劉 曦，黃伯駿，韓 偉

（華東理工大學(xué) 中藥現(xiàn)代化工程中心，上海 200237）

枇杷葉總?cè)扑岬奈⒉ㄝo助超聲提取工藝

劉 曦，黃伯駿，韓 偉

（華東理工大學(xué) 中藥現(xiàn)代化工程中心，上海 200237）

以枇杷葉為研究對(duì)象，采用微波輔助超聲提取其中的三萜酸，并采用香草醛-高氯酸比色法進(jìn)行分析，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。考察提取方式、浸泡時(shí)間、乙醇濃度、提取時(shí)間、液固比和超聲功率等因素，得到微波輔助超聲提取的優(yōu)化工藝條件：提取方式為先微波后超聲，無浸泡，乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%，超聲功率為144 W，液固比為25mL/g，微波時(shí)間為180 s，超聲時(shí)間為75min，由此得到的枇杷葉總?cè)扑岬寐蕿?.994%，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的中藥提取方法。

枇杷葉；總?cè)扑?；微波輔助提?。怀曁崛?/p>

枇杷葉（Eriobobotryae Folium）為薔薇科植物枇杷Eriobobotryae Folium（Thunb.）Lindl.的干燥葉，是一種常用的化痰止咳平喘藥，味苦、性微寒，歸肺經(jīng)和胃經(jīng)，其藥用歷史最早見于《名醫(yī)別錄》［1］。枇杷葉具有清肺、化痰、止咳和胃降逆止嘔的功效，主要用于治療肺熱咳嗽、胃熱嘔逆、氣逆氣喘和煩熱口渴等癥狀［2］。枇杷葉中含有多種有效成分，如三萜酸、黃酮、多糖、揮發(fā)油、鞣質(zhì)及維生素等［3］。其中三萜酸是枇杷葉的主要活性成分，包含熊果酸、齊墩果酸、科羅索酸、樺木脂酸以及馬斯里酸等［4-5］，本研究的目標(biāo)組分是枇杷葉中的三萜酸，是一類天然的弱酸性五環(huán)三萜類化合物，難溶于水和石油醚，但可溶于乙醇、甲醇和丙酮等有機(jī)溶劑中［6］。臨床藥理研究發(fā)現(xiàn)，三萜酸具有抗炎鎮(zhèn)痛［7］、保肝護(hù)肝［8］、降低血糖［9］、抗氧化［10］、抗抑郁［11］和抗腫瘤［12］等多種藥理作用，具有很大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應(yīng)用前景。

目前，三萜酸的提取方法主要有溶劑萃取法、熱回流法、索氏提取法、生物酶提取法、超臨界CO2提取法、超聲輔助提取法和微波輔助提取法［13］等。傳統(tǒng)的中藥提取方法具有提取時(shí)間長(zhǎng)、效率低和成本高等缺點(diǎn)。筆者所采用的微波輔助超聲提取法，可以有效地將微波的選擇性加熱、受熱均勻和熱效率高的特點(diǎn)［14］與超聲的空化作用、機(jī)械作用［15］結(jié)合起來，在枇杷葉三萜酸的提取過程中可以顯著縮短提取時(shí)間，提高提取效率，從而有望得到得率更高的三萜酸產(chǎn)品，以有力推進(jìn)中藥新型提取方法聯(lián)用的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要原料與試劑

枇杷葉（產(chǎn)地浙江），購(gòu)于上海華宇藥業(yè)有限公司；熊果酸對(duì)照品（純度≥98%），購(gòu)于上海同田生物有限公司；香草醛、冰醋酸、高氯酸和無水乙醇，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

UV1900PC型紫外分光光度計(jì)，上海市亞研電子有限公司；ER-692型微波提取裝置，中國(guó)電子器件工業(yè)總公司；SK3310HP型超聲提取裝置，上海市科導(dǎo)超聲儀器有限公司；HH-4型智能數(shù)顯恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限公司；101-0型恒溫干燥箱，滬南電爐烘箱廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取方法

