俞 娟，　劉勁松，　王 剛，　王 諍，　蔡百祥，　王國凱

（安徽中醫(yī)藥大學藥學院，現(xiàn)代中藥安徽省重點實驗室，安徽　合肥　230012）

響應面法優(yōu)化馬蘭多糖提取工藝研究

俞 娟，劉勁松，王 剛，王 諍，蔡百祥，王國凱*

（安徽中醫(yī)藥大學藥學院，現(xiàn)代中藥安徽省重點實驗室，安徽合肥230012）

目的 通過響應面法研究和優(yōu)化馬蘭多糖的提取工藝。方法 在單因素試驗結(jié)果的基礎上，運用響應面法的設計，對馬蘭多糖的提取工藝各因素進行優(yōu)化。結(jié)果 最佳優(yōu)化提取工藝是料液比為25∶1，提取時間為1.55 h，提取次數(shù)為4次。在該優(yōu)化條件下，馬蘭多糖的實際平均提取率為8.17%。結(jié)論 該優(yōu)化工藝穩(wěn)定可靠，實驗值與建立的模型預測值基本一致。

馬蘭；多糖；響應面法；提取工藝

馬蘭為菊科植物馬蘭屬馬蘭Kalimeris indica（L.）Sch-Bip的帶根全草，全國均有分布［1］?，F(xiàn)代藥理研究證明，馬蘭具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、抗胃潰瘍等作用［2-3］，在四川民間常用其煎服，用于治療胃脘疼痛以及慢性胃炎，頗具療效［4-5］。且有研究表明馬蘭多糖具有抗胃潰瘍作用［6-7］。響應面分析法是一種廣泛用于優(yōu)化工藝條件的方法［8］。本實驗采用響應面法優(yōu)化馬蘭多糖的提取工藝，為馬蘭的工藝研究提供理論依據(jù)。

1　材料與儀器

1.1材料 馬蘭藥材于2014年購自亳州藥材市場，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學楊青山鑒定為菊科植物馬蘭K.indica（L.）Sch-Bip的干燥全草。憑證標本（No.200401）保存于安徽中醫(yī)藥大學藥物化學系天然藥化研究室。所用試劑均為分析純。

1.2儀器 UV759CRT分光光度計（島津）；DZF6050型真空干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；HH-S恒溫水浴鍋（江蘇國勝實驗儀器廠）；十萬分之一電子天平（賽多利斯公司）。

2　方法與結(jié)果

2.1多糖提取 稱取馬蘭藥材50 g，加蒸餾水，回流提取，濃縮，真空干燥至恒定質(zhì)量，稱定質(zhì)量。

2.2馬蘭多糖的測定（硫酸-苯酚法［9］）

2.2.1標準曲線的制備 取葡萄糖對照品0.100 0 g，精密稱定，置于100 mL量瓶中加蒸餾水溶解并定容至刻度。準確吸取對照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL于10 mL刻度試管中，分別加入2.0 mL蒸餾水，再分別加6%苯酚1.0mL及濃硫酸5.0mL，加水定容至刻度，靜置10min，再放入沸水浴中15min。同法制得空白對照。在多糖最大吸收波長490nm處測定其吸光度，計算其標準曲線回歸方程Y=7.74Ⅹ-0.0301（r=0.9991），表明多糖在0.105～0.504mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關系。

2.2.2供試品溶液制備 取樣品0.1000g，配成100mL溶液，精密移取0.50mL于10mL試管中，按“2.2.1”項下操作，測定吸光度，計算馬蘭多糖的提取率：提取率（%）=多糖的質(zhì)量濃度（mg/mL）×溶液體積（mL）×稀釋倍數(shù)/原料質(zhì)量（g）×10-3×100

