馮晨龍，葛人杰，段 俐，王麗麗

（河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018）

耐高滲擬布氏乳桿菌的富集選育

馮晨龍，葛人杰，段 俐，王麗麗

（河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018）

擬布氏乳桿菌K1（Lactobacillus parabuchneri K1）在厭氧條件下可以有效轉(zhuǎn)化果糖生成甘露醇。但當(dāng)果糖濃度逐步升高時(shí)，菌體生長(zhǎng)及甘露醇產(chǎn)生速度減慢。為了提高K1菌株在高濃度果糖條件下的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)化速率，設(shè)計(jì)了定向富集耐滲突變株的實(shí)驗(yàn)，采用10 L發(fā)酵罐，在高滲條件下連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中果糖質(zhì)量濃度經(jīng)4次梯度增加，從270 g/L增加到300 g/L。經(jīng)55 d傳代培養(yǎng)后分離純化，獲得耐滲突變株K2。通過(guò)2 L發(fā)酵罐驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)K2菌株在300 g/L果糖條件下，果糖利用速率提高103%，發(fā)酵周期縮短46.4%，甘露醇的平均產(chǎn)量達(dá)到189 g/L，達(dá)到理論轉(zhuǎn)化率的94.0%。

擬布氏乳桿菌；定向篩選；甘露醇

甘露醇（mannitol）是一種天然的六碳糖醇，在自然界中廣泛存在于海藻、水果和蔬菜內(nèi)［1］，食品、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域已有廣泛應(yīng)用［2-3］。目前，甘露醇的主要生產(chǎn)方法有海帶提取法、果糖氫化法和微生物發(fā)酵法。其中，微生物發(fā)酵法由于效率問(wèn)題還處于研究階段，已經(jīng)報(bào)道具有生產(chǎn)甘露醇能力的微生物種類有霉菌、酵母和細(xì)菌［4-5］。Smiley等［6］報(bào)道了亮白曲霉（Aspergillus candidus）利用葡萄糖產(chǎn)甘露醇的單位容積產(chǎn)率為0.15 g/（L·h），甘露醇的轉(zhuǎn)化率是31%。Song等［7］篩選出1株木蘭假絲酵母（Candida magnolia），利用 150 g/L果糖發(fā)酵168 h，產(chǎn)生甘露醇67 g/L，發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行補(bǔ)料，使果糖濃度維持在3%～12%時(shí)，甘露醇的產(chǎn)量在發(fā)酵200 h后高達(dá)209 g/L，相應(yīng)的轉(zhuǎn)化率為83%，容積產(chǎn)率為1.03 g/（L·h）。Saha等［8］報(bào)道了9株異型發(fā)酵乳酸菌能利用果糖產(chǎn)生甘露醇，其中L.intermedius NRRL B-3693以300 g/L果糖為底物，pH 5.0、37℃條件下，發(fā)酵136 h后甘露醇可達(dá)198 g/L，容積產(chǎn)率是1.46 g/（L·h）。與國(guó)外研究相比，國(guó)內(nèi)甘露醇的研究相對(duì)較晚，且報(bào)道的產(chǎn)量也較低，高產(chǎn)高效菌株的篩選有利于微生物產(chǎn)甘露醇的規(guī)?；a(chǎn)。朱豫等［9］篩選出了1株能以糖化菊芋汁為原料，發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的乳酸菌，甘露醇的產(chǎn)量達(dá)到了80 g/L。侯建革等［10］采用布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri），培養(yǎng)基總糖質(zhì)量濃度為150 g/L，其中果糖與葡萄糖質(zhì)量比為2∶1，發(fā)酵48 h，產(chǎn)生甘露醇68.5 g/L。魏文婷等［11］篩選出1株近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis），利用200 g/L葡萄糖，搖瓶培養(yǎng)產(chǎn)生甘露醇61.7 g/L，并進(jìn)行30 L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)，發(fā)酵72 h，甘露醇最大產(chǎn)量為80.3 g/L。

