賴 穎，趙錦慧，陳 茹

（周口師范學(xué)院 生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南 周口 466001）

響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波法提取紅棗多糖工藝

賴 穎，趙錦慧，陳 茹

（周口師范學(xué)院 生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南 周口 466001）

以新鄭紅棗為原料，利用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取紅棗多糖工藝。以紅棗多糖的提取率為參考指標(biāo)，研究料液比、提取次數(shù)、提取時(shí)間3個(gè)因素對(duì)紅棗多糖提取率的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析，對(duì)料液比、提取次數(shù)和提取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化組合，考察3個(gè)因素對(duì)紅棗多糖提取率的影響。結(jié)果表明：提取紅棗多糖的最佳工藝條件為液料比16∶1（mL/g）、提取次數(shù)2次、提取時(shí)間38min，在此最佳條件下，紅棗多糖的實(shí)際提取率為7.25%；證明此工藝可應(yīng)用于紅棗多糖的大規(guī)模提取。

紅棗多糖；響應(yīng)面法；超聲波提取；Box-Behnken設(shè)計(jì)

紅棗，又名華棗、刺棗、美棗、良棗，是鼠李科植物棗屬的成熟果實(shí)，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)，而且味道甜美［1］。紅棗的原產(chǎn)地為中國(guó)，主要分布于黃河流域，其主要活性成分為生物堿類、黃酮類、維生素類和多糖等。隨著新型分離技術(shù)以及生命科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)多糖生理活性的研究正受到人們?cè)絹?lái)越多的重視。有實(shí)驗(yàn)表明，紅棗多糖具有明顯的抗補(bǔ)體活性以及抗腫瘤活性，還有促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的作用，同時(shí)對(duì)抗氧化和提高免疫力具有重要作用［2-3］。

目前，用于提取紅棗多糖的方法主要有5種，分別是熱水提取法、酶提取法、堿液提取法、超聲提取法以及微波提取法［4］。采用超聲波輔助萃取，利用超聲波的空化效應(yīng)增加溶劑穿透力，提高物質(zhì)的浸出速度和溶出次數(shù)，既能溫和地將植物組織分解，又能保持其生物活性不會(huì)遭到破壞，同時(shí)也會(huì)提高紅棗多糖的提取率［5］。

本文中筆者以河南新鄭紅棗為研究材料，進(jìn)行單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)［6-8］，分析單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)中心組合實(shí)驗(yàn)方案優(yōu)化河南紅棗多糖的提取工藝［9-11］，探究利用超聲波法提取紅棗多糖的工藝流程，以期為紅棗多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料

新鄭紅棗，由周口師范學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供。濃H2SO4、苯酚和無(wú)水乙醇等試劑皆為市售國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器

S22PC型可見分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司；KQ2200型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；1011型電熱鼓風(fēng)干燥箱、FW-100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，北京科偉永興儀器有限公司；AL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；HWS12型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅棗多糖的提取工藝

將紅棗洗凈后去核，于烘箱中烘干，120℃下烘干3 h，烘干結(jié)束后，攤晾至涼，用萬(wàn)能粉碎機(jī)將紅棗粉碎，稱取一定質(zhì)量的紅棗粉于錐形瓶中，加一定體積的蒸餾水。置于超聲波清洗器中，在設(shè)定條件下提取一定時(shí)間，然后向其中加入約3倍體積的無(wú)水乙醇，使其沉淀，隨后用抽濾機(jī)抽濾，即可得紅棗粗多糖。

1.2.2 紅棗多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸比色法測(cè)定樣品中的多糖含量［12-14］。紅棗多糖提取率計(jì)算見式（1）。

式中：ρ為提取溶液中粗多糖質(zhì)量濃度，g/mL；V為提取溶液總體積，mL；m為提取所用的紅棗粉質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

取紅棗粉2.50 g，分成所需份數(shù)，以料液比、提取次數(shù)、提取時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行單因素設(shè)計(jì)。液料比選取8∶1、12∶1、16∶1和20∶1mL/g，提取次數(shù)選取1、2和3次，提取時(shí)間選取20、30、40和50min，研究各單因素對(duì)紅棗多糖提取率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定提取次數(shù)A、提取時(shí)間B、料液比C的范圍，每一個(gè)自變量的高、中、低實(shí)驗(yàn)水平分別為1、0、-1進(jìn)行編碼，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)原理，以紅棗的出糖率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)三因素三水平的組合進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)水平與組合見表1。

表1 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)因素和水平Table 1 The response surface method design factors and levels

2 結(jié)果與討論

2.1 提取時(shí)間對(duì)紅棗多糖提取率的影響

設(shè)定提取次數(shù)為1次，液料比為12∶1mL/g，考察提取時(shí)間（20、30、40和50min）對(duì)紅棗多糖提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知：隨著超聲提取時(shí)間的增加，紅棗多糖提取率不斷增高，并在超聲時(shí)間為40min時(shí)，紅棗多糖提取率最高；但超聲時(shí)間繼續(xù)增高時(shí)，紅棗多糖提取率反而下降。這可能是因?yàn)槌晻r(shí)間比較短時(shí)，紅棗中的多糖浸出不夠充分；超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，紅棗多糖的結(jié)構(gòu)可能被破壞，反而導(dǎo)致紅棗多糖的提取率下降，所以紅棗多糖的提取時(shí)間40min為宜。