2.2.3精密度 取同一份供試品溶液，連續(xù)平行測定6次，RSD值為1.9%，表明儀器精密度良好。

2.2.4重復性 精密稱取樣品6份，精密稱定，按“2.2.1”項下同法進行提取，分別測定吸光度，RSD值為1.3%，表明本法重復性良好。

2.2.5穩(wěn)定性 取同一份供試品溶液，在0、5、10、20、30、60min分別測定其吸光度，RSD值為0.7%，表明樣品溶液在60min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.6加樣回收率 取已知含有量的多糖提取物6份，精密稱定，分別加入對照品，按“2.2.1”項下同法進行處理，分別測定吸光度，計算平均回收率為99.4%，RSD值為1.9%，結(jié)果表明本法回收率良好。

2.3單因素水平試驗 結(jié)果如圖1所示，最佳料液比25倍，最佳提取時間1.5h，最佳提取次數(shù)3次。

圖1　單因素試驗結(jié)果

2.4響應面法優(yōu)化馬蘭多糖的提取工藝

2.4.1實驗結(jié)果及分析 在單因素試驗結(jié)果的基礎上，按照中心組合試驗設計原理［10］，參考文獻［11-14］選取料液比、提取時間、提取次數(shù)進行三因素三水平的實驗設計，因素水平分別以-1、0、1編碼，以馬蘭多糖的得率為響應值，見表1。

表1　響應面優(yōu)化三因素三水平

以料液比（A）、提取時間（B）、提取次數(shù)（C）為自變量，以馬蘭多糖含有量（Y）為響應值，用Design-Expert 8.0.5b軟件進行三因素三水平的響應面數(shù)據(jù)分析，結(jié)果見表2。

表2　響應面優(yōu)化實驗設計及結(jié)果

分析上述數(shù)據(jù)，回歸方程為：Y=8.00+0.25A+ 0.43B+0.45C+0.028AB-0.42AC-0.34BC-0.87A2-0.91B2-0.29C2。結(jié)果可知，三個因素對馬蘭多糖提取率的影響大小為：C＞B＞A。結(jié)果見表3。注：*P＜0.05為顯著水平，**P＜0.01為極顯著水平

表3　擬合回歸分析結(jié)果

表3表明A、B、C、AC、BC、A2、B2、C2因素對多糖的提取率影響顯著，表明三個因素對馬蘭多糖的提取均有顯著的影響；其中料液比和提取時間以及提取時間和提取次數(shù)的交互作用也會對馬蘭多糖提取率帶有顯著影響。進一步分析方程方差可知，由總模型P＜0.001可知本實驗所選取的二次多項式模型具有高度的顯著性；失擬項為0.1824＞0.05，故失擬項不顯著；R2=0.9757和R2

Adj= 0.9444說明模型可以解釋94.44%響應值的變化，只有總變異的5.56%不可以用此模型解釋，說明該模型的擬合度較好。

2.4.2 響應面圖與等高線圖分析 根據(jù)多元回歸方程得到的三因素對馬蘭多糖提取率影響的響應面圖和等高線圖。圖2說明料液比和提取時間之間的交互作用不顯著；當料液比不變，馬蘭多糖提取率隨著提取時間的增大表現(xiàn)為先上升后下降；當提取時間不變，馬蘭多糖提取率隨著料液比的增大表現(xiàn)為先上升后下降。

圖2　料液比與提取時間對馬蘭多糖提取率的響應面及其等高線

圖3說明料液比和提取次數(shù)之間的交互作用顯著；當料液比較小，馬蘭多糖提取率隨著提取次數(shù)的增大表現(xiàn)為先上升后下降，當料液比達到一定值，馬蘭多糖提取率隨著提取次數(shù)的增大趨于平緩；當提取次數(shù)不變，提取率隨著料液比的增大表現(xiàn)為先上升后下降。

圖3　料液比與提取次數(shù)對馬蘭多糖提取率的響應面及其等高線

圖4說明提取時間和提取次數(shù)之間的交互作用顯著；當提取時間較小，馬蘭多糖提取率隨著提取次數(shù)的增大表現(xiàn)為先上升，當提取時間達到一定值，馬蘭多糖提取率隨著提取次數(shù)的增大表現(xiàn)為先上升后下降；當提取次數(shù)不變，馬蘭多糖提取率隨著提取時間的增大而先上升后下降。

