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        丙酮-K2HPO4雙水相體系萃取大薊總黃酮

        2015-10-19 02:17:38張?jiān)书?/span>鐘凌云
        中成藥 2015年1期
        關(guān)鍵詞:雙水浸膏丙酮

        丁 霞, 張?jiān)书?云, 鐘凌云

        (1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,江蘇 南京 210095;2.江西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,江西 南昌 330004)

        丙酮-K2HPO4雙水相體系萃取大薊總黃酮

        丁 霞1,張?jiān)书?,楊 云1,鐘凌云2

        (1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,江蘇南京210095;2.江西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,江西南昌330004)

        目的 建立雙水相萃取大薊總黃酮的工藝參數(shù)。方法 以丙酮-K2HPO4為雙水相萃取體系,分配系數(shù)K和萃取率Y為考察指標(biāo),通過丙酮體積分?jǐn)?shù)、K2HPO4質(zhì)量濃度、pH、溫度等單因素分析考察雙水相萃取大薊總黃酮的最佳工藝條件。結(jié)果 其工藝參數(shù)為:丙酮體積分?jǐn)?shù)70%,K2HPO4的質(zhì)量濃度0.24 g/mL,pH 8.0,室溫。在該工藝條件下大薊總黃酮在兩相中的分配系數(shù)達(dá)7.81,萃取得率達(dá)96.8%,黃酮浸膏純度達(dá)89.8%。結(jié)論 該方法穩(wěn)定可行,操作簡便快速,廉價(jià),萃取得率高,可用于分離純化大薊總黃酮。

        大薊;總黃酮;雙水相體系

        大薊是菊科植物薊Cirsiu japonicum var.Fisch.ex DC.的干燥地上部分,其味甘、苦,性涼,歸心、肝經(jīng),有涼血、止血、祛瘀、消癰腫的作用[1]。大薊含有多種化學(xué)成分,主要有三萜和甾體類、揮發(fā)油類、長鏈炔烯醇類、黃酮和黃酮苷類等化合物。藥理研究顯示大薊黃酮具有抗氧化、止血、抗腫瘤、抗糖尿病等藥理作用[2-4]。

        雙水相萃取技術(shù)是指親水性聚合物水溶液在一定條件下可以形成雙水相,由于被分離物在兩相中的分配不同,便可實(shí)現(xiàn)分離[5-6]。事實(shí)上,能與水互溶的有機(jī)溶劑在無機(jī)鹽的存在下也可生成雙水相體系,這種新型的雙水相體系具有價(jià)廉、低毒、易回收且無需反萃和避免使用黏稠水溶性高聚物等特點(diǎn),在天然產(chǎn)物的提取分離中已顯示出良好的應(yīng)用前景[7-8]。本實(shí)驗(yàn)采用丙酮-K2HPO4雙水相體系萃取分離大薊總黃酮,探討了丙酮體積分?jǐn)?shù)、K2HPO4質(zhì)量濃度、pH以及溫度等單因素對大薊黃酮在該體系的分配系數(shù)和萃取率的影響,為工業(yè)化利用大薊提供重要依據(jù)。

        1 儀器與材料

        KQ-500型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);HHS型電熱恒溫水浴鍋(上海博迅公司醫(yī)療設(shè)備廠);JB-2型恒溫磁力攪拌器(上海雷磁新涇儀器公司);T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);pHS-25型酸度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。蘆丁對照品(批號100080-200306,含量測定用,中國藥品生物制品檢定所),大薊(產(chǎn)地安徽,批號110815),磷酸氫二鉀、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、丙酮及其他試劑均為分析純。

        2 方法

        2.1大薊醇提物的制備 精密稱取100.0 g大薊,加10倍量體積的石油醚,超聲提取2次,每次30 min。過濾,揮盡石油醚,殘?jiān)邪戳弦罕?∶8的量加入70%乙醇超聲提取2次,每次30 min。過濾,合并濾液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去溶劑得大薊醇提浸膏,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

        2.2雙水相體系的制備 在20 mL的具塞試管中加入一定量的丙酮/乙醇、K2HPO4/(NH4)2SO4和水,使體系總體積為20 mL,振蕩2~3 min,靜置,待溶液分相后,讀取上相與下相的體積,計(jì)算V終/V始,V始為有機(jī)溶劑的加入量(mL),V終為成相后有機(jī)相的體積。根據(jù)V終/V始的計(jì)算結(jié)果,評價(jià)成相行為,確定雙水相體系[9]。

