丁 霞，　張允楠，　楊 云，　鐘凌云

（1.南京農業(yè)大學理學院，江蘇　南京　210095；2.江西中醫(yī)學院藥學院，江西　南昌　330004）

丙酮-K2HPO4雙水相體系萃取大薊總黃酮

丁 霞1，張允楠1，楊 云1，鐘凌云2

（1.南京農業(yè)大學理學院，江蘇南京210095；2.江西中醫(yī)學院藥學院，江西南昌330004）

目的 建立雙水相萃取大薊總黃酮的工藝參數(shù)。方法 以丙酮-K2HPO4為雙水相萃取體系，分配系數(shù)K和萃取率Y為考察指標，通過丙酮體積分數(shù)、K2HPO4質量濃度、pH、溫度等單因素分析考察雙水相萃取大薊總黃酮的最佳工藝條件。結果 其工藝參數(shù)為：丙酮體積分數(shù)70%，K2HPO4的質量濃度0.24 g/mL，pH 8.0，室溫。在該工藝條件下大薊總黃酮在兩相中的分配系數(shù)達7.81，萃取得率達96.8%，黃酮浸膏純度達89.8%。結論 該方法穩(wěn)定可行，操作簡便快速，廉價，萃取得率高，可用于分離純化大薊總黃酮。

大薊；總黃酮；雙水相體系

大薊是菊科植物薊Cirsiu japonicum var.Fisch.ex DC.的干燥地上部分，其味甘、苦，性涼，歸心、肝經，有涼血、止血、祛瘀、消癰腫的作用［1］。大薊含有多種化學成分，主要有三萜和甾體類、揮發(fā)油類、長鏈炔烯醇類、黃酮和黃酮苷類等化合物。藥理研究顯示大薊黃酮具有抗氧化、止血、抗腫瘤、抗糖尿病等藥理作用［2-4］。

雙水相萃取技術是指親水性聚合物水溶液在一定條件下可以形成雙水相，由于被分離物在兩相中的分配不同，便可實現(xiàn)分離［5-6］。事實上，能與水互溶的有機溶劑在無機鹽的存在下也可生成雙水相體系，這種新型的雙水相體系具有價廉、低毒、易回收且無需反萃和避免使用黏稠水溶性高聚物等特點，在天然產物的提取分離中已顯示出良好的應用前景［7-8］。本實驗采用丙酮-K2HPO4雙水相體系萃取分離大薊總黃酮，探討了丙酮體積分數(shù)、K2HPO4質量濃度、pH以及溫度等單因素對大薊黃酮在該體系的分配系數(shù)和萃取率的影響，為工業(yè)化利用大薊提供重要依據(jù)。

1　儀器與材料

KQ-500型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博迅公司醫(yī)療設備廠）；JB-2型恒溫磁力攪拌器（上海雷磁新涇儀器公司）；T6新世紀紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；pHS-25型酸度計（上海精密科學儀器有限公司）。蘆丁對照品（批號100080-200306，含量測定用，中國藥品生物制品檢定所），大薊（產地安徽，批號110815），磷酸氫二鉀、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、丙酮及其他試劑均為分析純。

2　方法

2.1大薊醇提物的制備 精密稱取100.0 g大薊，加10倍量體積的石油醚，超聲提取2次，每次30 min。過濾，揮盡石油醚，殘渣中按料液比1∶8的量加入70%乙醇超聲提取2次，每次30 min。過濾，合并濾液，旋轉蒸發(fā)揮去溶劑得大薊醇提浸膏，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2雙水相體系的制備 在20 mL的具塞試管中加入一定量的丙酮/乙醇、K2HPO4/（NH4）2SO4和水，使體系總體積為20 mL，振蕩2～3 min，靜置，待溶液分相后，讀取上相與下相的體積，計算V終/V始，V始為有機溶劑的加入量（mL），V終為成相后有機相的體積。根據(jù)V終/V始的計算結果，評價成相行為，確定雙水相體系［9］。

2.3萃取條件的優(yōu)化 在雙水相體系中加入0.15 g醇提浸膏，以分配系數(shù)K和回收率Y為指標，考察K2HPO4質量濃度、pH、溫度及樣品的加入量對萃取效果的影響。溶液分相后分別讀取上、下相體積，并取樣分析上、下相中大薊總黃酮的量。按下式計算黃酮的K和Y：

式中：K為黃酮在雙水相體系中的分配系數(shù)，ρt、ρb分別為上、下相黃酮的質量濃度（mg/mL）；Y為黃酮在上相中的萃取率，R為相比，R=Vt/Vb，Vt、Vb分別為上、下相體積（mL）。

