邱蓉麗，吳玉蘭，樂(lè) 巍

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京 210023)

陳皮和青皮均為中醫(yī)臨床常用理氣藥，陳皮來(lái)源于蕓香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培變種的成熟果皮，青皮來(lái)源于橘Citrus reticulata Blanco及其栽培變種的幼果和未成熟果皮。雖然兩者原植物相同，但由于采收時(shí)間不同，其臨床功效差異較大。古人對(duì)此早有認(rèn)識(shí)，陳嘉漠《本草蒙荃》曰“青皮、陳皮一種，因其遲早采收，特分老嫩而立名也。嫩者性酷治下，老者性緩治高”;李時(shí)珍在《本草綱目》中描述“陳皮浮而升，入脾肺氣分;青皮沉而降，入肝膽氣分，一體二用”［1］。

陳皮、青皮中主要含兩種類(lèi)型的黃酮類(lèi)成分:一類(lèi)是黃酮苷類(lèi)，如柚皮苷、橙皮苷等二氫黃酮苷類(lèi);一類(lèi)是多甲氧基黃酮類(lèi)，有橘皮素、川陳皮素等［2-4］?！吨袊?guó)藥典》2010年版僅以橙皮苷作為指標(biāo)性成分評(píng)價(jià)陳皮及青皮的質(zhì)量［5］。為了更好地比較青皮、陳皮藥材中黃酮類(lèi)成分的差異及其對(duì)功效的影響，本實(shí)驗(yàn)選擇2個(gè)黃酮苷 (柚皮苷、橙皮苷)、2個(gè)多甲氧基黃酮 (橘皮素、川陳皮素)作為指標(biāo)比較不同產(chǎn)地陳皮、青皮中黃酮，為解釋陳皮、青皮“一體二用”的機(jī)理提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀;Waters 2996二極管陣列檢測(cè)器。

1.2 材料 陳皮、青皮藥材分別收購(gòu)于浙江，湖北，廣東。浙江、湖北產(chǎn)陳皮、青皮經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院樂(lè)巍副教授鑒定為橘Citrus reticulata Blanco的干燥成熟果皮及干燥幼果。廣東產(chǎn)陳皮、青皮購(gòu)于廣東新會(huì)，經(jīng)鑒定為茶枝柑Citrus retculata Chachi的干燥成熟果皮及干燥幼果。橙皮苷(hesperidin)、柚皮苷 (naringin)對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為110721-200613、110722- 200610;川陳皮素 (nobiletin)和橘皮素(tangeretin)對(duì)照品購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)分別為071209和071126，上述2種對(duì)照品的純度均大于98%。

1.3 試劑 乙腈、甲醇為色譜純，水為純凈水(娃哈哈)，其余試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 HPLC色譜條件 Waters xbridge C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈-0.5%醋酸水，梯度洗脫 (0～20 min，10% ～25%乙腈;20～35 min，25% ～70% 乙腈;35～ 38 min，70%～95%乙腈);體積流量1 mL/min;柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)283 nm;進(jìn)樣量10 μL。在該條件下，對(duì)照品、青皮藥材、陳皮藥材色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 供試品溶液的制備 取陳皮藥材粉末 (過(guò)60目篩)0.5 g，精密稱(chēng)定。精密加入50 mL甲醇，精密稱(chēng)定，超聲提取30 min，稱(chēng)定補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻。溶液經(jīng)微孔濾膜濾過(guò)，即得。

圖1 對(duì)照品 (A)、青皮 (B)、陳皮 (C)藥材HPLC分析色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)，Citri reticulatae Pericarpium Viride(B)and Citri reticulatae Pericarpium(C)

2.3 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取橙皮苷8.65 mg、柚皮苷7.30 mg、川陳皮素3.35 mg、橘皮素4.65 mg，甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，得質(zhì)量濃度分別為 0.865、0.73、0.335、0.465 mg/mL的混合對(duì)照品貯備液，備用。

