李明，徐曉豐，李在均，朱婷，彭楊

（1.江南大學食品膠體與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學化學與材料工程學院，江蘇無錫214122；3.無錫市第三高級中學，江蘇無錫214028）

新型離子液體中脂肪酶催化薄荷醇選擇性酯化

李明1，2，徐曉豐3，李在均1，2，朱婷2，彭楊2

（1.江南大學食品膠體與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學化學與材料工程學院，江蘇無錫214122；3.無錫市第三高級中學，江蘇無錫214028）

設計合成了6種新型對稱烷基咪唑六氟磷酸鹽離子液體。以脂肪酶Candida antarctica催化（±）-薄荷醇和丙酸酐立體選擇性酯化反應為模型反應，考察反應介質(zhì)對酶行為的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在1，3-二正辛基咪唑六氟磷酸鹽（［DnOIM］［PF6］）中酶的活性與立體選擇性明顯高于其他離子液體和正己烷。因此，［DnOIM］［PF6］被選擇作為反應介質(zhì)。通過優(yōu)化實驗，得到最佳反應條件為：反應溫度30℃，70 mg脂肪酶，3.0 mL離子液體，底物（±）-薄荷醇與丙酸酐物質(zhì)的量比1∶1，反應時間20 h。此時，反應轉(zhuǎn)化率與e.e.（p-）值分別可達48.1%與98.1%。酶在［DnOIM］［PF6］中的穩(wěn)定性是正己烷的4.3倍，且重復使用7次后催化活性沒有顯著降低。熒光光譜和圓二色譜研究結(jié)果表明，酶在［DnOIM］［PF6］中有較大的酶蛋白質(zhì)分子裸露程度和良好的二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

離子液體；脂肪酶；立體選擇性酯化；薄荷醇

（-）-薄荷醇是天然薄荷油的主要成分，可從天然薄荷油中單離而得。由于具有明顯的清涼效果，（-）-薄荷醇及其酯已成為重要的香原料，廣泛應用于食品、煙草、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域［1-3］。近年來，天然提取的（-）-薄荷醇的產(chǎn)量已無法滿足工業(yè)需要，而常規(guī)化學法合成的大多為外消旋薄荷醇，用不對稱合成法制備（-）-薄荷醇的工藝又不夠成熟，很難找到合適的催化劑，生產(chǎn)成本高。因此，采用化學法合成外消旋薄荷醇，再利用生物技術(shù)（酶或微生物法）對消旋體進行拆分，這種有機合成與生物催化相結(jié)合的生產(chǎn)方法，是獲得（-）-薄荷醇的新途徑［4-6］。

離子液體是一種環(huán)境友好的綠色溶劑，可替代易揮發(fā)性有機溶劑應用于酶催化反應。然而，離子液體特殊的組成和結(jié)構(gòu)使它具有比有機溶劑更加多樣化的溶劑性質(zhì)，同時決定了離子液體對酶結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的影響是復雜的。因此，酶在離子液體中呈現(xiàn)為酶活性、穩(wěn)定性和選擇性的增加、保持或喪失，甚至功能轉(zhuǎn)化［7-9］。前期研究工作表明，作者開發(fā)出的新型對稱離子液體1，3-二異丁基咪唑六氟磷酸（［DiBIM］［PF6］）的親生物性好，且優(yōu)于有機溶劑正己烷［10］。在此基礎上，設計合成了6種在結(jié)構(gòu)、組成上具有遞變規(guī)律的新型對稱烷基咪唑六氟磷酸鹽離子液體——1，3-二正丁基咪唑六氟磷酸鹽（［DnBIM］［PF6］）；［DiBIM］［PF6］；1，3-二正戊基咪唑六氟磷酸鹽（［DnPIM］［PF6］）；1，3-二異戊基咪唑六氟磷酸鹽（［DiPIM］［PF6］）；1，3-二正辛基咪唑六氟磷酸鹽（［DnOIM］［PF6］）；1，3-二異辛基咪唑六氟磷酸鹽（［DiOIM］［PF6］）。其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

以脂肪酶催化外消旋薄荷醇和丙酸酐的立體選擇性酯化反應為模型反應，通過考察不同離子液體中酶的活性、選擇性和穩(wěn)定性，研究離子液體的性質(zhì)對酶促反應影響的規(guī)律。