保存于筆者所在實(shí)驗(yàn)室的1株擬布氏乳桿菌K1（Lactobacillus parabuchneri K1）是典型的異型乳酸發(fā)酵菌株，厭氧條件下，采用15%接種量縮短發(fā)酵時(shí)間，能夠利用果糖高產(chǎn)甘露醇。對(duì)擬布氏乳桿菌K1的前期研究發(fā)現(xiàn)：培養(yǎng)基中果糖質(zhì)量濃度低于240 g/L時(shí)，K1菌株的甘露醇產(chǎn)率較高，果糖被完全利用；超過(guò)240 g/L時(shí)，甘露醇產(chǎn)率明顯下降。延長(zhǎng)發(fā)酵周期，果糖殘留較多。由于甘露醇產(chǎn)生與菌體生長(zhǎng)屬于正耦聯(lián)相關(guān)，在高滲條件下，甘露醇產(chǎn)率下降主要原因是K1菌株生長(zhǎng)受到了抑制。因此，篩選在高滲條件下能夠快速生長(zhǎng)的突變菌株，理論上可以提高甘露醇產(chǎn)生速率，縮短發(fā)酵周期，降低果糖殘留。

本研究中，筆者采用10 L發(fā)酵罐，果糖質(zhì)量濃度270～300 g/L，4%接種量，延長(zhǎng)罐內(nèi)菌體增殖時(shí)間，增加突變概率，并通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，使得菌株分裂繁殖過(guò)程中的自然突變株得到定向富集，以期篩選得到在高滲條件下生長(zhǎng)速度快的高產(chǎn)甘露醇突變菌株，并通過(guò)2 L發(fā)酵罐，驗(yàn)證菌株發(fā)酵的能力。

1 材料與方法

1.1 菌種

擬布氏乳桿菌 K1（Lactobacillus parabuchneri K1），保藏于筆者所在實(shí)驗(yàn)室。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

為了檢測(cè)方便，實(shí)驗(yàn)中的單糖均為果糖。因此，理論上甘露醇的最大摩爾產(chǎn)率應(yīng)為耗用果糖物質(zhì)的量的66.7%。

1.2.1 培養(yǎng)基

一級(jí)種子培養(yǎng)基（g/L）：果糖50、玉米漿10、（NH4）2SO42、KH2PO42、MgSO41、CaCl20.2。

二級(jí)種子培養(yǎng)基（g/L）：果糖150、玉米漿10、（NH4）2SO42、KH2PO42、MgSO41、CaCl20.2。

初始馴化培養(yǎng)基（g/L）：果糖270、玉米漿20、（NH4）2SO42、KH2PO42、MgSO41、CaCl20.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：果糖 300、玉米漿 20、（NH4）2SO42、KH2PO42、MgSO41、CaCl20.2。

以上培養(yǎng)基都需調(diào)pH至6.5。補(bǔ)糖液分別為540、560、580和600 g/L果糖。發(fā)酵過(guò)程中利用NaOH做酸中和劑，且質(zhì)量濃度大于400 g/L。