圖1 提取時(shí)間對(duì)紅棗多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extracting time on extraction yield of polysaccharide from Jujube

2.2 提取次數(shù)對(duì)紅棗多糖提取率的影響

設(shè)定提取時(shí)間為40min，液料比為12∶1mL/g時(shí)，考察提取次數(shù)（1、2和3次）對(duì)紅棗多糖提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：當(dāng)提取次數(shù)為2次時(shí)，紅棗多糖提取率為6.89%，進(jìn)一步增加提取次數(shù)時(shí)，紅棗多糖提取率與提取次數(shù)為2次時(shí)的出糖率相比，增加的幅度不大，從節(jié)約能耗、減少工序和生產(chǎn)周期時(shí)間以及節(jié)約成本的角度來(lái)考慮，提取次數(shù)2次為宜。

圖2 提取次數(shù)對(duì)紅棗多糖提取率的影響Fig.2 Effects of extracting times on extraction yield of polysaccharide from Jujube

2.3 液料比對(duì)紅棗多糖提取率的影響

設(shè)定提取次數(shù)為2次，提取時(shí)間為40min，考察液料比對(duì)紅棗多糖提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：材料的液料比不同時(shí)，紅棗多糖的提取率也明顯不同。當(dāng)液料比從8∶1升到16∶1mL/g時(shí)，紅棗多糖的提取率由5.45%上升到7.13%；當(dāng)液料比繼續(xù)增加時(shí)，紅棗多糖的提取率反而下降，這說(shuō)明提取時(shí)的液料比與紅棗多糖的浸出過(guò)程密切相關(guān)。這可能是因?yàn)槿軇┑牧吭龆鄷r(shí)，溶劑對(duì)超聲的能量吸收增多；相對(duì)的，紅棗對(duì)超聲的能量吸收減少，細(xì)胞壁破壞得不完全而導(dǎo)致多糖提取率下降，所以液料比以16∶1mL/g為宜。

圖3 材料的液料比對(duì)紅棗多糖提取率的影響Fig.3 Effects of material ratio of liquid to solid on extraction yield of polysaccharide from Jujube

2.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果分析

依據(jù)上述單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以紅棗多糖提取率作為參考，以A（提取次數(shù)）、B（提取時(shí)間）、C（液料比）為自變量，采用多元二次回歸的方程擬合試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)了響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)組合來(lái)優(yōu)化河南紅棗多糖的提取工藝，響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Results and design of the response surface

采用Design-Expert統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合試驗(yàn)，得到的回歸分析結(jié)果見表3。由回歸方差分析顯著性檢驗(yàn)表明，由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所得的模型F值為52.77，P值小于0.000 1，說(shuō)明該模型的回歸極顯著，并且此模型的R2=0.995 1，表明該模型的自變量與其響應(yīng)值之間的線性關(guān)系顯著，與實(shí)際的試驗(yàn)擬合度比較高，所以可以用于超聲波法提取紅棗多糖試驗(yàn)的理論預(yù)測(cè)。由表3可知，提取次數(shù)（A）、液料比（C）、提取次數(shù)的平方項(xiàng)（A2）、提取時(shí)間的平方項(xiàng)（B2）、液料比的平方項(xiàng)（C2）對(duì)紅棗多糖的提取率影響極其顯著，提取時(shí)間（B）對(duì)紅棗多糖的提取率高度顯著，提取次數(shù)與液料比的交叉項(xiàng)（AC）影響顯著，其他項(xiàng)不顯著。由于提取時(shí)設(shè)定的時(shí)間、確定的次數(shù)和材料的液料比這3個(gè)因素對(duì)紅棗中多糖出糖率的影響并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，采用Design-Expert統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)上表進(jìn)行多元回歸分析，明確各因素對(duì)響應(yīng)值Y的影響，得到回歸方程：Y=7.23+0.56A+0.28B-0.36C-0.62A2-0.62B2-0.84C2+0.017AB+0.20AC-0.030BC。通過(guò)比較回歸方程中一次項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小可以判斷影響紅棗多糖各因素的主次。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)紅棗多糖提取率影響的大小依次為提取次數(shù)、材料的液料比、提取時(shí)間。

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)方差分析及回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 3 The response surface design of variance analysis and regression coefficient significance test

2.5 雙因素交互作用的分析

雙因素交互作用的分析結(jié)果如圖4～6所示。由圖4可知：當(dāng)提取次數(shù)或提取時(shí)間固定時(shí)，紅棗多糖的提取率隨著提取時(shí)間或提取次數(shù)的增加呈先增大再減少的趨勢(shì)，二者具有明顯的交互作用。由圖5可知：隨著材料的液料比逐漸增加時(shí)，紅棗多糖的提取率是先增加再減少的，而且在一定程度上增加提取次數(shù)，紅棗多糖的提取率會(huì)不斷增加，但超過(guò)一定范圍，提取率則變化不大，二者交互作用顯著。由圖6可知：液料比增加，紅棗多糖的提取率是先增加再減少的，而隨著提取時(shí)間的增加，出糖率是先逐漸增加，而后逐漸趨于平緩甚至有些下降趨勢(shì)的。