        2.3萃取條件的優(yōu)化 在雙水相體系中加入0.15 g醇提浸膏,以分配系數(shù)K和回收率Y為指標(biāo),考察K2HPO4質(zhì)量濃度、pH、溫度及樣品的加入量對萃取效果的影響。溶液分相后分別讀取上、下相體積,并取樣分析上、下相中大薊總黃酮的量。按下式計(jì)算黃酮的K和Y:

        式中:K為黃酮在雙水相體系中的分配系數(shù),ρt、ρb分別為上、下相黃酮的質(zhì)量濃度(mg/mL);Y為黃酮在上相中的萃取率,R為相比,R=Vt/Vb,Vt、Vb分別為上、下相體積(mL)。

        2.4總黃酮的測定[10]

        2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精確稱取蘆丁對照品21.30 mg置于100 mL量瓶中,用無水乙醇溶解并定容至刻度,配制成質(zhì)量濃度為0.213 0 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確移取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL上述對照品溶液,分別置于25 mL量瓶中,加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL,放置6 min;加入10%的硝酸鋁1.0 mL,放置6 min,加入4%氫氧化鈉4.0 mL,加水至刻度,搖勻。在510 nm處測定吸收值。以吸光度A為縱坐標(biāo),以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為A=8.752 5C-0.017 3,結(jié)果表明大薊黃酮在8.5~51.1 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 7)。

        2.4.2樣品中總黃酮的測定 吸取上相或下相樣品溶液1.00 mL于25 mL量瓶中,按照“2.4.1”項(xiàng)下方法,測定吸光度,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃酮的量。

        2.5驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取大薊醇提物0.15 g,按最佳工藝條件進(jìn)行雙水相萃取,讀取上、下相體積,分析上、下相中大薊總黃酮的量,計(jì)算R、K和Y。

        2.6總黃酮純化倍數(shù)的測定 按最佳工藝條件對大薊醇提浸膏進(jìn)行雙水相萃取,取丙酮相(上相)揮干溶劑,得黃酮浸膏。分別精密稱取3份醇提浸膏和黃酮浸膏,配置成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的供試液,按照“2.4.1”項(xiàng)下方法,測定黃酮,計(jì)算萃取后黃酮的純化倍數(shù)。

        3 結(jié)果

        3.1丙酮與K2HPO4加入量對雙水相成相行為的影響 對丙酮、乙醇與(NH4)2SO4、K2HPO4進(jìn)行親水有機(jī)溶劑與鹽的兩兩組合的4個(gè)雙水相體系的成相研究,結(jié)果顯示:丙酮-K2HPO4-H2O體系中,V終/V始最趨近于1,且成相速度快,故選擇該體系作為雙水相體系。改變體系中丙酮及K2HPO4的加入量,以V終/V始(V終/V始趨近于1)為評價(jià)指標(biāo),考察丙酮和K2HPO4加入量對雙水相成相行為的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

        圖1 K2HPO4與丙酮加入量對雙水相成相行為的影響

        由圖1可知,丙酮體積分?jǐn)?shù)(φ丙酮)增大時(shí),分相所需的K2HPO4的最低量降低,但無機(jī)鹽的溶解度會(huì)下降。隨著K2HPO4的加入的量提高,V終/V始越趨近于1。在丙酮體積分?jǐn)?shù)φ丙酮=70%時(shí),K2HPO4的加入量ρ(K2HPO4)>0.20 g/mL,V終/V始趨近于1(<1.1),有好的成相行為,但K2HPO4的加入量ρ(K2HPO4)>0.30 g/mL下相黏度顯著增大,分相操作困難。φ丙酮>70%時(shí),雖易成相,且V終/V始趨近于1所需的K2HPO4的量更低,但K2HPO4溶解度下降且下相黏度明顯增大。故確定丙酮體積分?jǐn)?shù)(φ丙酮)為70%(V/V),K2HPO4的加入量在0.25 g/mL左右,為萃取大薊總黃酮合適的雙水相體系。

        3.2K2HPO4加入量對雙水相萃取大薊黃酮萃取效果的影響 室溫(25℃)下,φ丙酮=70%,改變K2HPO4質(zhì)量濃度(0.20~0.30 g/mL),K2HPO4加入量對萃取效果的影響如表1所示。由表1可知,ρ(K2HPO4)=0.24 g/mL時(shí),大薊黃酮有最大的分配系數(shù)和萃取率,故確定K2HPO4的加入量為0.24 g/mL。

