膠體金法與ELISA法檢測抗CCP抗體用于診斷
RA的比較研究

劉忠華，許松

黑龍江省雞西礦業(yè)集團總醫(yī)院檢驗科，黑龍江雞西158100

[摘要]目的比較兩種檢測抗CCP抗體方法的優(yōu)劣。方法用膠體金法與ELISA法對患者血清進行抗CCP抗體檢測，兩種方法結(jié)果不符的以臨床明確診斷確認。結(jié)果膠體金法靈敏度85%，特異性為97.5%，假陽性率2.5%，假陰性率為15%；同ELISA法比較得出陽性符合率為98.8%，陰性符合率為98.4%。結(jié)論兩種檢測方法的靈敏度和特異性無差異，均較高，

[關(guān)鍵詞]膠體金；ELISA；抗CCP抗體；類風濕性關(guān)節(jié)炎

[中圖分類號]R7

[文獻標識碼]A

[文章編號]1674-0742（2015）10（a）－0025-03

[作者簡介]劉忠華(1978.5-)，男，遼寧寬甸人，大專，主管檢驗師，研究方向：免疫學(xué)臨床應(yīng)用。

Abstract[]Objective To compare two methods to determine anti-CCP antibody for diagnosis of RA.Methods The serum anti-CCP antibody was detected with methods of GICA and ELISA, and their respective sensitivity and specificity were compared and the results were confermed with the clinical diagnosis.Results The sensitivity and specificity of anti-CCP antibody with the method of GICA were 85% , 97.5%.The false-positive and false-negative were 2.5%, 15%.The rates of positive and negative coincidences were 98.8%, 98.4%, respectively compaired with ELISA.Conclusions The sensitivity and specificity difference of two methods had no statistical significance.

收稿日期：（2015-07-07）

The Evaluation of Detection Anti-CCP Antibody with two Methods by GICA and ELISA for Diagnosis of RA

LIU Zhong-hua XU Song

[Key words]Gold colloid; ELISA；Anti-CCP antibody; Rheumatoid anthritis

類風濕關(guān)節(jié)炎( rheumatoid arthritis, RA)是常見的自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為主要表現(xiàn)。目前抗環(huán)瓜氨酸肽（anti- cyclic citrullinated peptide,抗CCP）抗體的檢測方法為酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunoabsorbent assay , ELISA)[1]，因其檢測試劑對環(huán)境及保存條件的限制，在基層醫(yī)院的檢驗科和門診中較難實現(xiàn)該項目的實驗檢測。膠體金免疫層析法(goldimmunochromatography assay，GICA)因?qū)υ噭┍４鏃l件與實驗室環(huán)境要求不高，而且，試劑包裝簡易，可以單獨對一份標本進行試驗，其操作簡便、快速，結(jié)果直觀，穩(wěn)定性好等，應(yīng)用于抗CCP抗體檢測，可快速篩選類風濕性關(guān)節(jié)炎,使類風濕性關(guān)節(jié)炎的早期診斷變成現(xiàn)實；滿足基層醫(yī)院、即時檢測、床邊檢測的需求，將擁有巨大的市場潛力和效益[2]。該文以2013年6月—2014年7月收集的200例RA患者為研究對象，對兩種診斷產(chǎn)品的臨床檢測性能進行評估研究，報告如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

收集2013年6月—2014年7月來自雞西市礦業(yè)集團總醫(yī)院確診為200例RA患者，所有患者均符合美國風濕病協(xié)會1987年修訂的RA診斷標準[3]；同時選擇來該院進行健康體檢的健康人員100例和非RA患者100例作為對照組；兩組人員基本情況比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。血清標本抽取三組人員晨起空腹靜脈血3~5 ml，離心后血清標本儲存預(yù)-70℃冰箱中待測。

1.2試劑來源

抗CCP抗體檢測膠體金法試劑盒由上海科新生物技術(shù)股份有限公司提供；抗CCP抗體（ELISA法）試劑盒為歐洲診斷試劑公司生產(chǎn)；儀器：安圖96孔酶標儀，25℃恒溫箱，科華洗板機。

The work on this review has been supported by funds from NIH to Olga Stenina-Adognravi (RO1 HL117216 and RO1 CA177771) and from the American Heart Association to Jasmine Gajeton/Olga Stenina-Adognravi (17PRE33660475).

