申紅旗++魯夢雪++蔣紅艷

牙鲆、大菱鲆是我省海水養(yǎng)殖主要品種，近年來在養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中發(fā)生疫病時，使用抗菌類藥物往往效果不佳。為摸清上述魚病是否因病毒引起，今年4-5月，筆者采集了部分人工養(yǎng)殖的牙鲆、大菱鲆樣品，進行了魚傳染性造血器官壞死病病毒（IHNV）實驗室檢測，有關(guān)情況報告如下。

1 采樣

4月中下旬，從我省沿海6個海水魚養(yǎng)殖單位采集了牙鲆、大菱鲆成魚樣品11個，其中牙鲆樣品5個，大菱鲆樣品6個，每個樣品1.5 kg，冷藏運至實驗室。

2 實驗室檢驗

本實驗采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測方法。

2.1 IHNV的分離

2.1.1 制樣 按照GB/T18088-2000的規(guī)定，采取樣品魚的肝、腎、脾。

2.1.2 樣品處理 制好的樣品用組織勻漿器低溫勻漿。勻漿后的樣品按1∶10的最終稀釋度懸浮于細胞培養(yǎng)液（含有1 000 IU/mL的青霉素和1 000 μg/mL的鏈霉素）中，4 ℃孵育過夜。7 000 r/min離心15 min，收集上清液。

2.1.3 IHNV分離 處于對數(shù)生長期的FHM細胞以適宜密度接種至細胞培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)約24 h。收集的樣品上清液用細胞培養(yǎng)液再做兩次10倍稀釋，然后將適當體積的稀釋度為1∶10、1∶100、1∶1000的上清液分別接種至FHM單層細胞中（正對照為含陽性IHNV的病毒懸液；負對照為細胞培養(yǎng)液），17 ℃吸附1 h，再加入細胞培養(yǎng)液，置于17 ℃培養(yǎng)。7 d內(nèi)每天用導致顯微鏡觀察并記錄細胞是否出現(xiàn)病變。

2.2 IHNV鑒定

2.2.1 RNA提取及cDNA合成 將對照細胞和有CPE的細胞凍融一次，取凍融后的細胞懸液按GB/T 15805.2-2008的方法抽提RNA，抽提好的RNA按下列程序進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系及程序如下：

體系中加入10 μL模板，2.5 μLR1，2.5 μL水，共15 μL，70 ℃反應5 min，立即冰浴，瞬時離心；再加入5 μL逆轉(zhuǎn)錄酶濃縮緩沖液（5x），2 μLdNTPs，0.5 μL RI（20U），1 μL AMV（10U），1.5 μL 水，共25 μL ，42 ℃反應1 h，產(chǎn)物作為模板。

2.2.2 套式PCR 見表1。

反應體系在PCR擴增儀中按照94 ℃預變性4 min，再94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30次循環(huán)，然后72 ℃ 8 min，最后4 ℃保溫的程序反應。

2.2.3 瓊脂糖電泳 8 μL PCR產(chǎn)物+2 μL 5x loading buffer混樣，混好的樣點入TBE緩沖液配制成的1.5%的瓊脂糖凝膠孔內(nèi)，5 V/cm電泳約40 min。凝膠成像儀中觀察并拍照記錄。

3 檢驗結(jié)果

3.1 接種細胞培養(yǎng)結(jié)果

待測樣品接種細胞后3～4 d，編號0075、0076、0078、0079、0080的5個樣品細胞培養(yǎng)中出現(xiàn)細胞病變（CPE），0077未發(fā)生病變。見圖1 。

3.3 基因測序結(jié)果

5個陽性樣品PCR代謝物送有關(guān)單位基因測序，符合率98%。

4 小結(jié)

采集的11個牙鲆、大菱鲆樣品中，共檢出IHNV陽性5例，IHNV陽性檢出率為45.45%。其中牙鲆IHNV陽性2例，陽性率40.00%，大菱鲆牙鲆IHNV陽性3例，陽性率50.00%；6個養(yǎng)殖單位中有2個單位的樣品檢出IHNV陽性，檢出率為33.33%。詳見表2。

本次檢測實驗證明，我省養(yǎng)殖的部分牙鲆、大菱鲆體內(nèi)存在傳染性造血器官壞死病病毒。IHN是農(nóng)業(yè)部公告第1125號規(guī)定的二類水生動物疫病，具有很強的傳染性與危害。因此，在牙鲆、大菱鲆養(yǎng)殖苗種階段應做好檢疫工作，避免引進帶有IHNV陽性的魚苗。養(yǎng)殖過程中如發(fā)現(xiàn)魚眼球突出、渾身出血等癥狀，應考慮感染IHN疫病的可能性，使用聚維酮碘等抗病毒藥物進行防控。

（收稿日期：2015-08-31）