劉鈞天,崔瑩雪,黃玉海,黃暢,黃劍,趙百孝,韓麗,楊佳,王磊

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬護(hù)國(guó)寺中醫(yī)醫(yī)院,北京 100035;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院,北京 100010;3.中國(guó)中醫(yī)藥科技開(kāi)發(fā)交流中心,北京 100010;4.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,北京 100029)

艾灸作為針灸學(xué)科的重要組成部分,從古至今廣泛應(yīng)用于疾病治療及預(yù)防保健等方面。古代醫(yī)家都提倡用艾灸防病強(qiáng)身,延緩衰老,如《醫(yī)學(xué)入門(mén)》記載:“凡一年四季各要熏一次,元?dú)鈭?jiān)固,百病不生?！卑瑹熥鳛榘倪^(guò)程中的重要組成部分,其主要成分與生物活性均參與到艾灸療效的發(fā)揮過(guò)程中。我們前期研究證明艾煙可提高人體自主神經(jīng)系統(tǒng)活力[1],改善SAMP8小鼠腦中的氧化應(yīng)激狀態(tài)[2]。初步提示艾煙可以改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能。

載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠作為一種新型動(dòng)物模型廣泛應(yīng)用于阿茨海默病發(fā)生機(jī)制的研究中。許多研究證實(shí)ApoE基因缺失對(duì)認(rèn)知功能的影響尤其是老化后出現(xiàn)的智力下降與氧化性損傷增強(qiáng)有關(guān)[3-4]。

為進(jìn)一步了解艾煙對(duì)阿茨海默病小鼠模型學(xué)習(xí)記憶功能與海馬膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)的影響。本實(shí)驗(yàn)以ApoE-/-小鼠為模型,通過(guò)對(duì)比觀察艾煙暴露與香煙暴露兩種不同干預(yù)方式對(duì)其自主行為及腦組織海馬中GFAP表達(dá)的影響,探討艾煙對(duì)腦組織衰老的干預(yù)作用,以期為探索艾灸療法延緩衰老機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選用清潔級(jí)8周齡雄性載脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE-/-)27只,C57BL/6小鼠13只,體重30 g,購(gòu)自北京大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)中心[許可證為SCXK(京)2011-0012]。ApoE-/-小鼠采用高脂飼料喂養(yǎng),C57BL/6小鼠采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),自由進(jìn)水;飼養(yǎng)環(huán)境溫度 22℃±2℃,相對(duì)濕度 50%～60%,保持 12 h光照(8:00-20:00)和黑暗(20:00至次日8:00)交替循環(huán)。

小鼠購(gòu)進(jìn)后,適應(yīng)性飼養(yǎng)1星期,干預(yù)12星期。按隨機(jī)數(shù)字表法將ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為ApoE-/-模型組、艾煙組、香煙組3組(每組9只),并將13只C57BL/6小鼠作為空白對(duì)照組進(jìn)行對(duì)照。在干預(yù)12星期后,所有小鼠進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試,隨后全部處死,每組隨機(jī)選取6只小鼠大腦進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料、儀器及試劑

自制細(xì)艾條(直徑0.5 cm×長(zhǎng)20 cm,河南南陽(yáng)漢醫(yī)艾絨有限公司);香煙(中南海牌,焦油含量 10 mg/支);自制帶孔玻璃缸(1 m×1 m×1 m,頂層玻璃正中設(shè)一直徑5 mm圓孔);光散射式數(shù)字粉塵測(cè)試儀(北京賓達(dá)綠創(chuàng)科技有限公司);小鼠自主行為測(cè)試儀(UGO Basile);GFAP兔抗小鼠抗體(Abcam);中性樹(shù)膠封片劑;多聚甲醛,中性樹(shù)膠及其他生物試劑(Sigma)。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 空白暴露

將空白對(duì)照組與ApoE-/-模型組小鼠分別暴露于玻璃缸中20 min。

1.3.2 艾煙、香煙干預(yù)

1.3.2.1 艾煙干預(yù)

