王瑋，呂青骎，朱盧璽，李春保，陳穎，葛毅強，周光宏

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，江蘇南京210095；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)公共管理學(xué)院，江蘇南京210095；3.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品安全研究中心，北京100123；4.中國農(nóng)村技術(shù)開發(fā)中心，北京100045）

食品中馬源性成分的實時熒光PCR檢測

王瑋1，呂青骎1，朱盧璽2，李春保1，陳穎3，葛毅強4，周光宏1

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，江蘇南京210095；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)公共管理學(xué)院，江蘇南京210095；3.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品安全研究中心，北京100123；4.中國農(nóng)村技術(shù)開發(fā)中心，北京100045）

針對馬線粒體DNA細(xì)胞色素b基因設(shè)計特異性引物和探針，建立食品中馬源性成分實時熒光PCR檢測方法，并經(jīng)特異性和靈敏度試驗驗證其可行性。結(jié)果表明：該體系可擴增馬DNA片段，長度為127 bp，其他常見畜、禽肉成分均無法正常擴增。該體系的檢測靈敏度為1.25 pg馬DNA和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.001%馬肉粉。經(jīng)市售食品的檢測驗證，表明所建立的馬引物探針體系具有特異性好、靈敏度高、快速、高效等優(yōu)點，可用于對食品中馬源性成分的摻假鑒別檢測。關(guān)鍵詞：馬線粒體DNA細(xì)胞色素b基因；實時熒光PCR方法；定性檢測

目前，國內(nèi)市場上在肉及肉制品的生產(chǎn)銷售過程中，利用摻雜摻假、以次充好等手段欺騙消費者而牟取暴利的事件頻出。這不僅僅涉及食品安全、營養(yǎng)與經(jīng)濟價值等問題，更關(guān)系到消費者健康、宗教信仰等問題［1］。因此，對食品中原料肉進(jìn)行摻假、摻雜檢驗顯得尤為重要。目前對肉類鑒別的方法主要依賴于蛋白質(zhì)鑒定（SDS-PAGE電泳法、等電聚焦電泳法、ELISA法）［2-4］和分子生物學(xué)鑒定（DNA分子雜交、PCR方法等）［5-7］。蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)現(xiàn)已成功應(yīng)用于生肉的鑒別，但當(dāng)肉類經(jīng)過切碎、混合、蒸煮和熏烤等加工工藝處理后，將改變?nèi)忸惖鞍踪|(zhì)的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，從而破壞物種特有的蛋白質(zhì)或抗原決定簇，影響其檢測的準(zhǔn)確性和可靠性［8］。而且，這些方法在實際應(yīng)用中存在操作復(fù)雜、費時、成本高等問題，已不能滿足現(xiàn)代肉類安全檢測的需求。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，以物種間基因差異為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)鑒定方法成為肉類物種鑒定研究的熱點［9］。本研究中根據(jù)馬線粒體DNA細(xì)胞色素b基因設(shè)計特異性引物和探針，旨在建立一種快速、簡便、靈敏、準(zhǔn)確、可靠的馬源性成分定性檢測的實時熒光PCR方法，以滿足當(dāng)前相關(guān)食品摻假摻雜檢驗的需求。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗材料各種市售加工食品，如熏馬肉、馬腸、豬肉腸、牛肉丸和醬驢肉，以及馬肉、豬肉、牛肉、驢肉、狗肉、山羊肉、綿羊肉、駱駝肉、兔肉、魚肉、雞肉、鵝肉、鴨肉、鵪鶉肉等樣品，均購于南京市農(nóng)貿(mào)市場或超市。

1.1.2引物和探針根據(jù)Gen Bank所公布的馬線粒體DNA細(xì)胞色素b基因序列，利用Oligo 6.0軟件，設(shè)計馬特異性引物和探針；GeneBank Accession：JF511459，擴增目的片段長度為127 bp。擴增所用引物和探針由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，引物和探針序列見表1。

表1　實時熒光PCR引物和探針序列Table 1　Sequences of primers and probe for Real-time PCR

天根生化科技有限公司；溴化乙錠（EB）、蛋白酶K，購自大連寶生物公司；瓊脂糖（電泳純）、三氯甲烷、無水乙醇、異丙醇，購自上海生工公司；DNA MarkerⅠ，購自上海紀(jì)寧實業(yè)有限公司；實時熒光PCR混合液［FastStart Universal Probe Master（ROX）］，購自美國羅氏公司。

CTAB提取緩沖液（20 g/L CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl，0.02 mol/L Na2EDTA，pH 8.0）；CTAB沉淀液（5 g/L CTAB，40 mmol/L NaCl）；蛋白酶K溶液（20 mg/mL）；TE緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）；1.2 mol/L NaCl。均由作者所在實驗室配制。