        表1 磷酸氫二鉀的加入量對分配系數(shù)及萃取率的影響

        3.3pH對雙水相萃取大薊黃酮萃取效果的影響 室溫(25℃)下,φ丙酮=70%,ρ(K2HPO4)=0.24 g/mL,改變體系的pH(8~12),考察pH值對K和Y的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。由表2可知,pH越小,K和Y越大,但pH<8.0時(shí),下相出現(xiàn)了白色絮狀物,故確定pH=8.0為最佳pH。

        表2 pH對分配系數(shù)及萃取率的影響

        3.4溫度對雙水相萃取大薊黃酮萃取效果的影響 φ丙酮= 70%,ρ(K2HPO4)=0.24 g/mL,pH=8.0,改變溫度(10~60℃),考察溫度對雙水相萃取效果的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。由表3可知,當(dāng)溫度<50℃時(shí),溫度對K、Y影響不大,溫度的影響可忽略,故取常溫下(20~30℃)進(jìn)行雙水相萃取即可。

        3.5樣品加入量對雙水相萃取大薊黃酮萃取效果的影響

        室溫(25℃)下,φ丙酮=70%,ρ(K2HPO4)=0.24 g/mL,pH=8.0,考察醇提浸膏的加入量(0.05~0.50 g)對黃酮萃取效果的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。由表4所示,醇提浸膏的加入量在2.5~25mg/mL范圍內(nèi)K、Y基本保持不變,符合分配定律。

        表3 溫度對分配系數(shù)及萃取率的影響

        表4 樣品加入量對分配系數(shù)及萃取率的影響

        3.6驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 精密稱取3份大薊醇提浸膏各0.15 g,按實(shí)驗(yàn)獲得的最佳萃取工藝條件即φ丙酮=70%,ρ(K2HPO4)=0.24g/mL,pH=8.0,25℃,在丙酮-K2HPO4雙水相體系中萃取大薊總黃酮,測定上、下相中黃酮含有量,計(jì)算R、K和Y,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

        表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

        實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在最佳萃取工藝條件下,在兩相中黃酮的分配系數(shù)平均值為7.81(n=3,RSD=0.5%),丙酮相中黃酮的最大萃取率可達(dá)96.8%(n=3,RSD=0.6%)。

        3.7純化倍數(shù) 按照最佳工藝條件萃取大薊黃酮,測定萃取前后浸膏中總黃酮的量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示萃取前后浸膏中總黃酮的含有量分別為34.6%(n=3,RSD=1.5%)和89.8%(n=3,RSD=2.2%),萃取后浸膏中總黃酮的含有量是萃取前的2.6倍。

        4 結(jié)論

        4.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明利用丙酮-K2HPO4雙水相體系萃取大薊中的總黃酮,最佳工藝條件為:φ丙酮=70%,ρ(K2HPO4)=0.24g/mL,pH=8,室溫。在最佳工藝條件下大薊黃酮在兩相中的最大分配系數(shù)可達(dá)7.81,上相中最大萃取率達(dá)96.8%。大薊醇提物的質(zhì)量濃度在2.5~25 mg/mL范圍內(nèi),在兩相中的分配符合分配定律。雙水相萃取后大薊總黃酮純度提高了1.6倍,純度達(dá)89.8%。

        4.2雙水相萃取是一種可以不需要使用復(fù)雜設(shè)備,并在溫和條件下進(jìn)行簡單的操作就可獲得較高收率的有效成分的新型分離技術(shù)。但在應(yīng)用和研究過程中仍存在著易乳化、成相聚合物成本較高、水溶性高聚物大多數(shù)黏度較大、不易定量控制,高聚物回收困難等技術(shù)難題。而本實(shí)驗(yàn)中采用丙酮-K2HPO4-H2O體系是基于與水互溶的有機(jī)溶劑和鹽水的雙水相萃取體系,該體系具有溶劑價(jià)廉、低毒、易回收,避免使用高聚物等特點(diǎn),克服了一般雙水相體系的不足。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示這種新型的親水有機(jī)溶劑與鹽水組成的雙水相體系萃取大薊黃酮,萃取效果佳、純化倍數(shù)高、操作簡便快速、重復(fù)性好,有望應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。

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        R284.2

        B

        1001-1528(2015)01-0231-03

        10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.053

        2013-07-18

        江西省對外科技合作項(xiàng)目(贛財(cái)教[2008]212)

        丁 霞(1963—),女,博士,副教授,碩士生導(dǎo)師,研究方向:中藥藥效成分。Te1:(025)84396697,E-mai1:dingxia@ njau.edu.cn

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