2.4 線性關(guān)系考察 精密移取混合對(duì)照品貯備液0.1、0.4、0.6、0.8、1、2、4 mL至10 mL量瓶，甲醇定容，稀釋配制成7個(gè)質(zhì)量濃度水平的對(duì)照品溶液。按“2.1”項(xiàng)色譜條件，對(duì)不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液進(jìn)行HPLC測(cè)定。分別以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸計(jì)算，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素的回歸方程分別為Y=21155046X+30186，r=0.9999;Y=19405940X+18898，r=0.9998;Y=21096914X+82019，r=0.9999;Y=24795631X+26100，r=0.9999。結(jié)果表明柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素進(jìn)樣質(zhì)量濃度在0.00730～0.292 mg/mL、0.00865～0.346 mg/mL、0.00335～0.134 mg/mL、0.00465～0.186 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 同一混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果4種黃酮的峰面積RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取新會(huì)廣陳皮藥材6份，按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定供試品中黃酮。結(jié)果橙皮苷、柚皮苷、川陳皮素、橘皮素平均含有量分別為3.16%、0.033%、0.48%、0.32%，RSD均小于3%，保留時(shí)間RSD均小于3%。表明測(cè)定方法的重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄4個(gè)黃酮的峰面積。結(jié)果橙皮苷、柚皮苷、川陳皮素和橘皮素的保留時(shí)間和峰面積的RSD均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 稱(chēng)取已知各成分含有量的新會(huì)廣陳皮 (橘皮素、川陳皮素、橙皮苷、柚皮苷分別為 3.2、4.8、31.6、0.33 mg/g)0.25 g，精密稱(chēng)定。分別精密加入橘皮素、川陳皮素、橙皮苷、柚皮苷的混合對(duì)照品溶液 (質(zhì)量濃度分別為0.995、1.417、1.981、0.132 mg/mL)0.6、0.8、1 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.9 樣品測(cè)定 廣陳皮、陳皮、廣青皮、青皮藥材，按“2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算藥材中4種黃酮成分的量。結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，各地產(chǎn)陳皮、青皮藥材中4種黃酮類(lèi)成分均以橙皮苷含有量為最高，柚皮苷含有量最低?！吨袊?guó)藥典》2010年版規(guī)定陳皮中橙皮苷含有量不得少于3.5%，青皮中橙皮苷的量不得少于5%［5］。浙江和湖北產(chǎn)陳皮和青皮中橙皮苷的含有量均符合《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)，但這兩個(gè)產(chǎn)地青皮中多甲氧基黃酮川陳皮素和橘皮素的量要遠(yuǎn)大于陳皮。產(chǎn)于廣東新會(huì)的廣陳皮是陳皮的一種，但從測(cè)定結(jié)果看，新會(huì)陳皮、青皮中橙皮苷的量均低于《中國(guó)藥典》2010年版要求，新會(huì)陳皮和青皮中川陳皮素和橘皮素的含有量相差不大。

3 討論

3.1 《本草綱目》引用朱丹溪方曰:青皮治因久積憂(yōu)郁，乳房?jī)?nèi)有核如指頭，不痛不癢，五七年成癰，名乳癌。用青皮四錢(qián)，水一盞半，煎一盞，徐徐服之，日一服，或用酒服［1］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)3個(gè)不同產(chǎn)地的青皮中多甲氧基黃酮 (川陳皮素、橘皮素)的量均高于陳皮。其中浙江、湖北產(chǎn)的青皮中川陳皮素量分別是陳皮的20倍和23倍，橘皮素量是陳皮的14倍和15倍。藥理作用顯示多甲氧基黃酮抗癌活性較強(qiáng)［6-7］，其中川陳皮素可通過(guò)下調(diào)COX-2的表達(dá)，上調(diào)Bax的表達(dá)，顯著抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，減弱細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［8-9］;可抑制人胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［10-11］及p53突變的人胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［12］;體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均表明川陳皮素有抗肺癌細(xì)胞增殖活性［13］。橘皮素可將人乳腺癌細(xì)胞周期阻斷在G1期而顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［14］，并可抑制黑色素瘤發(fā)生肺轉(zhuǎn)移［15］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果對(duì)于解釋青皮可用于治療氣血瘀滯之癥瘕，而陳皮無(wú)此功效有一定啟示。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests

表2 不同產(chǎn)地青皮、陳皮中4種黃酮的量Tab.2 Determination of flavonoids in Citri reticulatae Pericarpium and Citri reticulatae Pericarpium viride collected from different growing areas