1.1.4儀器各種量程微量移液器，5804R離心機，德國Eppendorf公司制造；PHS-3C精密pH計，上海雷磁公司制造；BS電子天平，德國Sartorius公司制造；VORTEX 3型渦旋振蕩器，德國IKA公司制造；Venticell精密烘箱，德國MMM公司制造；SPEX型冷凍研磨機，美國SPEX 6850公司制造；ABI7700型實時熒光PCR儀，美國ABI公司制造；DU640型核酸蛋白質(zhì)分析儀，美國Beckman公司制造；DYY-6C電泳儀，北京六一儀器廠制造；凝膠成像儀，德國Gene Genius公司制造。

1.2方法

1.2.1樣品的制備用冷凍研磨機將上述動物材料樣品研磨成粉狀，并于60℃烘干3 h。用馬肉粉和牛肉粉混合，配制成分別含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.001%和0.000 1%馬肉粉的混合樣品。

1.2.2DNA的提取稱取100 mg已制備好的樣品置于2 mL的離心管中，加入1.5 mL CTAB提取緩沖液和10 μL蛋白酶K溶液。60℃振蕩過夜后13 000 g離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中；加入750 μL三氯甲烷后用力振蕩，13 000 g離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中；加入2倍體積的CTAB沉淀液，室溫靜置60 min，13 000 g離心15 min，棄去上清液。加入350 μL NaCl溶液將沉淀物進(jìn)行懸浮。再加入350 μL三氯甲烷，渦旋振蕩進(jìn)行混勻，13 000 g離心10 min。轉(zhuǎn)移上清液后加入0.6倍體積的異丙醇，室溫放置20 min，13 000 g離心10 min，棄去上清液。加入500 μL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液洗滌沉淀，溶解于100 μL TE溶液中，立即使用或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3DNA質(zhì)量濃度測定及配制用美國Beckman DU640型核酸蛋白質(zhì)分析儀測定抽提樣品DNA的質(zhì)量濃度。用牛肉DNA溶液（100 ng/μL）將馬肉DNA溶液（100 ng/μL）分別稀釋成為2.5、0.25、0.025、0.002 5、0.000 25、0.000 025 ng/μL的DNA混合樣品，用于靈敏度檢測。

1.2.4PCR擴增馬源性成分實時熒光PCR反應(yīng)體系：實時熒光PCR混合液12.5 μL，正反向引物（10 μmol/L）各1 μL，探針（10 μmol/L）1 μL，DNA模板5 μL，加滅菌ddH2O至25 μL。擴增反應(yīng)程序為：50℃預(yù)變性2 min；95℃變性15 min，95℃退火15 s，60℃延伸1 min，40個循環(huán)。

馬源性成分普通PCR反應(yīng)體系：10×Multi Hotstart buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTPs（2.5 mol/L）1.0 μL，5 U/μL HotMaster Taq DNA polymerase 0.2 μL，正反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板5.0 μL，加滅菌ddH2O至25 μL。擴增反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性15 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸20 s，40個循環(huán)；72℃延伸5 min。擴增結(jié)束，質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。

2　材料與方法

2.1引物有效性驗證

利用所設(shè)計的引物，對馬DNA進(jìn)行PCR擴增。由圖1可知，5個樣品均能擴增出約127 bp的DNA片段，與預(yù)期所設(shè)計的片段長度相符合。

圖1　PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1　Gel electrophoresis of PCR products

2.2馬源性成分的實時熒光PCR特異性檢測

以馬線粒體DNA細(xì)胞色素b基因為擴增靶基因，設(shè)計合成馬源性檢測引物和探針序列，用于對馬和供試的其他動物進(jìn)行檢測分析，在馬DNA中出現(xiàn)擴增，而在豬肉、牛肉、驢肉、山羊肉、綿羊肉、駱駝肉、狗肉、兔肉、野兔肉、魚肉、雞肉、鵝肉、鴨肉、鵪鶉肉等14種動物樣品DNA中均無擴增，見圖2。證實該檢測方法具有物種特異性。

圖2　馬源性成分的物種特異性實時熒光PCR檢測結(jié)果Fig.2　Specific detection of real-time PCR for horse