表1　膠體金法檢測抗CCP抗體用于診斷RA的特異性

1.3檢測方法

分別采用膠體金免疫層析法和間接ELISA法來檢測患者血標本中是否含有抗CCP抗體。操作按照各自試劑盒說明書進行，質(zhì)控品、標準品均作復(fù)孔且與標本同時檢測。質(zhì)控品檢測結(jié)果符合質(zhì)控要求。抗CCP抗體檢測試劑盒（膠體金法）采用高度特異性的抗原抗體反應(yīng)及免疫層析分析技術(shù)，測試時，血清標本滴入加樣處，血清標本中的IgG與預(yù)包被在聚酯膜上的膠體金標記的二抗結(jié)合，結(jié)合物隨之在毛細效應(yīng)下橫向?qū)游?。當血清中含有特異性抗CCP抗體時，泳動到T線時被預(yù)先包被在硝酸纖維素膜上的抗原捕獲，出現(xiàn)陽性條帶，血清中若不含待測抗體時，在T線處繼續(xù)橫向?qū)游鲋罜線，C線為預(yù)先包被非特異性抗原，結(jié)合物在C線處被捕獲，此反應(yīng)為非抗原特異性的反應(yīng)，作為對照條帶，因此無論血清是否含有特異性的抗CCP抗體均在C線處形成陽性條帶?？笴CP抗體膠體金法檢測結(jié)果參考范圍為陰性，ELISA法：< 25RU/mL。對于試驗研究中測定結(jié)果明顯不符的樣本，將比對方法或其它方法再次重復(fù)進行確認試驗，同時由臨床試驗方根據(jù)患者的具體相關(guān)臨床癥狀和其它用以診斷該疾病的特異性指標報告加以分析，提供不符樣本的患者臨床相關(guān)資料以便對臨床研究結(jié)果進一步分析，并作記錄。

1.4統(tǒng)計方法

該研究所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理分析，應(yīng)用配對四格表卡方χ2檢驗，使用Kaapa來檢驗兩種檢驗方法檢測結(jié)果的一致性，P<0.05表示比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義

2　結(jié)果

2.1膠體金法檢測抗環(huán)瓜氨酸抗體的診斷靈敏度、特異性分析

通過對該研究三組人員采用膠體金法檢測抗環(huán)瓜氨酸抗體診斷的靈敏度及特異性分析得知，200例RA患者診斷的靈敏度為85%，假陰性率為15%；100例健康獻血者診斷的特異度為98%，假陽性率為2%；100例非RA患者診斷診斷的特異性為97.0%，假陽性率為3%，健康獻血者+非RA患者診斷的特異度為97.5%，假陽性率為2.5%，見表1。

2.2膠體金法與ELISA法檢測結(jié)果比較分析

通過對兩種方法檢測結(jié)果匯總統(tǒng)計分析，計算兩種檢測方法的陽性符合率：169/171×100%=98.8%；陰性符合率：223/229× 100%=98.4%；總符合率：（169+223）/200=98.0%；試劑盒一致性評價：由計算公式：Kappa=[N(A+D)-(γ1C1+γ2 C2)]/[N2-(γ1C1+γ2C2)]，其中γ1=A+B，C1=A+C,γ2=D+C，C2=B+D，N=A+B+C+D得出：Kappa=0.959262 > 0.75。P值的計算公式是P=2[1-Φ(z0)]兩者總符合率可以達到98.0%，見表2。