1.2.2 富集培養(yǎng)的方法

取1mL在-70℃保藏的25%甘油保菌液，接種到200mL（250mL三角瓶）的一級(jí)種子培養(yǎng)基中，30℃厭氧培養(yǎng)48 h，轉(zhuǎn)接到800mL（1 000mL藍(lán)口瓶）二級(jí)種子培養(yǎng)基中，繼續(xù)30℃厭氧培養(yǎng)48 h，離心收集400mL二級(jí)種子液菌體（接種量4%），接入10 L New Brunswic發(fā)酵罐，初始裝液量8 L，初始果糖質(zhì)量濃度為270 g/L，溫度30℃，自控pH 6.3，攪拌轉(zhuǎn)速200r/min。過(guò)程中檢測(cè)果糖及甘露醇含量，當(dāng)果糖質(zhì)量濃度降到40 g/L以下時(shí)，停止發(fā)酵，無(wú)菌取樣500mL，其中100mL用于菌種保藏，400mL菌液離心收集菌體，作為轉(zhuǎn)接下一批富集培養(yǎng)的種子。每?jī)膳患囵B(yǎng)后，果糖濃度提高1%，即8批的果糖質(zhì)量濃度分別為270、270、280、280、290、290、300和300 g/L。由于發(fā)酵過(guò)程中大量產(chǎn)酸，每一批富集培養(yǎng)過(guò)程，都必須補(bǔ)加高濃度NaOH溶液來(lái)穩(wěn)定pH，發(fā)酵開(kāi)始前，計(jì)算出理論需要補(bǔ)堿的總質(zhì)量，配制總體積為1 L，為了防止補(bǔ)堿過(guò)程引發(fā)體積變化帶來(lái)的果糖質(zhì)量濃度變化，采用補(bǔ)堿與補(bǔ)糖體積比為1∶1聯(lián)動(dòng)，每補(bǔ)加1份體積的NaOH溶液，就同時(shí)補(bǔ)加等體積的兩倍初始質(zhì)量濃度的果糖，補(bǔ)糖總體積也為1 L，發(fā)酵罐終體積為10 L，8批富集培養(yǎng)，周而復(fù)始，通過(guò)檢測(cè)過(guò)程數(shù)據(jù)，判斷出正向突變的累計(jì)趨勢(shì)，一定時(shí)間后，分離突變株，本研究共耗時(shí)55 d。

1.2.3 篩選方法

將第8批次的培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋，涂布于果糖質(zhì)量濃度為300 g/L的篩選平板，厭氧條件下30℃培養(yǎng)48 h。選擇生長(zhǎng)迅速、直徑厚大的菌落，分別等量接種到200mL含300 g/L果糖的液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)，48 h后比較培養(yǎng)液菌體密度（OD）大小，篩選出生長(zhǎng)速度最快的菌株。

1.2.4 菌株發(fā)酵性能比較及發(fā)酵穩(wěn)定性的測(cè)定

K1、K2菌株采用2 L發(fā)酵罐發(fā)酵，果糖質(zhì)量濃度為300 g/L，接種量為15%，用NaOH自動(dòng)調(diào)節(jié)pH為6.3，控制溫度為30℃。通過(guò)檢測(cè)果糖質(zhì)量濃度、菌體密度（OD）和產(chǎn)物的變化，對(duì)K1、K2菌株的性能進(jìn)行比較。

K2菌株采用2 L發(fā)酵罐發(fā)酵，連續(xù)發(fā)酵3批次，果糖質(zhì)量濃度為300 g/L，接種量為15%，用NaOH自動(dòng)調(diào)節(jié)pH為6.3，控制溫度為30℃。通過(guò)檢測(cè)產(chǎn)物的質(zhì)量濃度，衡量K2株菌發(fā)酵穩(wěn)定性。

1.3 分析方法

1.3.1 菌體密度的測(cè)定

稀釋發(fā)酵液N倍，取1.5mL，加入3mL的2.5 mol/L H2SO4酸化發(fā)酵液，蒸餾水為空白樣，用721分光光度計(jì)測(cè)定600nm波長(zhǎng)下的吸光值A(chǔ)600，OD= 3A600N。

1.3.2 果糖質(zhì)量濃度的測(cè)定及果糖利用速率

果糖質(zhì)量濃度的測(cè)定采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法，參照文獻(xiàn)［12］進(jìn)行。

精確配制1、2、3、4和5 g/L果糖溶液，通過(guò)3，5-二硝基水楊酸比色法分別測(cè)得吸光度為0.079、0.169、0.233、0.283和0.356，根據(jù)所測(cè)結(jié)果得到標(biāo)準(zhǔn)曲線 y=0.703 4x+0.005 8，R2=0.998 9。果糖利用率速率計(jì)算見(jiàn)式（1）。

式中：m1為果糖質(zhì)量，g；V為發(fā)酵液體積，L；t為發(fā)酵時(shí)間，h。

1.3.3 甘露醇含量的測(cè)定、甘露醇摩爾得率及甘露醇產(chǎn)率

用Agilent 1200高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）檢測(cè)甘露醇含量。檢測(cè)器為示差檢測(cè)器，色譜柱為XtimateTM Sugar-Ca型樹(shù)脂柱，流動(dòng)相為5級(jí)蒸餾水，流速為0.6mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，柱溫為70℃，進(jìn)樣量為20μL。甘露醇摩爾得率計(jì)算見(jiàn)式（2）。甘露醇生產(chǎn)速率計(jì)算見(jiàn)式（3）。