圖1　離子液體的分子結(jié)構(gòu)式圖Fig.1　Molecular structure of the ionic liquid

1　材料與方法

1.1主要材料

脂肪酶CRL（from Candida rugosa，type VII），Sigma公司（上海）產(chǎn)品；（±）-薄荷醇（純度99%）及（-）-薄荷醇（純度99%），Acros公司產(chǎn)品；丙酸酐（純度＞96%），F(xiàn)luka公司產(chǎn)品；6種新型對稱烷基咪唑六氟磷酸鹽離子液體，按文獻［10］方法自制；其余試劑均為國產(chǎn)分析純，國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2試驗儀器與設備

THZ-82B型氣浴恒溫振蕩器，低速自動平衡離心機，金壇市醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品；9790型氣相色譜儀，溫嶺市福立分析儀器有限公司產(chǎn)品；β-DEX 120手性色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），美國Supelco公司產(chǎn)品；RF-5301型熒光分光光度計，日本島津公司產(chǎn)品；MOS-450型多功能圓二色光譜儀，法國Bio-Logic公司產(chǎn)品。

1.3試驗方法

1.3.1轉(zhuǎn)酯化反應在10 mL的具塞錐形瓶中，依次加入0.156 g（1.0 mmol）（±）-薄荷醇、70 mg脂肪酶和3.0 mL離子液體（或正己烷），最后加入0.130 g（1.0 mmol）的丙酸酐。將具塞錐形瓶置于氣浴恒溫振蕩器中，控制溫度為35℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min，間隔一定時間取樣300 μL，加入到裝有500 μL體積分數(shù)10%碳酸氫鈉和500 μL正己烷的5 mL的離心管中，充分混勻，靜置10 min，使之萃取完全。反應混合物在3 000 r/min下離心15 min后，取上層清液100 μL加入500 μL正己烷中，再加入20 μL內(nèi)標（乙酸芐酯），氣相色譜進行分析。（±）-薄荷醇的選擇性酯化反應如圖2所示。

圖2　（±）-薄荷醇與丙酸酐的選擇性酯化反應示意圖Fig.2　Enantioselective esterification of（±）-menthol with propionic anhydride

1.3.2氣相色譜條件初始柱溫100℃，保溫5 min，隨后以4℃/min升溫至150℃，再以2℃/min升溫至160℃，保溫10 min；進樣口與檢測器溫度分別為200℃和300℃；載氣為氮氣，體積流量為2 mL/ min；進樣量0.2 μL；分流比1∶33。樣品保留時間分別為：（+）-薄荷醇15.383 min，（-）-薄荷醇15.519 min，（-）-丙酸薄荷酯18.224 min，（+）-丙酸薄荷酯18.416 min。

1.3.3手性拆分效果的定量分析薄荷醇轉(zhuǎn)化率的計算公式如式（1）所示，其中c代表轉(zhuǎn)化率，P-和P+分別代表產(chǎn)物（-）-丙酸薄荷酯和（+）-丙酸薄荷酯在反應物混合物中所占的質(zhì)量比例，S代表未反應底物的含量。

反應的手性選擇性由對映體過量率e.e.（P-）和對映體選擇率E（enantiomeric ratio）［4-5］表示，計算公式如式（2）與式（3）所示。

1.3.4酶的穩(wěn)定性測定在10 mL的具塞錐形瓶中，加入3.0 mL離子液體（或正己烷）和70 mg的脂肪酶CRL，于30℃氣浴恒溫振蕩器中孵育一定時間后，加入1.0 mmol（±）-薄荷醇和1.0 mmol丙酸酐進行酯化反應，按1.3.1方法測定和計算反應結(jié)果。

1.3.5酶的熒光發(fā)射光譜的檢測酶液配制：轉(zhuǎn)酯化反應結(jié)束后，迅速過濾，如反應體系中含有離子液體，先用冷丙酮沖洗2～3次，再用4℃冷乙醚洗去吸附于酶上的底物及溶劑，室溫揮發(fā)除去乙醚后，將酶研磨成粉末狀，稱取1.0 mg酶粉，用磷酸緩沖液（pH 6.86）充分溶解，過濾后定容至5 mL，低溫保存?zhèn)溆?。酶液用RF-530型熒光分光光度計測定，熒光光譜激發(fā)波長為285 nm，激發(fā)與發(fā)射光狹縫寬度分別為5 nm和10 nm，氙燈，30℃下檢測，掃描范圍為300～450 nm。