將調(diào)試好的粉塵測(cè)試儀置于玻璃缸中間,將艾煙組小鼠自由暴露在玻璃缸中,點(diǎn)燃自制細(xì)艾條,從玻璃缸上方的圓孔將點(diǎn)燃的一端插入,令艾煙充滿玻璃缸。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)論[5],控制艾煙濃度為 5～15 mg/m3。用粉塵測(cè)試儀測(cè)試其濃度達(dá)到預(yù)定范圍后(此過(guò)程艾條燃燒約 15 s),將艾條取出,迅速封閉圓孔。此后每隔 3 min記錄一次濃度數(shù)值,使?jié)舛确€(wěn)定在 10 mg/m3左右。若數(shù)值高于 15 mg/m3,可將上方玻璃蓋稍微移動(dòng),令艾煙散去部分后迅速將蓋子移回;若數(shù)值低于5 mg/m3,可再將點(diǎn)燃的艾條由圓孔插入,以補(bǔ)充艾煙。20 min后,取出小鼠,每星期干預(yù)6 d,共干預(yù)12星期。

1.3.2.2 香煙干預(yù)

除將艾條換成香煙,香煙濃度及干預(yù)方式與艾煙組相同。在進(jìn)行香煙干預(yù)時(shí)要保證與其他組別嚴(yán)格隔離,避免其他組別嗅到香煙。

1.3.3 自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)

小鼠自主活動(dòng)測(cè)試儀,定時(shí)為 5 min,將小鼠放入實(shí)驗(yàn)活動(dòng)儀反應(yīng)槽中,蓋上蓋子后開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn),當(dāng)小鼠站立時(shí),反應(yīng)槽周圍上方的紅外線探頭探測(cè)到信號(hào)改變,當(dāng)小鼠沒(méi)有站立,而是在爬行時(shí),反應(yīng)槽周圍下方的紅外線探頭探測(cè)到信號(hào)改變,數(shù)據(jù)均自動(dòng)記錄。

1.3.4 標(biāo)本制備與圖像采集

隨機(jī)選取6只,用10%水合氯醛按3 mL/kg腹腔注射麻醉小鼠,經(jīng)一側(cè)頸總動(dòng)脈先注射200 mL生理鹽水灌注沖洗后,再灌注 4%多聚甲醛直至流出的液體澄清。靜置30 min后開(kāi)顱取腦(視交叉與乳頭體之間的腦組織),置4%多聚甲醛中固定過(guò)夜,流水沖洗30 min,用各級(jí)乙醇脫水,苯透明,浸蠟,常規(guī)包塊。轉(zhuǎn)化切片機(jī)切片,制備腦冠狀面切片,片厚約6 μm。

免疫組織化學(xué)超敏法[6]一抗為兔抗小鼠GFAP多倍體克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)。其中A液,即用型過(guò)氧化物酶阻斷劑;B液,即用型非免疫血清;C液,即用型生物素標(biāo)記二抗;D液,即用型鏈霉素抗生物素蛋白過(guò)氧化物酶標(biāo)記三抗。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,替代實(shí)驗(yàn)用0.01 mol/mL PBS代替一抗,其他步驟不變,結(jié)果為陰性。

于400倍Olympus顯微鏡下觀察海馬切片上GFAP陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)和分布特征;用Leica Qwin Plus圖像分析儀計(jì)數(shù)每張切片5個(gè)視野海馬結(jié)構(gòu)0.1 mm2GFAP的積分光密度(IOD)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。符合正態(tài)性和方差齊性的數(shù)據(jù),采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 自主活動(dòng)成績(jī)分析

空白組小鼠活動(dòng)距離與站立次數(shù)均高于模型組小鼠(P＜0.05),表明ApoE-/-小鼠會(huì)降低中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性。艾煙組移動(dòng)距離高于模型組(P＜0.05),但與空白組無(wú)差別,站立次數(shù)與模型組無(wú)差異,但低于空白組。表明艾煙可以提高ApoE-/-小鼠活動(dòng)性,增強(qiáng)其運(yùn)動(dòng)能力。香煙組沒(méi)有表現(xiàn)出與模型組、艾煙組的明顯差異,但香煙組活動(dòng)距離與站立次數(shù)均差于空白組(P＜0.05),說(shuō)明香煙組小鼠活動(dòng)能力低于正常小鼠。詳見(jiàn)圖1-2,表1。

圖1 各組小鼠自主活動(dòng)移動(dòng)距離

圖2 各組小鼠自主活動(dòng)站立次數(shù)