圖4 提取次數(shù)和提取時(shí)間的交互作用對(duì)紅棗多糖提取率的響應(yīng)面Fig.4 The response surface and contour of extraction yield of polysaccharide from Jujube on interaction between extracting times and extracting time

圖5 提取次數(shù)和液料比的交互作用對(duì)紅棗多糖提取率的響應(yīng)面Fig.5 The response surface and contour of extraction yield of polysaccharide from Jujube on interaction between extracting times and material ratio of liquid to solid

圖6 提取時(shí)間和液料比的交互作用對(duì)紅棗多糖提取率的影響Fig.6 The response surface and contour of extraction yield of polysaccharide from Jujube on interaction between extracting time and material ratio of liquid to solid

為了進(jìn)一步確認(rèn)最佳的提取紅棗多糖的工藝條件，進(jìn)一步對(duì)回歸方程取一階的偏導(dǎo)數(shù)等于零，整理可得式（2）～（4）。

將式（2）～（4）聯(lián)立成方程組，求得當(dāng)A=0.482 3、B=0.235 8、C=0.170 3時(shí)，提取次數(shù)=A+2、提取時(shí)間=10B+35、液料比=（10C+14）∶1，從而得到提取次數(shù)為2.40次、提取時(shí)間為37.40min、液料比為15.70∶1mL/g時(shí)，獲得的紅棗多糖提取率最高，但是為了實(shí)際操作的過(guò)程中更加便利，紅棗多糖的最佳提取工藝條件修正為提取次數(shù)2次、時(shí)間38min和液料比16∶1mL/g，此條件下紅棗多糖的提取率最高。此最優(yōu)工藝條件下，紅棗多糖的提取率理論值為7.32%。而實(shí)際條件下所測(cè)得的紅棗多糖提取率為7.25%，這與理論的預(yù)測(cè)值7.32%相比，相對(duì)誤差比較小。因此采用超聲波輔助響應(yīng)面分析法優(yōu)化萃取紅棗中的多糖所獲得的工藝條件的參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

通過(guò)超聲波法提取紅棗多糖，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，可知提取次數(shù)、提取時(shí)間、材料的液料比對(duì)紅棗多糖的提取率都有顯著影響，但不同的單因素對(duì)紅棗多糖的提取率的影響主次不同，從大到小依次為提取次數(shù)、液料比、提取時(shí)間。利用響應(yīng)面法優(yōu)化了紅棗多糖的超聲波提取工藝過(guò)程，得到影響紅棗多糖提取率各因素之間的回歸方程：Y=7.23+ 0.56A+0.28B-0.36C-0.62A2-0.62B2-0.84C2+ 0.017AB+0.20AC-0.030BC。通過(guò)單因素試驗(yàn)、中心組合試驗(yàn)以及響應(yīng)面分析，研究了超聲波提取紅棗多糖的工藝，確定了超聲波提取紅棗多糖的最佳工藝條件：提取次數(shù)2次，提取時(shí)間為38min，液料比16∶1mL/g，此最優(yōu)工藝條件下紅棗中多糖的理論提取率為7.32%，實(shí)測(cè)紅棗多糖提取率為7.25%，提取效率比較高，說(shuō)明超聲波法在提取植物多糖方面有著一定的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和廣泛的應(yīng)用前景。

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（責(zé)任編輯 管 珺）

Optmiization of ultrasound-assisted extraction technology by response surface methology for extracting polysaccharide of Jujube

LAI Ying，ZHAO Jinhui，CHEN Ru
（College of Life Science and Agriculture，Zhoukou Normal University，Zhoukou 466001，China）

The purpose was to optimize the extraction of polysaceharides from Jujube.Using extraction yield as criteria，we evaluated the effect of several parameters with the single factor experiment，including solid to liquid ratio，separate times，and extraction time.Then we selected three factors that influenced more significantly on polysaccharide extraction to design Box-Behnken center united experiment by response surface methodology，so to study the interaction of the three factors with the extraction yield of polysaccharide from Jujube.The optimum extraction conditions were as follows：liquid to solid ratio of 16∶1mL/g，separate times for 2 times，extracting time setting for 38min.Under optimal conditions，yield of Jujube polysaceharides was 7.25%.Our study provides the basis for large scale production of Jujube poly saccharides.

Jujube；response surface methodology；ultrasound-assisted extraction；Box-Behnken design

S665.109+.2

A

1672-3678（2015）05-0042-05

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.05.008

2014-06-04

賴 穎（1981—），女，遼寧朝陽(yáng)人，講師，研究方向：發(fā)酵工程、生物能源，E-mail：lydia2050@126.com