1.3.6酶的圓二色譜圓二色譜（circular dichroism，CD）測定條件如下：樣品池光程為0.1 cm，靈敏度為2 mdeg/cm，掃描測定波長范圍為190～250 nm，掃描時間0.5 s，掃描速度為3.3 nm/s，在室溫下測定。平均殘基相對分子質(zhì)量取112，CD譜用平均殘基摩爾橢圓度表示，單位為deg·cm2/mol，數(shù)據(jù)經(jīng)5次掃描取平均值。用K2D2軟件計算脂肪酶的二級結(jié)構(gòu)含量。

1.3.7離子液體及酶的重復利用在10 mL的具塞錐形瓶中依次加入1.0 mmol薄荷醇、70 mg CRL和3.0 mL離子液體（或正己烷），混合均勻，加入1.0 mmol丙酸酐開始反應。將具塞錐形瓶置于氣浴恒溫振蕩器中，控制溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為180 r/ min，反應20 h。對用離子液體作為溶劑的錐形瓶中加入3.0 mL正己烷，劇烈振蕩萃取離子液體中的底物和產(chǎn)物，重復兩次，然后加入新鮮底物（1.0 mmol薄荷醇和1.0 mmol丙酸酐）并開始反應。對于以正己烷為溶劑的體系，反應混合物在3 000 r/min下離心10 min后除去上層有機相，并用3.0 mL新鮮正己烷洗滌下層酶粉，重新加入3.0 mL正己烷和新鮮底物并開始反應。每次回收試驗后用GC分析酯化反應結(jié)果，計算轉(zhuǎn)化率及手性選擇性。

2　結(jié)果與分析

2.1反應介質(zhì)的選擇

固定反應溫度為30℃，底物（±）-薄荷醇與丙酸酐物質(zhì)的量比率為1∶1條件下反應20 h，分別考察了不同離子液體對（±）-薄荷醇的選擇性酯化反應效果，并與有機溶劑正己烷相比較，所得結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，反應介質(zhì)的選擇對脂肪酶CRL催化（±）-薄荷醇的選擇性酯化反應的影響很大。其中，以［DiOIM］［PF6］中的轉(zhuǎn)化率最高（93.2%），但反應的選擇性極低，e.e.（P-）值僅為2.05%；［DnOIM］［PF6］和［DnPIM］［PF6］中的轉(zhuǎn)化率其次，分別為48.1%與42.9%，均高于有機溶劑正己烷中的轉(zhuǎn)化率（36.6%），而且二者反應的e.e.（P-）值（98.1%與96.3%）也顯著高于正己烷（81.3%），其中［DnOIM］［PF6］的E值更是高達332.7，是正己烷中E值（15.4）的21.6倍。而其他3種介質(zhì)在相同條件下轉(zhuǎn)化率分別為26.2%（［DnBIM］［PF6］）、33.0%（［DiBIM］［PF6］）和20.8%（［DiPIM］［PF6］），E值分別為11.1（［DnBIM］［PF6］）、2.5（［DiBIM］［PF6］）和3.8（［DiPIM］［PF6］），轉(zhuǎn)化率和反應選擇性均較低。可見，6種對稱性烷基咪唑離子液體中，隨著陽離子咪唑環(huán)1、3位N上的正烷基鏈的增長，反應轉(zhuǎn)化率逐漸增大，e.e.（P-）值和E值也逐漸升高?；橥之悩?gòu)體的兩種離子液體之間，帶有支鏈烷基的離子液體中的反應轉(zhuǎn)化率較高，但是反應的手性選擇性較低。

圖3　不同反應介質(zhì)中（±）-薄荷醇酯化反應轉(zhuǎn)化率與對映選擇性之比較Fig.3　Comparisonofesterificationconversion，enantiomeric excess and enantiomeric ratio（E）of（±）-menthol in different solvents