式中：m2為甘露醇質(zhì)量，g。

1.3.4 乙酸和乳酸含量的測(cè)定

用Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）檢測(cè)乙酸、乳酸含量［13］。檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，色譜柱為Aminex HPX-87H，7.8 mm×300 mm，流動(dòng)相為0.005 mol/L H2SO4，流速為0.6mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，柱溫為50℃，進(jìn)樣量為20μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 K1菌株的特點(diǎn)及在不同果糖濃度中的培養(yǎng)

侯建革等［10］和蔣華［14］研究證明布氏乳桿菌是典型的異型乳酸發(fā)酵。當(dāng)培養(yǎng)基中碳源為葡萄糖時(shí)，厭氧條件下，代謝產(chǎn)物為乳酸、乙醇和CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中含有果糖時(shí)，代謝產(chǎn)物為乳酸、乙酸、甘露醇和CO2，果糖在培養(yǎng)基中既可以作為碳源，又可以作為氫受體生成甘露醇。理論上當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖與果糖的質(zhì)量比達(dá)到1∶2時(shí)，果糖只充當(dāng)受氫體使用。葡萄糖+2果糖-→2甘露醇+乳酸+乙酸+CO2。如果培養(yǎng)基中只含有果糖，理論上，只有2/3的果糖轉(zhuǎn)化為甘露醇，同時(shí)整個(gè)發(fā)酵過(guò)程由于產(chǎn)生了較多的乳酸和乙酸，發(fā)酵液的滲透壓是一個(gè)逐步提高的過(guò)程。

K1菌株厭氧生長(zhǎng)速度較慢，通常采用15%接種量，30℃培養(yǎng)，考察菌體生長(zhǎng)與果糖消耗以及甘露醇生成之間的關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知：果糖質(zhì)量濃度為240 g/L時(shí)，發(fā)酵周期為85 h，果糖殘留4 g/L，果糖利用速率為2.82 g/（L·h），甘露醇產(chǎn)生速率為1.77 g/（L·h）；果糖質(zhì)量濃度為270 g/L時(shí)，發(fā)酵周期為130 h，果糖殘留7 g/L，果糖利用速率為2.08 g/（L·h），甘露醇產(chǎn)生速率為1.35 g/（L·h）。該結(jié)果說(shuō)明，果糖利用速率降低26%，甘露醇產(chǎn)生速率降低23.7%，對(duì)應(yīng)的OD與果糖曲線、OD與甘露醇曲線利用相一致，即低濃度果糖時(shí)，菌體生長(zhǎng)速度較快，甘露醇產(chǎn)生速度較快，該結(jié)果說(shuō)明，高濃度果糖對(duì)K1菌株生長(zhǎng)和甘露醇生成有明顯的抑制作用。

圖1 K1菌株在培養(yǎng)過(guò)程中菌體生長(zhǎng)、果糖消耗及甘露醇生成的關(guān)系Fig.1 Relationships of cell growth，fructose and mannitol concentrations strains K1 in fermentation process

2.2 耐高濃度果糖突變菌株的定向富集培養(yǎng)

按照1.2.2節(jié)方法，4%接種量，控溫30℃，NaOH溶液自動(dòng)調(diào)節(jié)pH 6.3，連續(xù)8批富集培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，每2批富集培養(yǎng)后，果糖質(zhì)量濃度提高1%，考察8批富集培養(yǎng)中果糖和甘露醇質(zhì)量濃度的變化，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知：隨著果糖質(zhì)量濃度的提高，由270 g/L增加到300 g/L，發(fā)酵周期沒(méi)有明顯延長(zhǎng)，果糖殘留相對(duì)降低，這表明富集過(guò)程中，菌株的耐滲程度逐步增加，耐滲突變菌株逐步被富集。