表1 各組小鼠的自主活動(dòng)行為 (±s)

表1 各組小鼠的自主活動(dòng)行為 (±s)

注:在第 1星期適應(yīng)性喂養(yǎng)中由于飼養(yǎng)環(huán)境改變模型組小鼠死亡 3只,香煙組死亡1只。與模型組比較1)P＜0.05;與空白組比較2)P＜0.05

組別 n 活動(dòng)距離(mm)站立次數(shù)(次)空白組 13 580.54±130.511) 36.79±18.931)模型組 6 304.00±76.87 10.11±5.49艾煙組 9 477.93±81.791) 18.37±9.362)香煙組 8 359.54±106.612) 12.46±7.832)

2.2 各組小鼠海馬中GFAP蛋白表達(dá)

GFAP免疫陽(yáng)性反應(yīng)在細(xì)胞中呈現(xiàn)兩種形態(tài),一種原漿性星形膠質(zhì)細(xì)胞體型較大,呈圓形或橢圓形,突起粗短、數(shù)量較少,GFAP免疫陽(yáng)性產(chǎn)物聚集細(xì)胞體一側(cè);另一種纖維性星形膠質(zhì)細(xì)胞體型較小,呈星性或多角形,突起細(xì)長(zhǎng)、分部廣泛,GFAP免疫陽(yáng)性產(chǎn)物充滿細(xì)胞體(圖3)。模型組小鼠海馬中GFAP免疫反應(yīng)產(chǎn)物積分光密度值明顯高于空白組與艾煙組(P＜0.05)(表2)。香煙組小鼠海馬 GFAP表達(dá)高于艾煙組與空白組(P＜0.05)。說(shuō)明艾煙較香煙能減低ApoE-/-小鼠海馬中GFAP的表達(dá)。

表2 各組小鼠海馬結(jié)構(gòu)GFAP免疫反應(yīng)產(chǎn)物的積分光密度值 (±s)

表2 各組小鼠海馬結(jié)構(gòu)GFAP免疫反應(yīng)產(chǎn)物的積分光密度值 (±s)

注:與模型組比較1)P＜0.05,2)P＜0.01;與空白組比較3)P＜0.05;與香煙組比較4)P＜0.05

組別 n GFAP免疫反應(yīng)產(chǎn)物的積分光密度值空白組 6 4.30±1.522)模型組 6 13.90±4.06艾煙組 6 7.60±2.281)4)香煙組 6 12.40±4.683)

圖3 各組小鼠海馬CA3區(qū)GFAP表達(dá)(×400)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)各組小鼠進(jìn)行自主活動(dòng)觀察,發(fā)現(xiàn)模型組小鼠自主活動(dòng)移動(dòng)距離和站立次數(shù)均比空白組小鼠減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明ApoE-/-小鼠的活動(dòng)性降低,運(yùn)動(dòng)能力減弱,對(duì)新環(huán)境認(rèn)知能力較差,對(duì)潛在危險(xiǎn)缺乏警惕。許多研究證實(shí),ApoE-/-小鼠在幼齡時(shí)就會(huì)出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性降低甚至認(rèn)知功能障礙,而這種情況會(huì)隨著年齡的增加日漸加重[7]。艾煙干預(yù)后,其自主活動(dòng)移動(dòng)距離較模型組明顯增多,說(shuō)明艾煙可使 ApoE-/-小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性提高,運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng),對(duì)新環(huán)境有更好的認(rèn)知與適應(yīng)性。本研究中,艾煙組小鼠表現(xiàn)優(yōu)于香煙組小鼠,但未產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,如果加大樣本量,期望能出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)數(shù)量最多、功能最復(fù)雜的一種膠質(zhì)細(xì)胞,幾乎占腦容量的50%以上,對(duì)神經(jīng)元的存活、腦組織的修復(fù)起重要作用[8]。GFAP作為一個(gè)典型的星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物,會(huì)隨動(dòng)物與人大腦年齡的增長(zhǎng)而表達(dá)增加[9]。而ApoE-/-小鼠與衰老野生小鼠腦中GFAP蛋白含量同樣呈現(xiàn)高表達(dá),說(shuō)明ApoE-/-小鼠與衰老有著非常密切的聯(lián)系[10]。亦有研究表明,在阿茨海默病(AD)的病理過(guò)程[11]中,星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)被β淀粉樣蛋白激活,大量增殖,產(chǎn)生細(xì)胞炎性分子、氧自由基等物質(zhì)并啟動(dòng)炎性反應(yīng),促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的損傷與凋亡,大大加速AD進(jìn)程。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成中的一種重要的細(xì)胞骨架蛋白,有著保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用,其大量表達(dá)以對(duì)抗腦中氧化損傷。本研究中,空白組與艾煙組海馬GFAP蛋白表達(dá)低于模型組與香煙組,間接說(shuō)明,兩組小鼠腦中氧化損傷較小,衰老程度降低。因此提示艾煙可以通過(guò)降低腦內(nèi)氧化應(yīng)激損傷起到保護(hù)腦組織進(jìn)而抗衰老的作用。