為了進一步研究離子液體結(jié)構(gòu)對酶行為的影響，測定了各離子液體在25℃時的黏度和極性，見表1?？芍跠nOIM］［PF6］的極性最小，可能因此維持了酶分子表面的必需水層，阻止了酶肽鏈折疊結(jié)構(gòu)里帶電基團之間的靜電作用和極性基團之間的偶極-偶極相互作用，提高了酶結(jié)構(gòu)的柔韌性，因而導致了最優(yōu)的選擇性催化性能。雖然同為同分異構(gòu)體的［DiOIM］［PF6］的極性也較弱，但是其黏度最大，是［DnOIM］［PF6］的近2倍，高黏度會減慢化學反應過程中熱和質(zhì)的傳遞，從而導致反應速率降低。然而酶在各反應體系中的最初反應速率顯示，酶在［DiOIM］［PF6］中的活性最高，最初反應速率為0.507 μmol/（mg·min），是［DnOIM］［PF6］（0.143 μmol/（mg·min））的3.5倍，是正己烷（0.131 μmol/（mg·min））的3.9倍。但是酶在［DiOIM］［PF6］中的選擇性卻極低，e.e.（P-）值和E值分別只有2.05%與1.2，同比酶在［DnOIM］［PF6］中的反應選擇性最高，e.e.（P-）值和E值分別高達98.1%與332.7。這是因為當轉(zhuǎn)化率大于50%時，酶的最適底物（-）-薄荷醇耗盡，此時酶也會慢速作用于另一種對映體（+）-薄荷醇，導致產(chǎn)物的光學純度急劇下降。溶劑對酶的影響因素比較復雜，［DnOIM］［PF6］的特殊空間構(gòu)型可能促成了酶催化活性構(gòu)象的轉(zhuǎn)變，提供了酶發(fā)揮作用的友好微環(huán)境，所以立體選擇性最優(yōu)。

表1　離子液體的黏度和極性Table 1　Viscosities and polarities of various ionic liquids

2.2酶促反應條件的優(yōu)化

以［DnOIM］［PF6］為反應介質(zhì)，加入70 mg脂肪酶CRL，底物（±）-薄荷醇與丙酸酐物質(zhì)的量比率為1∶1，反應溫度30℃條件下，轉(zhuǎn)化率和立體選擇性隨反應時間的變化如圖4所示。可以看出：反應時間在20 h前，轉(zhuǎn)化率隨著反應時間的延長而顯著升高，20 h時的轉(zhuǎn)化率為48.1%，而后增速趨于緩和，至48 h時達到最高（50.0%）；而e.e.（p-）值隨著反應時間的延長最初為小幅增加，至8 h時達到最高98.9%，然后隨著反應時間的延長卻逐步下降，20 h為98.1%，48 h時僅有93.8%。綜合考慮，選擇反應時間為20 h。

圖4　反應時間對轉(zhuǎn)化率和手性選擇性的影響Fig.4　Effect of reaction time on the conversion and enantiomeric excess of menthol

溫度是影響酶促反應的關(guān)鍵因素。固定以［DnOIM］［PF6］為反應介質(zhì)，加入70 mg脂肪酶CRL，底物（±）-薄荷醇與丙酸酐物質(zhì)的量比率為1∶1條件下反應20 h，反應轉(zhuǎn)化率和立體選擇性隨溫度的變化如表2所示?？芍?，當反應溫度低于30℃時，反應轉(zhuǎn)化率隨著反應溫度的升高而增加，這可能是由于反應溫度的升高使離子液體黏度降低和反應體系中活化分子數(shù)增加的緣故。反應溫度在30℃時，轉(zhuǎn)化率與e.e.（p-）值都達到最高，而超過30℃后反應的轉(zhuǎn)化率降低，說明高溫會使酶的活性構(gòu)象受到破壞，從而導致酶活性降低。此外，隨著溫度的升高，分子的運動速率加快，（-）-薄荷醇的酯化反應活化能與（+）-薄荷醇的酯化反應活化能之間的差值減小，從而導致對映體過量值下降。故選擇反應溫度為30℃。

表2　溫度對反應轉(zhuǎn)化率和手性選擇性的影響Table 2　Effect of temperature on the conversion and enantiomeric excess of menthol

以［DnOIM］［PF6］為反應介質(zhì)，溫度為30℃，底物（±）-薄荷醇與丙酸酐物質(zhì)的量比率為1∶1條件下反應20 h，考察脂肪酶的用量對酯化反應的影響，所得結(jié)果見圖5?？芍?，隨著酶加入量的增加，薄荷醇酯化速度加快，轉(zhuǎn)化率增加，反應的e.e.（p-）值也隨之增大，反應轉(zhuǎn)化率和e.e.（p-）值分別在90 mg用量時和50 mg用量時達到最高值49.0%和98.6%。繼續(xù)增加酶的用量，e.e.（p-）值反而下降。這是因為過量的酶會造成局部丙酸薄荷酯濃度過高，反而降低酶的催化效率。以（±）-薄荷醇酯化反應的手性選擇性為優(yōu)先考慮出發(fā)點，選擇脂肪酶CRL的用量為70mg。

