組卵泡顆粒細(xì)胞核多不規(guī)整，核漿比例較安靜對照組小，核膜凹陷有切跡現(xiàn)象，核染色質(zhì)染色較深，有凝聚現(xiàn)象;胞漿中線粒體、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器明顯減少，線粒體呈現(xiàn)出不同程度的腫脹，線粒嵴部分?jǐn)嗔焉踔料?胞漿內(nèi)有大量脂滴積聚。M組顆粒細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)接近于Q組，細(xì)胞核較大，核染色質(zhì)均勻分布，胞漿中有豐富的線粒體、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體等細(xì)胞器以及散在分布的脂滴。(見圖4)

圖4 大鼠卵巢細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(醋酸鈾及枸櫞酸鉛染色，×6 000)

2.6 血清生殖激素測定

從表3中數(shù)據(jù)可以看出，與Q組相比，S組大鼠血清E2、P水平均出現(xiàn)明顯下降(P＜0.05;P＜0.01);M組E2、P平均水平則比S組高(P＜0.05);而M組與Q組之間兩種激素水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

表3 血清生殖激素測定結(jié)果(±s)

表3 血清生殖激素測定結(jié)果(±s)

注:*與Q組相比，P＜0.05;◆與S組相比，P＜0.05。

組別 n E2(ng/ml) P(pg/ml)Q 12 1.56±0.32 73.81±20.12 S 10 1.17±0.54* 40.70±17.45*M 10 1.69±0.67◆ 78.14±24.80◆

3 討論

大量研究證實(shí)，血清雌激素、孕激素水平降低是長時(shí)間、大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)性月經(jīng)失調(diào)/動(dòng)情周期紊亂時(shí)最為常見的機(jī)體生理生化反應(yīng)［4，7.13，16，17］，這提示在運(yùn)動(dòng)性月經(jīng)失調(diào)/動(dòng)情周期紊亂的發(fā)生與雌激素、孕激素分泌抑制密切相關(guān)。雌激素、孕激素屬類固醇激素，主要由女性/雌性的性腺卵巢所分泌。卵巢的卵泡和黃體是分泌雌激素和孕激素的結(jié)構(gòu)單位，其中雌激素是主要由生長卵泡、成熟卵泡的顆粒細(xì)胞以及排卵后分化而成的黃體顆粒細(xì)胞合成與分泌，主要為雌二醇;孕激素則主要是由黃體顆粒細(xì)胞所分泌，以孕酮為其主要成分［18］。因此，卵巢內(nèi)卵泡和黃體數(shù)量的多少以及顆粒細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)是決定雌激素、孕激素能否正常分泌的物質(zhì)基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)動(dòng)對照組的大鼠在長期大強(qiáng)度游泳過程中，動(dòng)情周期陸續(xù)出現(xiàn)紊亂;與具有正常動(dòng)情周期的安靜對照組大鼠相比，其血漿中的雌激素(雌二醇)、孕激素水平出現(xiàn)顯著性下降，這與筆者前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及其他學(xué)者的同類研究結(jié)果一致［4，7，13，16，17］。而在光鏡下，筆者觀察到運(yùn)動(dòng)對照組大鼠卵巢的生長卵泡、成熟卵泡以及新鮮黃體都較安靜對照組顯著性減少而閉鎖卵泡明顯增多，并且還可見到較多卵泡明顯發(fā)育不良，顆粒層細(xì)胞層次較少;在電鏡下又發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)對照組卵巢顆粒細(xì)胞核多不規(guī)整，核漿比例較安靜對照組小，核膜凹陷有切跡現(xiàn)象，核染色質(zhì)染色較深，有凝聚現(xiàn)象;胞漿中參與類固醇激素合成的線粒體、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器明顯減少、變性而脂滴大量聚集。這表明了長期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對卵巢的卵泡發(fā)育、卵泡成熟、排卵等過程都具有抑制作用，并使卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)的代謝活動(dòng)產(chǎn)生不良變化，這將導(dǎo)致卵巢細(xì)胞分泌雌激素、孕激素功能抑制，使血漿中雌激素(雌二醇)、孕激素水平出現(xiàn)明顯下降，進(jìn)而導(dǎo)致月經(jīng)周期或動(dòng)情周期的紊亂。

祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，長時(shí)間、大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練導(dǎo)致機(jī)體過度勞累引起肝腎不足，氣血兩虛是導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)性月經(jīng)失調(diào)的主要病機(jī)。腎主骨，肝主筋。女運(yùn)動(dòng)員在長時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中，因“久立傷骨，久行傷筋(《素問·宣明五氣篇》)”，骨傷則腎傷，筋傷則肝傷，肝腎不足，氣血兩虛，直至沖任受損而發(fā)生月經(jīng)失調(diào)［9，19，20］。本次實(shí)驗(yàn)中所用中藥蓯蓉菟絲子煎劑主要由肉蓯蓉、菟絲子配伍枸杞、紫河車、當(dāng)歸等藥材而組成。其中肉蓯蓉入腎經(jīng)，補(bǔ)命門，滋潤五臟，益髓強(qiáng)筋，可治療五勞七傷，具有補(bǔ)肝腎、填精益髓、溫腎暖宮、調(diào)理臟腑陰陽等的功能;菟絲子歸肝腎脾經(jīng)，可補(bǔ)肝腎益精養(yǎng)血，為補(bǔ)肝腎經(jīng)要藥;紫河車為血肉有情之品，入肺肝腎經(jīng)，能補(bǔ)精血益沖任;枸杞能滋肝腎之陰，為平補(bǔ)腎精肝血之品;當(dāng)歸補(bǔ)血活血，為補(bǔ)血調(diào)經(jīng)之圣藥。［21］蓯蓉菟絲子煎劑全方主要通過補(bǔ)肝腎、益氣血、調(diào)補(bǔ)沖任來對運(yùn)動(dòng)性月經(jīng)失調(diào)進(jìn)行防治。

與運(yùn)動(dòng)對照組相比，中藥干預(yù)組大鼠雖然同樣承受著長期力竭運(yùn)動(dòng)的影響，但其卵巢中各級生長卵泡和成熟卵泡的數(shù)量以及新鮮黃體的數(shù)量都表現(xiàn)為明顯的增加而閉鎖卵泡明顯降低。這說明本實(shí)驗(yàn)中所用方劑蓯蓉菟絲子煎劑可預(yù)防長期力竭運(yùn)動(dòng)對卵泡生長發(fā)育以及排卵的抑制作用，有效促進(jìn)卵巢卵泡的發(fā)育與成熟以及排卵功能。中藥干預(yù)組顆粒細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)也較運(yùn)動(dòng)對照組有明顯改變，細(xì)胞核較大，核染色質(zhì)均勻分布，胞漿中線粒體、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體等細(xì)胞器較為豐富，脂滴散在分布，這可表明蓯蓉菟絲子煎劑可改善卵巢細(xì)胞內(nèi)代謝水平，使其功能活性增強(qiáng)，有利于膽固醇轉(zhuǎn)化為雌激素、孕激素，促進(jìn)卵巢實(shí)質(zhì)細(xì)胞的內(nèi)分泌功能，防止長期力竭運(yùn)動(dòng)低性腺激素水平的狀態(tài)，調(diào)節(jié)女子月經(jīng)周期/動(dòng)情周期。

4 結(jié)論

長期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對卵巢的卵泡發(fā)育、成熟、排卵以及黃體的形成等過程具有抑制作用，并使卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不良變化，這會(huì)導(dǎo)致卵巢分泌雌激素、孕激素等性激素的功能發(fā)生障礙進(jìn)而影響月經(jīng)周期或動(dòng)情周期。蓯蓉菟絲子煎劑則可有效預(yù)防和改善長期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對卵巢卵泡發(fā)育和排卵以及黃體生成的抑制作用，改善卵巢課題細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)代謝水平，改善其分泌功能，使性激素合成功能增強(qiáng)，這有助于預(yù)防運(yùn)動(dòng)性月經(jīng)失調(diào)的發(fā)生。

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