圖2 定向富集過(guò)程中果糖和甘露醇的變化Fig.2 Changes of fructose and mannitol concentration in directional enrichment process

2.3 稀釋分離方法獲得耐滲菌株

由于甘露醇的產(chǎn)量與菌體生長(zhǎng)相耦聯(lián)，因此篩選生長(zhǎng)迅速的菌株，有可能甘露醇的產(chǎn)量也相應(yīng)提高。將富集培養(yǎng)55 d后的第8批培養(yǎng)液，在含有300 g/L果糖的固體培養(yǎng)基上稀釋分離，厭氧條件下，30℃培養(yǎng)48 h，選擇30個(gè)生長(zhǎng)迅速、直徑厚大的菌落，純化后，分別接種到200mL含300 g/L果糖的液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)，48 h后比較培養(yǎng)液菌體密度OD大小，菌體密度OD越大，說(shuō)明菌體生長(zhǎng)越旺盛，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知：2號(hào)菌株的OD最高，達(dá)到了4.2，是一個(gè)很有前景的高產(chǎn)菌株，命名為擬布氏乳桿菌K2菌株。

表1 菌體密度OD比較Table 1 Comparison of cell density

2.4 K1、K2菌株的性能比較及K2菌株發(fā)酵的穩(wěn)定性結(jié)果

采用發(fā)酵培養(yǎng)基，果糖質(zhì)量濃度為300 g/L，2 L發(fā)酵罐，接種量為15%，用NaOH自動(dòng)調(diào)節(jié)pH為6.3，控制溫度為30℃。

2.4.1 兩菌株的生長(zhǎng)曲線及果糖利用速率

圖3是兩菌株的生長(zhǎng)曲線及果糖質(zhì)量濃度變化曲線。由圖3可知：菌體的生長(zhǎng)與果糖的利用呈正相關(guān)，在接種量均為15%的條件下，K2菌對(duì)果糖利用迅速，75 h時(shí)殘留果糖為3.5 g/L；發(fā)酵結(jié)束后，果糖利用速率為3.95 g/（L·h）。K1菌75 h時(shí)發(fā)酵殘留果糖為170 g/L，140 h時(shí)K1發(fā)酵液中仍殘留果糖29 g/L，K1菌株停止生長(zhǎng)不再產(chǎn)酸，發(fā)酵結(jié)束，果糖利用速率為1.94 g/（L·h）。由此可見(jiàn)，K2菌株果糖利用速率比K1菌株提高103%，發(fā)酵周期縮短46.4%；發(fā)酵過(guò)程中，兩株菌的菌體密度（OD）變化與果糖利用一致，即果糖利用快，菌體密度增加也快，該結(jié)果表明，K2菌株具有明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。

圖3 K1、K2菌發(fā)酵過(guò)程中果糖及OD的變化Fig.3 Changes of cell density and fructose contents in fermentation process of strains K1，K2

2.4.2 兩菌株的甘露醇產(chǎn)生速率

圖4是K1和K2兩菌株產(chǎn)甘露醇的時(shí)間變化曲線。由圖4可知：K1菌株發(fā)酵75 h時(shí)，甘露醇質(zhì)量濃度只有78 g/L，142 h時(shí)，甘露醇質(zhì)量濃度達(dá)到178 g/L，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中甘露醇生產(chǎn)強(qiáng)度為1.25 g/（L·h）；而K2菌株75 h時(shí)，甘露醇質(zhì)量濃度達(dá)到189 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為2.56 g/（L·h），與K1菌株相比，K2菌株甘露醇產(chǎn)生速率提高了104.8%，摩爾轉(zhuǎn)化收率為94%，發(fā)酵周期縮短了46.4%，該結(jié)果表明，K2菌株有較高的甘露醇生產(chǎn)強(qiáng)度和較短的發(fā)酵周期。

圖4 K1、K2菌發(fā)酵過(guò)程中甘露醇的變化Fig.4 Changes of mannitol production in fermentation process of strains K1，K2