圖5　脂肪酶用量對反應轉(zhuǎn)化率和手性選擇性的影響Fig.5　Effectoftheamountofthelipaseonthe conversion and enantiomeric excess of menthol

底物（±）-薄荷醇與丙酸酐物質(zhì)的量比率對CRL催化酯化反應的影響如圖6所示。隨著丙酸酐物質(zhì)的量增大，（±）-薄荷醇的轉(zhuǎn)化率迅速升高，在摩爾比為2∶1時達到最高，但同時反應的e.e.（p-）值卻顯著下降。其原因可能是：在高濃度的丙酸酐存在時，大量酸酐的脫水作用致使酶的活性降低，同時反應產(chǎn)生高濃度的副產(chǎn)物丙酸也可能抑制酶活性，從而導致選擇性明顯下降。而在很低濃度的丙酸酐條件下，反應速率將會降低，同時隨著反應進行酸酐量不斷減少和反應產(chǎn)生丙酸的增加，使丙酸成為優(yōu)勢的酰基供體，而丙酸的酰化能力遠低于丙酸酐，從而在反應結(jié)果上表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化率降低的現(xiàn)象。因此，選擇酯化反應時底物酸酐和醇物質(zhì)的量比率為1∶1。

固定反應溫度為30℃，反應時間為20 h，脂肪酶CRL的用量為70 mg，底物（±）-薄荷醇與丙酸酐物質(zhì)的量比率為1∶1條件下加入不同體積的［DnOIM］［PF6］為反應介質(zhì)，所得結(jié)果見圖7。可以看出，隨著離子液體用量的增加，反應的選擇性逐漸增大，而反應轉(zhuǎn)化率先下降而后上升。推測由于離子液體用量的增加，使得底物的濃度相應降低，因而底物分子之間的碰撞幾率降低，同時底物周圍能夠結(jié)合上溶劑的酶分子也相應增多，導致反應的選擇性增大。因此，選擇離子液體的用量為3.0 mL。

圖6　底物物質(zhì)的量比率對（±）-薄荷醇選擇性酯化反應的影響Fig.6　Effectofthesubstratemolarratioonthe conversion and enantiomeric excess of（±）-menthol

圖7　離子液體用量對薄荷醇酯化反應的影響Fig.7　Effect of the amount of IL on the conversion and enantiomeric excess of（±）-menthol

2.3酶的穩(wěn)定性

選擇離子液體作為酶催化反應的一個重要標準是酶在離子液體中的穩(wěn)定性。按照1.3.4的實驗方法分別考察了脂肪酶CRL在［DnOIM］［PF6］和正己烷中反應的半衰期，結(jié)果分別為270 h和63 h，表明酶在［DnOIM］［PF6］中的穩(wěn)定性是在正己烷中的4.3倍。為了觀察脂肪酶CRL在有機溶劑和離子液體介質(zhì)中的分子構(gòu)象變化與所使用的介質(zhì)性質(zhì)的關(guān)系，分別測定了CRL在正己烷和離子液體中于最佳反應條件下反應后的熒光光譜，結(jié)果見圖8?？芍?，

不同介質(zhì)確實會導致脂肪酶CRL的熒光強度發(fā)生變化，在348 nm處CRL特征熒光發(fā)射峰強度在［DnOIM］［PF6］介質(zhì)中最高，在［DnPIM］［PF6］與正己烷中其次，而在［DnBIM］［PF6］中最低，熒光強度的增大間接表明酶蛋白質(zhì)分子更加裸露，酶有可能更好地與底物結(jié)合。這與不同離子液體中脂肪酶對（±）-薄荷醇拆分的轉(zhuǎn)化率與選擇性的高低順序相一致，CRL在［DnOIM］［PF6］與［DnPIM］［PF6］兩種離子液體中顯示出比在有機溶劑正己烷中更好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。可見，酶活性的表現(xiàn)與酶分子的構(gòu)象變化有一定的相關(guān)性。離子液體使蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的改變，有可能是酶催化活性改變的原因之一。