精密稱定枇杷葉3.00 g置于250mL三口燒瓶，加入乙醇溶液，在微波裝置中間歇提取，采用冷凝回流裝置和空氣鼓泡器進(jìn)行冷卻和攪拌，冷卻后再置于超聲波裝置中提取，冰浴冷卻后，減壓抽濾，取濾液待測(cè)。

1.2.2 分析方法

采用香草醛-高氯酸比色法對(duì)枇杷葉中的總?cè)扑岷窟M(jìn)行分析。精密稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品，配制成質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別吸取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品和枇杷葉提取液，置于10mL具塞刻度試管中，揮去溶劑，加入體積分?jǐn)?shù)5%香草醛-冰醋酸溶液0.5mL和高氯酸2.0mL，在60℃下加熱15min后冷卻，用冰醋酸定容至10mL，置于紫外-可見分光光度計(jì)中進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，確定三萜酸的檢測(cè)波長(zhǎng)為545nm。

1.2.3 計(jì)算方法

依據(jù)1.2.2節(jié)中的分析方法對(duì)枇杷葉中總?cè)扑嵛镔|(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，得到相應(yīng)的吸光度值A(chǔ)，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算出總?cè)扑釢舛?，從而進(jìn)一步計(jì)算得率

式中：ρ為樣品中三萜酸的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取溶劑用量，mL；m為枇杷葉的質(zhì)量，g；n為溶液稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以相應(yīng)顯色試劑作空白對(duì)照，在545nm的波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，并以熊果酸質(zhì)量濃度（ρ）為橫坐標(biāo)、吸光值（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖1 熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of ursolic acid

由圖1可知：其線性回歸方程為A=42.947ρ+ 0.011 8，線性濃度范圍為 0.001 04～0.018 72 mg/mL，R2=0.999 5，說明熊果酸（總?cè)扑幔┵|(zhì)量濃度ρ與吸光值A(chǔ)具有良好的線性關(guān)系。并且經(jīng)過實(shí)驗(yàn)考察，具有良好的精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

2.2 提取條件的影響

2.2.1 提取方式的考察

不同的提取方式?jīng)Q定了有效成分的溶出效果，對(duì)單獨(dú)微波、單獨(dú)超聲、先微波后超聲和先超聲后微波4種提取方式進(jìn)行比較研究，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出：微波與超聲聯(lián)用技術(shù)的提取效率優(yōu)于單項(xiàng)技術(shù)，并且先微波后超聲的提取效果優(yōu)于先超聲后微波。造成這種現(xiàn)象的原因可能是，雖然微波強(qiáng)烈的熱效應(yīng)和超聲波的空化效應(yīng)均會(huì)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成一定的破壞，但是前者的破壞作用強(qiáng)于后者，所以先進(jìn)行微波提取有助于有效成分在后續(xù)提取過程中的進(jìn)一步溶出，從而進(jìn)一步提高總?cè)扑岬牡寐省?/p>

圖2 不同提取方式對(duì)總?cè)扑岬寐实挠绊慒ig.2 Effect of extraction methods on yield of the total triterpenic acid

2.2.2 浸泡時(shí)間的影響

中藥飲片一般為干燥的動(dòng)植物組織，因其細(xì)胞失水而不利于藥效成分的溶出，而對(duì)藥材的浸泡在一定程度上可以有助于藥效成分的溶出和提取?？疾旖輹r(shí)間對(duì)總?cè)扑岬寐实挠绊?，結(jié)果如圖3所示。

圖3 浸泡時(shí)間對(duì)枇杷葉總?cè)扑岬寐实挠绊慒ig.3 Effects of soaking time on yield of the total triterpenic acid

由圖3可知：?jiǎn)为?dú)浸泡時(shí)，浸出藥液的三萜酸得率隨時(shí)間延長(zhǎng)先顯著增大，而后趨于平緩；若先浸泡后提取，三萜酸的得率沒有明顯變化，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＜5%。表明在單獨(dú)浸泡時(shí)，一段時(shí)間的浸泡可以有助于目標(biāo)產(chǎn)物的溶出。但在微波-超聲提取法時(shí)，在提取之前的浸泡對(duì)于提高得率幫助不大，可能原因是微波輔助超聲的提取方法對(duì)于枇杷葉三萜酸具有非常好的提取效果，相比之下，浸泡的效果則不是很明顯。因此，本實(shí)驗(yàn)采取無浸泡、直接提取的方式。