艾煙的安全性與多種生物活性同樣倍受關(guān)注。在對(duì)艾煙進(jìn)行系統(tǒng)毒理學(xué)分析后,得出其半數(shù)致死濃度LC50=11117 mg/m3[12];亞慢性毒理實(shí)驗(yàn)說(shuō)明艾煙不能引起大鼠臟器萎縮與水腫[13];在艾煙致畸與致突變?cè)囼?yàn)中發(fā)現(xiàn),高于臨床濃度百倍的艾煙冷凝物才會(huì)產(chǎn)生潛在的致畸與致突變特性[14-15]。本課題組前期研究亦證實(shí),臨床濃度(2.5～3.5 mg/m3)艾煙對(duì)大鼠其他臟器不會(huì)產(chǎn)生任何病理改變,且不會(huì)引起全身過(guò)敏反應(yīng)[16]?？傊?各項(xiàng)研究結(jié)果都說(shuō)明臨床濃度艾煙的基本安全性。然而,香煙的毒理研究發(fā)現(xiàn)香煙煙霧對(duì)小鼠各系統(tǒng)有較強(qiáng)的急性、慢性毒性作用[17]與致突變效應(yīng)[18],說(shuō)明香煙對(duì)人體會(huì)產(chǎn)生各種可能的危害。

艾煙是艾灸過(guò)程中,艾絨燃燒產(chǎn)生的煙氣,其中揮發(fā)性成分有26種[19]。香煙中的主要芳香成分也有165種[20]。早在1949年R.W.Monorieff就提出“氣味的立體化學(xué)論”這一理論,認(rèn)為當(dāng)空氣中氣味分子適合于嗅神經(jīng)的某些輔助性受體部位的時(shí)候,人類或動(dòng)物就會(huì)嗅到它們。這一理論經(jīng)過(guò)多年發(fā)展完善,Buck L等[21]在研究中闡明不同的嗅覺(jué)感受器內(nèi)涵特殊的受體蛋白,當(dāng)特定氣味分子被嗅覺(jué)感受器識(shí)別,就會(huì)引發(fā)其動(dòng)作電位,由嗅絲傳遞到嗅球被特殊的受體蛋白識(shí)別。通過(guò)僧帽細(xì)胞和叢狀細(xì)胞軸突組成的嗅束將信號(hào)投射到初級(jí)嗅覺(jué)皮質(zhì)中樞,最終可以投射到下丘腦、邊緣系統(tǒng)、海馬等部位[22],直接參與到情緒調(diào)節(jié),學(xué)習(xí)記憶的識(shí)別、編碼與儲(chǔ)存。因此,我們推測(cè)艾煙與香煙也是通過(guò)干預(yù)嗅覺(jué)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì),影響嗅覺(jué)傳導(dǎo)通路,從而改善情緒以及學(xué)習(xí)記憶功能,增強(qiáng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性。

艾煙可提高ApoE-/-小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性,并通過(guò)改善腦中氧化應(yīng)激損傷,降低GFAP蛋白在海馬的表達(dá)起到延緩大腦衰老的作用。

[1]Cui Y, Zhao B, Huang Y, et al. Effects of moxa (Folium Artemisiae argyi)smoke exposure on heart rate and heart rate variability in healthy young adults: A randomized, controlled human study[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2013,(2013):510318.

[2]孟笑男,徐煥芳,崔瑩雪,等.艾燃燒生成物對(duì)快速老化模型小鼠大腦 SOD、MDA和 GSH-Px的影響[J].環(huán)球中醫(yī)藥,2011,4(6):413-415.