3.2 本研究發(fā)現(xiàn)浙江、湖北產(chǎn)青皮、陳皮中橙皮苷的量符合《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)，而廣東產(chǎn)廣陳皮、青皮中橙皮苷量達(dá)不到《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)。本課題組曾收集多批新會(huì)產(chǎn)廣陳皮樣品，測(cè)定發(fā)現(xiàn)廣陳皮中橙皮苷的量均較低，多批次均達(dá)不到《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)。但來(lái)源于茶枝柑的廣陳皮中多甲氧基黃酮 (川陳皮素、橘皮素)的量要遠(yuǎn)高于來(lái)源于橘的陳皮，分別是其11倍和8倍，此種含有量上的差異能否引起陳皮與廣陳皮功效的不同有待于進(jìn)一步研究。

3.3 在流動(dòng)相的選擇中，比較了甲醇-水、乙腈-水及在流動(dòng)相中添加不同質(zhì)量的酸對(duì)樣品分離的影響。結(jié)果顯示在流動(dòng)相中添加酸，可使樣品峰形更對(duì)稱(chēng);乙腈-酸水系統(tǒng)對(duì)川陳皮素和橘皮素的分離度比甲醇－酸水系統(tǒng)好。最終確定流動(dòng)相體系為乙腈-0.5%醋酸水體系，4種成分可以達(dá)到基線分離。

［1］國(guó)家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會(huì).中華本草:第4卷［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999:891-894.

［2］鄭國(guó)棟，蔣 林，楊得坡，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地廣陳皮中5種活性黃酮成分［J］.中草藥，2010，41(4):652-655.

［3］Wang D，Wang J，Huang X，et al.Identification of polymethoxylated flavones from green tangerine peel(pericarpium citri reticulatae Viride)by chromatographic and spectroscopic techniques［J］.J Pharm Biomed Anal，2007，44(1):63-69.

［4］李慶耀，梁生林.陳皮的藥用研究進(jìn)展［J］.中成藥，2008，30(2):246-248.

［5］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010年版一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:176-177;183-184.

［6］Kandaswami C，Perkins E，Soloniuk D S，et al.Antiproliferative effects of citrus flavonoids on a human squamous cell carcinoma in vitro［J］.Cancer Lett，1991，56(2):147-152.

［7］Walle T.Methoxylated flavones，a superior cancer chemopre-ventive flavonoid subclass?［J］.Semin Cancer Biol，2007，17(5):354-362.

［8］Shi M D，Liao Y C，Shih Y W，et al.Nobiletin attenuates metastasis via both ERK and PI3K/Akt pathways in HGF-treated liver cancer HepG2 cells［J］.Phytomedicine，2013，20(8-9):743-752.

［9］Ma X，Jin S，Zhang Y，et al.Inhibitory effects of nobiletin on hepatocellular carcinoma in vitro and in vivo［J］.Phytother Res，2014，28(4):560-567.

［10］Yoshimizu N，Otani Y，Saikawa Y，et al.Anti-tumour effects of nobiletin，a citrus flavonoid，on gastric cancer include:antiproliferative effects，induction of apoptosis and cell cycle deregulation［J］.Aliment Pharmacol Ther，2004，20(Suppl 1):95-101.

［11］Lee Y C，Cheng T H，Lee J S，et al.Nobiletin，a citrus flavonoid，suppresses invasion and migration involving FAK/PI3K/Akt and small GTPase signals in human gastric adenocarcinoma AGS cells［J］.Mol Cell Biochem，2011，347(1/2):103-115.

［12］Moon J Y，Cho M，Ahn K S，et al.Nobiletin induces apoptosis and potentiates the effects of the anticancer drug 5-fluorouracil in p53-mutated SNU-16 human gastric cancer cells［J］.Nutr Cancer，2013，65(2):286-295.

［13］Luo G，Guan X，Zhou L.Apoptotic effect of citrus fruit extract nobiletin on lung cancer cell line A549 in vitro and in vivo［J］.Cancer Biol Ther，2008，7(6):966-973.

［14］Morley K L，F(xiàn)erguson P J，Koropatnick J.Tangeretin and nobiletin induce G1 cell cycle arrest but not apoptosis in human breast and colon cancer cells［J］.Cancer Lett，2007，251(1):168-178.

［15］Martinez Conesa C，Vicente Ortega V，Yanez Gascon M J，et al.Treatment of metastatic melanoma B16F10 by the flavonoids tangeretin，rutin，and diosmin［J］.J Agric Food Chem，2005，53(17):6791-6797.