2.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

在不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液中，乙醇分子和水分子以不同強(qiáng)度的氫鍵締合，這種締合狀態(tài)會(huì)影響藥效成分的溶解度，從而影響其提取效果，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總?cè)扑岬寐实挠绊?，結(jié)果如圖4所示。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)枇杷葉總?cè)扑岬寐实挠绊慒ig.4 Effect of ethanol concentration on yield of the total triterpenic acid

由圖4可知：枇杷葉總?cè)扑岬牡寐孰S著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高先增大后減小，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%時(shí)，三萜酸得率達(dá)到最大值，原因可能是三萜酸具有明顯的親脂性，所以不易溶于低濃度乙醇溶液；但是由于高體積分?jǐn)?shù)乙醇會(huì)使胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，形成傳質(zhì)阻力，不利于提取過程的進(jìn)行。因此，本實(shí)驗(yàn)采用75%乙醇作為提取溶劑。

2.2.4 超聲功率的影響

選擇合適的超聲功率有助于提高枇杷葉三萜酸的提取效率。筆者在SK3310HP型超聲波清洗器可允許的超聲功率范圍內(nèi)，考察了超聲功率對(duì)三萜酸得率的影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可以看出：當(dāng)超聲功率小于144 W時(shí)，總?cè)扑岬寐孰S超聲功率的增加而顯著增大；當(dāng)超聲功率大于144 W時(shí)，三萜酸的得率基本不再增加。由此可知，超聲功率的增大可促使三萜酸的提取速度加快，但是當(dāng)超聲功率達(dá)到一定值時(shí)，總?cè)扑岬寐什辉僭黾?。因此，本?shí)驗(yàn)選取144 W的超聲功率用于枇杷葉的提取實(shí)驗(yàn)。

2.2.5 液固比的影響

液固比決定著液-固兩相之間傳質(zhì)動(dòng)力的大小，從而影響提取效率。分別考察不同液固比對(duì)三萜酸得率的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖5 超聲功率對(duì)枇杷葉總?cè)扑岬寐实挠绊慒ig.5 Effect of ultrasonic power on yield of the total triterpenic acid

由圖6可知：隨著液固比的增大，提取溶劑的增加，三萜酸的得率先增大后減小，在液固比為25mL/g時(shí)達(dá)到最大值，原因可能是液固比的增大提高了提取溶劑與物料內(nèi)部的濃度差，有利于有效成分的擴(kuò)散和溶出，但當(dāng)液固比過大時(shí)，降低了傳熱速率，過量的提取液也會(huì)增加生產(chǎn)成本，不利于提取液后續(xù)處理。因此，本實(shí)驗(yàn)采用的液固比為25mL/g。

圖6 液固比對(duì)枇杷葉總?cè)扑岬寐实挠绊慒ig.6 Effect of liquid-solid ratio on yield of the total triterpenic acid

2.2.6 微波時(shí)間的影響

微波輻射時(shí)間的作用效果與藥材質(zhì)量、溶劑體積和微波功率密切相關(guān)，筆者在微波功率為650 W的條件下，分別考察不同微波輻射時(shí)間對(duì)三萜酸得率的影響，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知：在一定范圍內(nèi)三萜酸得率隨著微波輻射時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加，當(dāng)微波時(shí)間超過180 s時(shí)，三萜酸得率不再增加，超過210 s時(shí)，三萜酸得率開始下降。這表明，適當(dāng)延長(zhǎng)微波時(shí)間有利于加快三萜酸的溶出，但過長(zhǎng)的微波時(shí)間又會(huì)使藥液中的三萜酸分解。因此，本提取過程中的微波輻射時(shí)間為180 s。

圖7 微波時(shí)間對(duì)枇杷葉總?cè)扑岬寐实挠绊慒ig.7 Effect of microwave time on yield of the total triterpenic acid