2.4總黃酮的測定［10］

2.4.1標準曲線繪制 精確稱取蘆丁對照品21.30 mg置于100 mL量瓶中，用無水乙醇溶解并定容至刻度，配制成質量濃度為0.213 0 mg/mL的蘆丁標準溶液。準確移取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL上述對照品溶液，分別置于25 mL量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，放置6 min；加入10%的硝酸鋁1.0 mL，放置6 min，加入4%氫氧化鈉4.0 mL，加水至刻度，搖勻。在510 nm處測定吸收值。以吸光度A為縱坐標，以蘆丁標準溶液質量濃度C（mg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，回歸方程為A=8.752 5C-0.017 3，結果表明大薊黃酮在8.5～51.1 mg/L范圍內線性關系良好（r=0.999 7）。

2.4.2樣品中總黃酮的測定 吸取上相或下相樣品溶液1.00 mL于25 mL量瓶中，按照“2.4.1”項下方法，測定吸光度，代入標準曲線計算黃酮的量。

2.5驗證試驗 稱取大薊醇提物0.15 g，按最佳工藝條件進行雙水相萃取，讀取上、下相體積，分析上、下相中大薊總黃酮的量，計算R、K和Y。

2.6總黃酮純化倍數(shù)的測定 按最佳工藝條件對大薊醇提浸膏進行雙水相萃取，取丙酮相（上相）揮干溶劑，得黃酮浸膏。分別精密稱取3份醇提浸膏和黃酮浸膏，配置成質量濃度為1.0 mg/mL的供試液，按照“2.4.1”項下方法，測定黃酮，計算萃取后黃酮的純化倍數(shù)。

3　結果

3.1丙酮與K2HPO4加入量對雙水相成相行為的影響 對丙酮、乙醇與（NH4）2SO4、K2HPO4進行親水有機溶劑與鹽的兩兩組合的4個雙水相體系的成相研究，結果顯示：丙酮-K2HPO4-H2O體系中，V終/V始最趨近于1，且成相速度快，故選擇該體系作為雙水相體系。改變體系中丙酮及K2HPO4的加入量，以V終/V始（V終/V始趨近于1）為評價指標，考察丙酮和K2HPO4加入量對雙水相成相行為的影響，實驗結果如圖1所示。

圖1　K2HPO4與丙酮加入量對雙水相成相行為的影響

由圖1可知，丙酮體積分數(shù)（φ丙酮）增大時，分相所需的K2HPO4的最低量降低，但無機鹽的溶解度會下降。隨著K2HPO4的加入的量提高，V終/V始越趨近于1。在丙酮體積分數(shù)φ丙酮=70%時，K2HPO4的加入量ρ（K2HPO4）＞0.20 g/mL，V終/V始趨近于1（＜1.1），有好的成相行為，但K2HPO4的加入量ρ（K2HPO4）＞0.30 g/mL下相黏度顯著增大，分相操作困難。φ丙酮＞70%時，雖易成相，且V終/V始趨近于1所需的K2HPO4的量更低，但K2HPO4溶解度下降且下相黏度明顯增大。故確定丙酮體積分數(shù)（φ丙酮）為70%（V/V），K2HPO4的加入量在0.25 g/mL左右，為萃取大薊總黃酮合適的雙水相體系。

3.2K2HPO4加入量對雙水相萃取大薊黃酮萃取效果的影響 室溫（25℃）下，φ丙酮=70%，改變K2HPO4質量濃度（0.20～0.30 g/mL），K2HPO4加入量對萃取效果的影響如表1所示。由表1可知，ρ（K2HPO4）=0.24 g/mL時，大薊黃酮有最大的分配系數(shù)和萃取率，故確定K2HPO4的加入量為0.24 g/mL。

表1　磷酸氫二鉀的加入量對分配系數(shù)及萃取率的影響

3.3pH對雙水相萃取大薊黃酮萃取效果的影響 室溫（25℃）下，φ丙酮=70%，ρ（K2HPO4）=0.24 g/mL，改變體系的pH（8～12），考察pH值對K和Y的影響，實驗結果如表2所示。由表2可知，pH越小，K和Y越大，但pH＜8.0時，下相出現(xiàn)了白色絮狀物，故確定pH=8.0為最佳pH。

表2　pH對分配系數(shù)及萃取率的影響

3.4溫度對雙水相萃取大薊黃酮萃取效果的影響 φ丙酮= 70%，ρ（K2HPO4）=0.24 g/mL，pH=8.0，改變溫度（10～60℃），考察溫度對雙水相萃取效果的影響，實驗結果如表3所示。由表3可知，當溫度＜50℃時，溫度對K、Y影響不大，溫度的影響可忽略，故取常溫下（20～30℃）進行雙水相萃取即可。