2.3馬源性成分的實時熒光PCR靈敏度檢測

使用馬源性檢測引物和探針對2.5、0.25、0.025、0.002 5、0.000 25、0.000 025 ng/μL馬DNA進(jìn)行實時熒光PCR測試，在2.5、0.25、0.025、0.002 5、0.000 25 ng/μL馬DNA中均出現(xiàn)擴增曲線，在0.000 025 ng/μL馬DNA中未出現(xiàn)擴增曲線，見圖3。表明馬源性檢測引物檢測靈敏度為1.25pg馬DNA。

圖3　馬DNA實時熒光PCR檢測靈敏度實驗結(jié)果Fig.3　Amplification curve generated by serial dilution of Horse DNA

使用馬源性檢測引物和探針對質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.001%和0.000 1%馬肉粉含量的樣品DNA進(jìn)行檢測。質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%和0.001%馬肉粉均出現(xiàn)擴增曲線，而質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.000 1%馬肉粉未出現(xiàn)擴增曲線，見圖4。實驗表明，該方法的檢測靈敏度為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.001%（10 mg/kg）馬肉粉。

2.4市售食品中馬源性成分的實時熒光PCR檢測

見圖5。使用建立的檢測方法對5種市售食品檢測，以驗證檢測方法的實用性。

圖4　馬肉粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)實時熒光PCR檢測靈敏度實驗結(jié)果Fig.4Amplification curve generated by different horsepercentage

圖5　食品中馬源性成分的實時熒光PCR檢測結(jié)果Fig.5　Detectionofhorse-derivedcomponentsin commercial food products

可知，市售的豬肉腸、牛肉丸、醬驢肉中均未檢測到馬源性成分，而熏馬肉和馬腸中確實能檢測到馬源性成分，其檢測結(jié)果與食品標(biāo)簽相符合。表明該檢測方法適用于食品中馬源性成分的檢測。

3　結(jié)語

實時熒光PCR方法因其高靈敏度和高特異性等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于加工產(chǎn)品（尤其是深加工產(chǎn)品）的檢測。靶基因的選擇是影響實時熒光PCR檢測靈敏度和特異性的關(guān)鍵因素，本研究中選擇的目的基因（細(xì)胞色素b基因）位于線粒體，而大量的線粒體存在于多數(shù)細(xì)胞中，且該基因為多拷貝基因，故可達(dá)到較高靈敏度而宜于種源的定性研究［10］。實驗中建立的方法可檢測到1.25 pg馬DNA和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.001%馬肉粉的存在，且該馬特異性引物和探針體系僅能擴增馬源性成分，對其他畜禽肉樣品均無法正常擴增，從而能保證特異、準(zhǔn)確地檢測出混合樣品中的馬源性成分。在陰性樣品控制方面，Dooley等［11］將Ct值檢測陽性限定為30循環(huán)，本研究中將Ct值限定在35循環(huán)以內(nèi)，在檢測的特異性、靈敏性和假陽性控制方面均可達(dá)到較好的效果。該方法經(jīng)市售食品檢測驗證，可靠性和準(zhǔn)確性良好，能滿足對加工食品中馬源性成分摻假定性檢測的需要。

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Detection for Horse-Derived Components in Foods by Real-Time Polymerase Chain Reaction

WANG Wei1，LV Qingqin1，ZHU Luxi2，LI Chunbao1，CHEN Ying3，GE Yiqiang4，ZHOU Guanghong1
（1.College of Food Science and Technology，Nanjing Agricultural University；National center of Meat Quality and Safety Control，Nanjing 210095，China；2.College of Public Administration，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China；3.Agro-product Safety Research Center，Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100123，China；4.China Rural Technology Development Center，Beijing 100045，China）

Species-specific real-time PCR assay was developed for the detection of horse-derived materials in foods.Primers and probes were designed with horse conservative regions of the mitochondrial cytochrome b gene（amplicon=127 bp）.The specificity was evaluated and no amplifications on DNA from other meats came under observation.The method was specific for horse-derived materials，and the limit of detection was 1.25 pg of horse DNA and 0.001%（w/w）for horse powder.All these results confirmed that the real-time PCR assay is a rapid，sensitive and specific routine food analysis for the detection of horse in foods.

horse mitochondrial DNA cytochrome b gene，real-time PCR，qualitative detection

Q 949.329.7

A

1673—1689（2015）09—0961—04

2014-06-04

國家“十二五”科技支撐計劃項目（2012BAD28B02-03）；江蘇省產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合創(chuàng)新資金前瞻性聯(lián)合研究項目（BY2011181）；南京農(nóng)業(yè)大學(xué)青年科技創(chuàng)新基金項目（KJ2013031）。

王瑋（1982—），男，江蘇泗洪人，工學(xué)博士，講師，主要從事肉及肉制品質(zhì)量安全控制研究。E-mail：wangwei821220@njau.edu.cn