2.4.3 兩菌株產(chǎn)生的乳酸和乙酸

發(fā)酵過(guò)程中，有大量的乳酸和乙酸產(chǎn)生，K1、K2菌株發(fā)酵結(jié)束后，生成乳酸與乙酸的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知：K1菌株生產(chǎn)的乳酸、乙酸分別為52.2、31.0 g/L；K2菌株生產(chǎn)的乳酸、乙酸分別為56.2、34.6 g/L。該結(jié)果表明，K2菌株較K1菌株的產(chǎn)酸量更多些，果糖利用更徹底，菌體生長(zhǎng)更好，甘露醇產(chǎn)量更高，但對(duì)于甘露醇來(lái)說(shuō)，這些都將是發(fā)酵液中生成甘露醇過(guò)程中的副產(chǎn)物。

表2 K1、K2菌發(fā)酵產(chǎn)物中乳酸和乙酸的比較Table 2 Comparison by lactic acid and acetic acid in strain K1 and K2 fermentation broth

2.4.4 K2菌穩(wěn)定性的測(cè)定

在2 L發(fā)酵罐中，K2菌獨(dú)立發(fā)酵3個(gè)批次，果糖質(zhì)量濃度均為300 g/L，接種量15%，用NaOH自動(dòng)調(diào)節(jié) pH為6.3，控制溫度為30℃，發(fā)酵周期73～78 h，產(chǎn)物結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知：3批次發(fā)酵得到的甘露醇分別為188、191和188 g/L，甘露醇摩爾得率分別為93.1%、94.5%和93.1%，乳酸質(zhì)量濃度分別為56.0、56.4和55.3 g/L，乙酸質(zhì)量濃度分別為34.2、34.9和33.7 g/L。該結(jié)果表明，K2菌發(fā)酵產(chǎn)物中甘露醇、乳酸和乙酸質(zhì)量濃度波動(dòng)很小，發(fā)酵周期穩(wěn)定，表明該菌株遺傳學(xué)上傳代穩(wěn)定，是一株很有生產(chǎn)潛力的菌株。

表3 K2菌發(fā)酵的穩(wěn)定性Table 3 Stability of strain K2 in fermentation process

3 結(jié)論

采用10 L發(fā)酵罐，補(bǔ)料維持高底物濃度的條件下，定向富集擬布氏乳桿菌K1的自然突變株，歷時(shí)55 d、8個(gè)批次的連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，獲得了能夠在高滲透培養(yǎng)基中快速生長(zhǎng)的突變菌株K2，該菌株在300 g/L果糖的培養(yǎng)基中，30℃發(fā)酵75 h，甘露醇產(chǎn)量達(dá)到189 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化產(chǎn)率為理論收率的94.0%，與K1菌株比較，K2菌株甘露醇生產(chǎn)強(qiáng)度提高了104.8%，果糖利用速率提高103%，發(fā)酵周期縮短了46.4%，是一株很有工業(yè)化潛力的甘露醇生產(chǎn)菌株。

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（責(zé)任編輯 荀志金）

Breeding for high osmosis tolerance of Lactobacillus parabuchneri

FENG Chenlong，GE Renjie，DUAN Li，WANG Lili
（College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，China）

Lactobacillus parabuchneri K1 can effectively convert fructose to mannitol under anaerobic conditions.However，as fructose concentration increases，cell growth and the yield of mannitol decrease.A directed mutation experiment was designed to improve the cell growth rate and the conversion of L.parabuchneri K1 at high fructose concentration.A 55-day continuous subculture was conducted using a 10-L fermenter with four-time gradient increasing fructose concentration from 270 to ultimate 300 g/L.L.parabuchneri K2，a mutant resistant to high osmotic pressure，increased fructose consumption by 103%in a 2-L fermenter at 300 g/L fructose.Fermentation period was shortened by 46.4%comparing with the K1 strain.The mannitol yield was reached to 189 g/L，94.0%of theoretical conversion.

Lactobacillus parabuchneri；directional screening；mannitol

TQ920.1

A

1672-3678（2015）05-0031-06

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.05.006

2014-10-09

馮晨龍（1988—），男，河北石家莊人，碩士研究生，研究方向：生物化工；王麗麗（聯(lián)系人），教授，E-mail：wanglili8632@sina.com