3.5樣品加入量對雙水相萃取大薊黃酮萃取效果的影響

室溫（25℃）下，φ丙酮=70%，ρ（K2HPO4）=0.24 g/mL，pH=8.0，考察醇提浸膏的加入量（0.05～0.50 g）對黃酮萃取效果的影響，實驗結果如表4所示。由表4所示，醇提浸膏的加入量在2.5～25mg/mL范圍內K、Y基本保持不變，符合分配定律。

表3　溫度對分配系數(shù)及萃取率的影響

表4　樣品加入量對分配系數(shù)及萃取率的影響

3.6驗證試驗結果 精密稱取3份大薊醇提浸膏各0.15 g，按實驗獲得的最佳萃取工藝條件即φ丙酮=70%，ρ（K2HPO4）=0.24g/mL，pH=8.0，25℃，在丙酮-K2HPO4雙水相體系中萃取大薊總黃酮，測定上、下相中黃酮含有量，計算R、K和Y，實驗結果如表5所示。

表5　驗證試驗結果

實驗結果表明在最佳萃取工藝條件下，在兩相中黃酮的分配系數(shù)平均值為7.81（n=3，RSD=0.5%），丙酮相中黃酮的最大萃取率可達96.8%（n=3，RSD=0.6%）。

3.7純化倍數(shù) 按照最佳工藝條件萃取大薊黃酮，測定萃取前后浸膏中總黃酮的量，實驗結果顯示萃取前后浸膏中總黃酮的含有量分別為34.6%（n=3，RSD=1.5%）和89.8%（n=3，RSD=2.2%），萃取后浸膏中總黃酮的含有量是萃取前的2.6倍。

4　結論

4.1實驗結果表明利用丙酮-K2HPO4雙水相體系萃取大薊中的總黃酮，最佳工藝條件為：φ丙酮=70%，ρ（K2HPO4）=0.24g/mL，pH=8，室溫。在最佳工藝條件下大薊黃酮在兩相中的最大分配系數(shù)可達7.81，上相中最大萃取率達96.8%。大薊醇提物的質量濃度在2.5～25 mg/mL范圍內，在兩相中的分配符合分配定律。雙水相萃取后大薊總黃酮純度提高了1.6倍，純度達89.8%。

4.2雙水相萃取是一種可以不需要使用復雜設備，并在溫和條件下進行簡單的操作就可獲得較高收率的有效成分的新型分離技術。但在應用和研究過程中仍存在著易乳化、成相聚合物成本較高、水溶性高聚物大多數(shù)黏度較大、不易定量控制，高聚物回收困難等技術難題。而本實驗中采用丙酮-K2HPO4-H2O體系是基于與水互溶的有機溶劑和鹽水的雙水相萃取體系，該體系具有溶劑價廉、低毒、易回收，避免使用高聚物等特點，克服了一般雙水相體系的不足。實驗結果顯示這種新型的親水有機溶劑與鹽水組成的雙水相體系萃取大薊黃酮，萃取效果佳、純化倍數(shù)高、操作簡便快速、重復性好，有望應用于工業(yè)化生產。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：23.

［2］植 飛，孔令義.中藥大薊的化學及藥理研究進展［J］.中草藥，2001，32（7）：664-667.

［3］蔣秀雷，范春林，葉文才.大薊化學成分的研究［J］.中藥材，2006，37（4）：510-512.

［4］宋澤規(guī)，薛 偉.大薊的研究進展［J］.廣州化工，2011，39（7）：13-15.

［5］馬春宏，朱 紅，王 良，等.雙水相萃取技術的應用研究進展［J］.光譜實驗室，2010，27（5）：1906-1914.

［6］陳叢瑾，屈麗娟，陳 東.雙水相萃取法分離純化黃酮類化合物的研究進展［J］.應用化工，2010，39（10）：1587-1596.

［7］李麗敏，尚慶坤.親水有機溶劑/無機鹽雙水相萃取技術在分離提純生物物質中的應用［J］.光譜實驗室，2011，28（6）：3073-3078.

［8］富 永，苗艷麗，蘇舒華，等.雙水相萃取凝膠色譜聯(lián)用法提取菲牛蛭中的水蛭素［J］.中國藥學雜志，2012，47（7）：489-494.

［9］霍 清，王 強.利用丙酮/磷酸氫二鉀雙水相體系分離純化綠原酸的研究［J］.食品科學，2008，29（11）：234-236.

［10］史禮貌，解成喜.新疆大薊總黃酮的超聲提取及抗氧化性研究［J］.食品科學，2011，32（6）：120-123.

R284.2

B

1001-1528（2015）01-0231-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.053

2013-07-18

江西省對外科技合作項目（贛財教［2008］212）

丁 霞（1963—），女，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：中藥藥效成分。Te1：（025）84396697，E-mai1：dingxia@ njau.edu.cn