圖4　提取時間與提取次數(shù)對馬蘭多糖提取率的響應面及其等高線圖

2.4.3最佳條件預測及驗證試驗 通過Design-Expert 8.0.5b軟件進行數(shù)據(jù)分析，得到馬蘭多糖提取的最佳工藝條件是料液比為24.84∶1；提取時間為1.55 h；提取次數(shù)為3.73次。馬蘭多糖提取率的理論值為8.18%?？紤]實際情況，確定最佳提取工藝條件是料液比為25∶1；提取時間為1.55 h；提取次數(shù)為4次。在此條件下提取3批，實際提取率分別為8.13%、8.18%、8.19%，平均值為8.17%，與理論值8.18%接近。

4　討論

目前關于多糖提取工藝研究報道主要通過正交實驗設計，而其只通過因素水平組合，無法優(yōu)選出因素的最佳組合。本實驗采用響應面法，將因素與結(jié)果的關系進行多項式擬合，優(yōu)選馬蘭多糖最佳提取工藝。首先采用單因素試驗確定因素水平，進一步應用響應面分析法考察因素對提取的影響，采用二次回歸設計得到馬蘭多糖提取率的回歸模型，驗證試驗表明了該模型的可靠性。

［1］傅立國.中國高等植物：十一卷［M］.青島：青島出版社，2005：163.

［2］南京中醫(yī)藥大學.中藥大辭典［M］.上海：上?？茖W技術出版社，2006：384.

［3］雷載權，張廷模.中華臨床中藥學［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1998.

［4］郭甫臣.馬蘭草的臨床應用［J］.中國民族民間醫(yī)藥雜志，2002，10（2）：119-120.

［5］陳明清.中草西醫(yī)結(jié)合治療淺表性胃炎胃潰瘍十二指腸球部潰瘍108例臨床觀察［J］.中華實用中西醫(yī)雜志，2001，12（14）：119-120.

［6］涂朝勇，田 徽，王 建，等.路邊菊水煎液抗實驗性胃潰瘍的研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20（10）：2595.

［7］田 徽，阮期平，李崇進，等.馬蘭抗實驗性胃潰瘍作用有效部位的篩選［J］.時珍國醫(yī)國藥，2013，24（2）：324-325.

［8］Box G E P，Wi1son K G.On the experimenta1attainmentof optimum conditions［J］.J R Star Soc A Stat，1951，13（4）：1-45.

［9］田 徽，李 濤，郭 江，等.馬蘭多糖初步純化工藝優(yōu)化研究［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2012，8（8）：16-18.

［10］費榮昌.試驗設計與數(shù)據(jù)處理［M］.4版.無錫：江南大學出版社，2001：59-63.

［11］潘亞磊，翟遠坤，牛銀波，等.響應面分析法優(yōu)化杜仲總木脂素提取工藝［J］.中成藥，2014，36（1）：182-185.

［12］易東陽，李勇華.響應面分析法優(yōu)化慢性濕疹搽劑提取工藝［J］.中成藥，2014，36（7）：1545-1548.

［13］許代福，方應權.實驗設計-響應面法優(yōu)化大葉當歸中阿魏酸的閃式提取工藝［J］.中成藥，2014，36（2）：422-424.

［14］鄧 翀，宋小妹，董媛媛，等.響應面法篩選杜仲的鹽制工藝［J］.中成藥，2014，36（3）：585-588.

R284.2

B

1001-1528（2015）01-0222-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.051

2014-08-28

國家自然科學基金項目（81303220）；安徽省自然科學基金項目（11040606M220）

俞 娟（1981—），女，碩士，講師，主要從事中藥化學成分研究。Te1：（0551）68129055，E-mai1：54795150@qq.com

王國凱（1981—），男，博士，副教授，主要從事中藥化學活性成分研究。Te1：（0551）68129167，E-mai1：wanggk7779 @163.com