2.2.7 超聲時(shí)間的影響

超聲時(shí)間也是影響三萜酸提取效率的重要因素，筆者分別對(duì)超聲時(shí)間為15、30、45、60、75、90和105min的三萜酸提取效果進(jìn)行考察，結(jié)果如圖8所示。

由圖8可知：三萜酸的得率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)先增大而后減小，原因可能是隨著超聲時(shí)間的增加，三萜酸發(fā)生了一定程度的分解，并且過長(zhǎng)的提取時(shí)間也會(huì)增加雜質(zhì)的溶出，不利于后續(xù)純化過程的進(jìn)行。因此，本實(shí)驗(yàn)所選擇的最佳超聲時(shí)間為75min。

圖8 超聲時(shí)間對(duì)枇杷葉總?cè)扑岬寐实挠绊慒ig.8 Effect of ultrasonic time on yield of the total triterpenic acid

2.3 不同提取工藝的比較研究

將微波輔助超聲提取三萜酸的工藝與其他提取方法進(jìn)行比較，分別從提取時(shí)間、能源消耗和得率三方面進(jìn)行考察，結(jié)果見表1。

通過表1中的比較可知：微波輔助超聲提取枇杷葉三萜酸的得率最高，比單獨(dú)超聲提取高2.966%，比熱回流提取高0.577%，比索氏提取高0.360%；而提取時(shí)間和能耗分別是單獨(dú)超聲提取的86.7%和98.4%，是熱回流和索氏提取的43.3%和20.2%。綜合考慮產(chǎn)品得率、提取效率與能耗，微波輔助超聲提取工藝與其他方法相比具有較大的優(yōu)勢(shì)。

表1 不同提取方法的比較Table 1 The comparison of different extraction methods

3 結(jié)論

1）通過對(duì)枇杷葉總?cè)扑岬奈⒉ㄝo助超聲提取工藝的考察可知：選擇先微波后超聲的提取方式，以切碎的枇杷葉為提取體系，以75mL的75%乙醇溶液為提取溶劑，對(duì)枇杷葉進(jìn)行直接提取，先在微波發(fā)生裝置中提取180 s，再置于功率為144 W、溫度為60℃的超聲提取裝置中提取75min，三萜酸得率為9.994%。

2）通過對(duì)不同三萜酸提取方法的比較發(fā)現(xiàn)：由微波輔助超聲提取所得的枇杷葉三萜酸得率分別比超聲提取、熱回流提取和索氏提取法提高2.966%、0.577%和0.360%，超聲提取所需的時(shí)間是微波輔助超聲提取法的1.2倍，而傳統(tǒng)的提取方法（熱回流提取和索氏提?。┧璧奶崛r(shí)間和能耗分別是該方法的2.3和4.9倍。因此表明，微波輔助超聲提取法具有高效、省時(shí)和低能的優(yōu)點(diǎn)。

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（責(zé)任編輯 周曉薇）

Microwave and ultrasound-assisted extraction of total titerpenic acid from Eriobobotryae Folium

LIU Xi，HUANG Bojun，HAN Wei
（Engineering Center for Tradition Chinese Medicine Modernization，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China）

Micronave and ultrasound-assisted extraction was developed to extract total triterperic acid in Eriobobotryae japonica.Standard curve was established with ultraviolet-visible spectrophotometry as detection method.Extraction methods，soaking time，ethanol concentration，extraction time，liquid-solid ratio and ultrasonic power were studied.The extraction process was optimized as follows：microwaveassisted extraction followed with ultrasonic extraction without soaking was chosen with ethanol concentration at 75%and liquid-solid ratio of 25mL/g.Microwave duration time was set to 180 s，and ultrasonic power at 144 W for 75min.The yield of the total triterpenic acid reached 9.994%.

Eriobobotryae Folium；triterpenic acid；microwave-assisted extraction；ultrasonic extraction

R284.2

A

1672-3678（2015）05-0052-05

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.05.010

2014-05-04

劉 曦（1989—），女，內(nèi)蒙古包頭人，碩士研究生，研究方向：中藥制藥工程；韓 偉（聯(lián)系人），教授，E-mail：whan@ecust.edu.cn