圖8　脂肪酶CRL在離子液體與有機溶劑正己烷中的熒光光譜Fig.8　Fluorescence spectra of the lipase CRL in the ionic liquids and organic solvent hexane

圓二色光譜是研究稀溶液中蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種快速、簡單、較準確的方法。CD光譜的遠紫外區(qū)段（178～250 nm）包含著生物大分子主鏈構(gòu)象的信息［11］。圖9顯示了脂肪酶CRL及其在離子液體［DnOIM］［PF6］介質(zhì)中的CD譜?？梢钥闯?，離子液體對脂肪酶CD譜線產(chǎn)生了影響。與對照（純酶）相比，在離子液體中反應后的脂肪酶CD譜線在197 nm處的吸收峰峰位發(fā)生了小的藍移，峰值明顯增大，但峰形基本不變。利用K2D2軟件計算出在不同溶劑中反應20 h后脂肪酶的二級結(jié)構(gòu)含量，如表3所示?？芍?，在不同溶劑中反應一定時間后的脂肪酶，其二級結(jié)構(gòu)含量在一定的范圍內(nèi)發(fā)生了變化。與對照（純酶）相比，不同溶劑中的α-螺旋含量均有減少，并按照［DnOIM］［PF6］＞［DnPIM］［PF6］＞正己烷＞［DnBIM］［PF6］的順序依次減少；β-折疊含量均有一定程度的增加，但是α-helix和β-sheet的總含量按照α-螺旋含量減少的順序依次減少；β-轉(zhuǎn)角含量與無規(guī)卷曲含量沒有一定的趨勢，但是Loop（β-turn和random）的總含量均有增加，且按照［DnOIM］［PF6］＜［DnPIM］［PF6］＜正己烷＜［DnBIM］［PF6］的順序依次增加。其中，以［DnOIM］［PF6］中的CRL二級結(jié)構(gòu)含量與純酶最接近。

圖9　脂肪酶CRL及CRL在離子液體［DnOIM］［PF6］介質(zhì)中的圓二色譜圖Fig.9　Circular dichroism spectrometry of lipase CRL and in［DnOIM］［PF6］medium

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是指多肽鏈骨架中局部肽段的構(gòu)象，α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)中存在較多的氫鍵，導致規(guī)則二級結(jié)構(gòu)具有一定的剛性；β-轉(zhuǎn)角以及無規(guī)卷曲中不存在氫鍵或其他的相互作用，使肽段中的各個殘基間有更大的自由度，從而表現(xiàn)出極大的柔性。合適的α-螺旋的含量、一定α/β的比率，以及Loop的含量與酶的特定的功能域的形成，以及酶的構(gòu)象的變化是相關(guān)的，而酶的天然構(gòu)象以及酶的特定的功能域?qū)γ副３制浠钚允种匾?2］。如果α-螺旋度過大，由于α-螺旋結(jié)構(gòu)緊密的特殊性，使其不利于酶形成活性中心，從而使底物不能與之結(jié)合，使酶假象失去活性；相反，如果α-螺旋度過小，就會徹底破壞酶蛋白質(zhì)的氫鍵結(jié)構(gòu)或其他結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生酶結(jié)構(gòu)的不可逆破壞。而Loop是一個柔性極強的構(gòu)象，Loop越多，它就有越多的機會運動到活性中心或是鍵合位點的上面，從而覆蓋這些有可能與底物結(jié)合的位點，導致底物與酶結(jié)合的失敗，從而使酶失去活性。因此，酶的天然構(gòu)象改變越多，活性中心或是鍵合位點就越少，酶的活性越差。本研究結(jié)果說明，溶劑會影響脂肪酶分子內(nèi)部的電荷分布，導致酶構(gòu)象的改變。酶分子適當?shù)娜嵝栽黾涌赡転槊傅拇呋盍λ匦?，但如果柔性過大，就會使原有維系其螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的氫鍵取向發(fā)生改變、結(jié)構(gòu)過于松散，導致酶穩(wěn)定性及活性降低。這也與酶在［DnOIM］［PF6］中催化的初始反應速率和轉(zhuǎn)化率明顯高于其他溶劑中的結(jié)論相一致。

表3　不同溶劑中反應的脂肪酶CRL的二級結(jié)構(gòu)含量Table 3　Contents of secondary structures of lipase CRL in different solvents