[3]Fisher A, Brandeis R, Chapman S, et al. M1 muscarinic agonist treatment reverses cognitive and cholinergic impairments of apolipoprotein E-deficient mice[J]. J Neurochem, 1998,70(5):1991-1997.

[4]Kitagawa K, Matsumoto M, Hori M, et al. Neuroprotective effect of apolipoprotein E against ischemia[J]. Ann N Y Acad Sci, 2002,977:468-475.

[5]許煥芳,崔瑩雪,黃茶熙,等.艾燃燒生成物對(duì)快速老化模型小鼠SAMP8血清抗氧化酶的影響[J].中國(guó)針灸,2012,32(1):53-57.

[6]張潔,宿寶貴.電針對(duì)腦梗塞大鼠海馬結(jié)構(gòu)內(nèi) GFAP免疫陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響[J].解剖學(xué)研究,2010,32(1):6-9.

[7]Segev Y, Michaelson DM, Rosenblum K. ApoE epsilon4 is associated with eIF2alpha phosphorylation and impaired learning in young mice[J]. Neurobiol Aging, 2013,34(3):863-872.

[8]侯德仁,薛俐,陳坤,等.丁苯酞對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠海馬GFAP和 VEGF的影響[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2010,53(2):111-115.

[9]Haley GE, Kohama SG, Urbanski HF, et al. Age-related decreases in SYN levels associated with increases in MAP-2, apoE, and GFAP levels in the rhesus macaque prefrontal cortex and hippocampus[J].Age (Dordr), 2010,32(3):283-296.

[10]Choi J, Forster MJ, McDonald SR, et al. Proteomic identification of specific oxidized proteins in ApoE-knockout mice: relevance to Alzheimer’s disease[J]. Free Radic Biol Med, 2004,36(9):1155-1162.

[11]Kuchibhotla KV, Lattarulo CR, Hyman BT, et al. Synchronous hyperactivity and intercellular calcium waves in astrocytes in Alzheimer mice[J]. Science, 2009,323(5918):1211-1215.

[12]蘭蕾,常小榮,譚靜,等.艾煙的急性毒理試驗(yàn)[J].光明中醫(yī),2011,27(10):1992-1995.

[13]蘭蕾,張國(guó)山,石佳,等.艾煙對(duì)大鼠的亞慢性毒理試驗(yàn)一般生理性指標(biāo)分析[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2014,25(5):1241-1244.

[14]韓麗,劉平,胡海,等.艾煙中可吸入顆粒誘發(fā)染色體畸變效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志,2013,20(1):34-36.

[15]韓麗,胡海,劉平,等.艾煙中可吸入顆粒物致鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)[J].中華中醫(yī)藥雜志,2013,28(6):1860-1863.

[16]王磊,哈略,韓麗,等.平均臨床濃度艾煙下的豚鼠全身過(guò)敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)研究(英文)[J].中華中醫(yī)藥雜志,2014,29(5):1477-1483.

[17]顧小紅,周穎婷,張淑華,等.香煙煙霧水溶物對(duì)小鼠急慢性毒性實(shí)驗(yàn)的研究[J].嘉興學(xué)院學(xué)報(bào),2008,24(6):29-31.

[18]高永,郝恩柱,倪艷波.香煙和綠茶對(duì)輻射致突變效應(yīng)的影響[J].中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志,2006,26(4):355-357.

[19]靳然,趙百孝,于密密,等.艾燃燒生成物組分固相微萃取氣相色譜質(zhì)譜法定性分析[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2011,51(9):632-636.

[20]黃映鳳,楊君,郭偉強(qiáng),等.中藥指紋圖譜對(duì)香煙質(zhì)量控制的啟示[J].理化檢驗(yàn)(化學(xué)分冊(cè)),2009,47(1):119-124.

[21]Buck L, Axel R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition[J]. Cell, 1991,65(1):175-187.

[22]Insausti R, Marcos P, Arroyo-Jimenez MM, et al. Comparative aspects of the olfactory portion of the entorhinal cortex and its projection to the hippocampus in rodents, nonhuman primates, and the human brain[J]. Brain Res Bull, 2002,57(3-4):557-560.