3　討論

類風濕性關(guān)節(jié)炎屬于自身免疫性疾病，病因尚未明了，以慢性、對稱性、多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)，是一種慢性全身性炎癥性疾病。類風濕屬于致殘性疾病，關(guān)節(jié)損害是類風濕患者最主要的病變，患病2年即可出現(xiàn)不可逆的骨關(guān)節(jié)破壞，如果不能診治可出現(xiàn)嚴重的關(guān)節(jié)畸形，有些病人也會出現(xiàn)血管損害。類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)在我國發(fā)病率約為0.3%，女性患者居多。RA的早期診斷，一直是各國醫(yī)學(xué)專家關(guān)注的問題[4]?，F(xiàn)行的美國風濕病學(xué)會（ACR）診斷標準主要依靠臨床表現(xiàn)、X線以及類風濕因子（RF）檢測。當患者達到診斷標準時，患者已出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)破壞，而且，類風濕因子缺乏特異性，不利于早期診斷、早期干預(yù)治療[5]。類風濕的早期診斷可依靠環(huán)瓜氨酸的檢測。Nicola等[6]研究發(fā)現(xiàn)環(huán)瓜氨酸抗體與人的性別、年齡沒有相關(guān)性，但與早期類風濕密切相關(guān)。Schellekens[7]等研究了數(shù)百例有早期關(guān)節(jié)癥狀患者，隨訪一年后在486人中發(fā)現(xiàn)149人(31%)為早期RA，檢測抗CCP抗體特異性達96%，陽性預(yù)測值為84%。小關(guān)節(jié)侵蝕性病變有時會出現(xiàn)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風濕的早期。抗環(huán)瓜氨酸抗體與類風濕的臨床癥狀及預(yù)后相關(guān)。Schellekens研究發(fā)現(xiàn)抗環(huán)瓜氨酸抗體陽性是侵蝕性關(guān)節(jié)損害的一個重要標志及危險因素，并指出檢測抗CCP抗體與聯(lián)合檢測抗CCP抗體和RF相比較，對預(yù)測2年后侵蝕性關(guān)節(jié)損害無統(tǒng)計學(xué)差異。Vallbracht等[8]人的研究顯示，RA病人在應(yīng)用DMARDs和糖皮質(zhì)激素沖擊治療期間，抗CCP抗體的水平明顯下降，提示抗CCP抗體可作為臨床判斷疾病活動的指標，并指導(dǎo)治療。目前市場上商品化抗CCP抗體檢測試劑盒也主要為ELISA試劑盒。ELISA法操作程序煩瑣，整個過程需三小時左右，亦需要專業(yè)人員在實驗室中進行實驗操作，并需酶標儀讀取結(jié)果，這在基層醫(yī)療機構(gòu)的實驗室和小

型門診中較難實現(xiàn)，同時基于ELISA法易受溫度和孵育時間等環(huán)境條件因素的影響，對試驗帶來諸多不便[9]。膠體金免疫層析法(GICA)是應(yīng)用膠體金標記技術(shù)，以膠體金作為示蹤物，以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細效應(yīng)使樣本溶液在層析條上層析，使樣本中的待測物與金標墊上膠體金標記物發(fā)生免疫反應(yīng)，并與條狀纖維層析材料上的抗原（或抗體）發(fā)生免疫反應(yīng)而被截留，進而形成肉眼可見的紅色條帶，得到直觀的實驗結(jié)果，達到快速檢測的目的。與其他檢測方法相比，膠體金免疫層析法方法(GICA)有以下優(yōu)點：①整個檢測過程在5~10 min就能完成，結(jié)果判斷簡單方便；②操作人員無需專業(yè)培訓(xùn)，操作簡便，能在門診室、家庭用戶及基層實驗室推廣使用；③無需低溫保存，儲運方便等；④其檢測性能如穩(wěn)定性好，能保存24個月；靈敏度與市售定性ELISA試劑盒相當，能快速篩選陽性樣本，使得膠體金層析試劑條備受歡迎。

表2　兩種方法檢測結(jié)果比較

通常產(chǎn)生膠體金方法漏檢原因考慮有以下幾種：原因及方法學(xué)差異，如層析過快，抗原與抗體未來得及結(jié)合即已越過檢測線；試紙條本身的質(zhì)量問題；試劑本身的靈敏度較ELISA低；溫度影響，溫度過低，反應(yīng)速度降低，在5 min內(nèi)弱陽性不能完全顯色；加樣量不足或過多；工作人員未按時間要求報結(jié)果等，而ELISA法靈敏度高，漏檢度低，但檢測時間長，操作復(fù)雜。人血清中含有內(nèi)源性物質(zhì)（非特異性干擾物質(zhì)），影響ELISA的測定結(jié)果，并且血清中抗體與異質(zhì)抗原間的交叉反應(yīng)也能在ELISA中發(fā)生多種非特異性吸附作用，導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)。

該產(chǎn)品將環(huán)瓜氨酸肽引入試紙條中，能快速篩選出抗環(huán)瓜氨酸肽抗體陽性樣本，對快速輔助診斷類風濕關(guān)節(jié)炎起到積極作用，實現(xiàn)基層實驗室、即時檢測、床邊檢測的需求，同時利用ELISA法能夠定量檢測抗體濃度的優(yōu)勢，對檢測結(jié)果為陽性的患者作者建議用ELISA法定期監(jiān)測抗CCP抗體濃度變化以監(jiān)控療效指導(dǎo)醫(yī)生制定個性化治療方案和判斷預(yù)后[6]。

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