2.4離子液體及酶的重復利用

離子液體的優(yōu)點之一在于它的蒸汽壓低、揮發(fā)少而對環(huán)境友好，且可以回收并進行反復利用。為使操作更方便，在不分離酶的情況下，按照1.3.7的方法，利用多批次間歇反應來考察離子液體［DnOIM］［PF6］和脂肪酶CRL的重復利用性，結(jié)果如圖10所示。反應在初始的轉(zhuǎn)化率設定為100%，每次回收試驗后的結(jié)果用GC分析酯化反應得到，其轉(zhuǎn)化率用相對轉(zhuǎn)化率表示，選擇性用相對對映體過量率表示。

圖10　離子液體與酶的重復使用Fig.10　Recycling of the ionic liquids and the lipase CRL

由圖10可知，離子液體與脂肪酶CRL回收7次后，反應的相對反應轉(zhuǎn)化率和相對對映體過量率都能保持在90%以上，催化活性沒有顯著降低。這表明離子液體［DnOIM］［PF6］能提供脂肪酶CRL發(fā)揮作用的友好微環(huán)境，是生物催化的優(yōu)良溶劑。

3　結(jié)語

離子液體陽離子尺寸與構(gòu)型都會顯著影響酶的活性。隨著陽離子咪唑環(huán)1、3位N上正烷基鏈的增長，反應轉(zhuǎn)化率逐漸增大，e.e.（P-）值和E值也逐漸升高；互為同分異構(gòu)體的離子液體之間，帶有支鏈烷基的離子液體中的反應轉(zhuǎn)化率較高，但是反應的手性選擇性較低。

酶在［DnOIM］［PF6］中的活性、反應性與穩(wěn)定性均顯著高于在正己烷中，對映體選擇率E值與半衰期分別是正己烷的21.6倍與4.3倍。

熒光光譜和圓二色譜研究結(jié)果表明，脂肪酶CRL在離子液體［DnOIM］［PF6］中有較大的酶蛋白質(zhì)分子裸露程度和良好的二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

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Lipase-Catalyzed Enantioselective Esterification of（±）-Menthol in Novel Ionic Liquids

LI Ming1，2，XU Xiaofeng3，LI Zaijun1，2，ZHU Ting2，PENG Yang2
（1.Key Laboratory of Food Colloids and Biotechnology，Ministry of Education，Wuxi 214122，China；2.School of Chemical and Material Engineering，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Wuxi No.3 Senior High School，Wuxi 214028，China）

Six novel symmetrical alkylimidazolium hexafluorophosphate ionic liquids（ILs）were designed and synthesized in this study.The enantioselective esterification of（±）-menthol with propionic anhydride catalyzed by Canadida rugosa lipase was used as a model reaction to investigate the catalytic characterization of the lipase in different medium.The results indicated that the activity and selectivity of the lipase in the ionic liquid 1，3-di（n-octyl）imidazolium hexafluorophosphate（［DnOIM］［PF6］）is obviously higher than that in other ILs and hexane.Therefore，［DnOIM］［PF6］was chosen as the medium for the reaction.By investigating various factors on the conversion of（±）-menthol，the optimal conditions were determined as reaction temperature of 30℃，70 mg lipase，3.0mL ionic liquid，menthol and propionic anhydride with the molar ratio of 1∶1，and reaction performed for 20 h.Under this optimal condition，the conversion of（±）-menthol and enantiomeric excess of（-）-menthyl propionate was up to 48.1%and 98.1%，respectively.The stability of the lipase in IL was 4.3-fold than that in hexane.Furthermore，the activity of IL and the lipase were not substantial diminution after recycled 7 times.Meanwhile，fluorescence spectroscopy and circular dichroism results showed that the lipase in IL had bigger exposure levels of amino acid residues and excellent secondary structure stability.

ionic liquid，lipase，enantioselective esterification，（±）-menthol

TQ 426.97

A

1673—1689（2015）09—0935—08

2014-07-28

國家自然科學基金項目（21176101）；國家“十二五”科技支撐計劃項目（2011BAK10B00）；浙江省自然科學基金項目（Y407321）；江蘇省“青藍工程”資助項目。

李明（1975—），女，江蘇淮安人，工學博士，副教授，主要從事天然香料提取、分析及綠色合成研究。E-mail：leeming@jiangnan.edu.cn

李在均（1964—），男，四川蒼溪人，工學博士，教授，主要從事功能分子和材料的設計、制備及應用研究。E-mail：zaijunli@263.net