范建濤，張愛琳，2，*，姚　堯，張鈺鑫，苗　穎，2（.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384；2.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津300384）

間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)堅(jiān)果類過敏原特異性研究

范建濤1，張愛琳1，2，*，姚堯1，張鈺鑫1，苗穎1，2
（1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384；2.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津300384）

以腰果蛋白為過敏抗原，腰果蛋白致敏的陽(yáng)性小鼠血清作為一抗，羊抗鼠IgE-HRP為二抗建立雙抗體間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）體系，通過棋盤法確定腰果蛋白最佳反應(yīng)條件工作濃度為15.92 μg/mL，最佳一抗稀釋度均為1∶400，最佳酶標(biāo)二抗的稀釋度為1∶1000，腰果蛋白濃度為1.99 μg/mL。并用該方法分別對(duì)腰果、核桃、榛子、開心果、板栗、杏仁等六種堅(jiān)果進(jìn)行檢測(cè)分析，未發(fā)現(xiàn)有交叉反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)建立的間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA診斷方法具有良好的敏感性和特異性，為堅(jiān)果過敏性食品的監(jiān)測(cè)及時(shí)而準(zhǔn)確的診斷奠定了基礎(chǔ)。

堅(jiān)果，過敏原，ELISA，棋盤法

隨著食品行業(yè)的加速發(fā)展，食品過敏的發(fā)病率和流行情況日益加劇，食品過敏性疾病已成為一個(gè)新興的、公眾性、全球性的健康問題［1-2］。加之，食物過敏原的種類和來(lái)源急劇增加，與食物過敏直接相關(guān)的過敏性疾病亦趨于多樣化、復(fù)雜化和嚴(yán)重化［3］，國(guó)外流行病學(xué)調(diào)查表明，約1%～2%的成人和5%～7%的兒童對(duì)一種或者幾種食品過敏［4］，因此食物過敏已被視為一種嚴(yán)重的世界公共衛(wèi)生問題［5］。堅(jiān)果類食品具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及其獨(dú)特的風(fēng)味，作為療效食品和休閑食品備受消費(fèi)者的喜愛，但是堅(jiān)果類食品過敏問題涉及食物過敏癥的90%［6］，在食品標(biāo)簽上標(biāo)明過敏原的存在是避免過敏患者攝入潛在過敏原的最有效的途徑。目前，ELISA酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)技術(shù)是將免疫反應(yīng)與現(xiàn)代檢測(cè)手段相結(jié)合而建立的超微量測(cè)定技術(shù)，是以抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析技術(shù)，在過敏原的檢測(cè)中也有較廣泛的應(yīng)用［7］。本研究通過建立間接ELISA法來(lái)檢測(cè)核桃蛋白過敏原的最佳工作濃度、靈敏度與特異性，建立一種可靠的過敏原檢測(cè)方法確保食品標(biāo)簽一致性，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)定堅(jiān)果過敏蛋白及其特異性IgE抗體的方法，為堅(jiān)果蛋白過敏的研究和診斷提供方法和技術(shù)參數(shù)［8］。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

腰果、板栗、開心果、榛子、杏仁、核桃均購(gòu)自天津市物美超市，產(chǎn)地河北??；堅(jiān)果各類過敏蛋白由天津農(nóng)學(xué)院食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)室提供；BCA蛋白定量試劑盒博士德生物；ECL化學(xué)發(fā)光顯色液上海西唐生物科技有限公司；HRP標(biāo)記山羊抗人IgE抗體（進(jìn)口） 艾美捷科技有限公司；堅(jiān)果過敏病人陽(yáng)性血清（7人混合） 天津市某醫(yī)院。

超凈工作臺(tái)蘇凈集團(tuán)安泰公司；立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠；酶標(biāo)儀賽默飛科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1蛋白質(zhì)含量的測(cè)定解凍蛋白質(zhì)樣品之后用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行測(cè)定，參照操作說明進(jìn)行，蛋白質(zhì)樣品分別稀釋2、4、8倍。

1.2.2過敏陽(yáng)性小鼠血清制備1∶10稀釋液配制：在超凈工作臺(tái)中用移液槍吸取100 μL陽(yáng)性小鼠血清加入900 μL高壓蒸汽滅菌過的磷酸鹽緩沖液后混勻。1∶100稀釋液，1∶200稀釋液，1∶400稀釋液方法同1∶10稀釋液配制。

羊抗鼠IgE-HRP抗體：配制母液：在超凈臺(tái)下用移液槍吸取1 mL高壓蒸汽滅菌過的PBST加入羊抗鼠IgE-HRP抗體后混勻，加入1 mL甘油后4℃保存。各稀釋液配制同上。

1.2.3抗原、包被抗體及酶標(biāo)二抗工作濃度的選擇采用棋盤法［9］實(shí)驗(yàn)來(lái)篩選優(yōu)化抗原、抗體及酶標(biāo)二抗的最佳工作濃度。將稀釋為1∶100、1∶200、1∶400的小鼠血清分別加入96孔酶標(biāo)板中，封閉好后4℃恒溫包被過夜。吸取去除包被液，每孔加入洗滌液（PBST）洗板3次。加入封閉液（PBST），200 μL/孔，在37℃恒溫箱內(nèi)孵育2 h。去除封閉液，接著繼續(xù)加入洗滌緩沖液（PBST）洗板3次。然后分別加入堅(jiān)果蛋白母液及稀釋為2倍、4倍、8倍的蛋白液，同時(shí)設(shè)PBS陰性對(duì)照，在37℃恒溫箱內(nèi)孵育1 h。去掉蛋白液，再用洗滌緩沖液（PBST）洗板3次。將稀釋為1∶500，1∶1000，1∶2000的羊抗鼠IgE-HRP抗體，在37℃恒溫箱內(nèi)孵育1 h。去除酶標(biāo)二抗，再用洗滌緩沖液（PBST）洗板10次。加入底物OPD溶液（顯色液），在37℃恒溫箱內(nèi)孵育30 min，加入2 mol/L硫酸（終止液），50 μL/孔，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD492的值。每孔加液量均為：100 μL/孔。

1.2.4間接ELISA法靈敏度的測(cè)定根據(jù)上述建立的ELISA法，測(cè)定不同稀釋度的堅(jiān)果蛋白液的吸光度值。根據(jù)待測(cè)孔與對(duì)照孔的吸光度之比（P/N值）及OD492來(lái)判斷靈敏度，當(dāng)P/N大于等于2.1時(shí)，為陽(yáng)性；當(dāng)P/N小于2.1時(shí)，為陰性。以最高的堅(jiān)果蛋白液稀釋度作為間接ELISA法的檢測(cè)靈敏度。

1.2.5間接ELISA的特異性檢測(cè)通過堅(jiān)果脫脂、鹽析、透析及過葡聚糖凝膠柱得到各種堅(jiān)果（腰果、核桃、榛子、開心果、板栗、杏仁）的蛋白液為抗原，進(jìn)行間接ELISA實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)OD492值。實(shí)驗(yàn)中分別以開心果、板栗、杏仁、核桃為抗原，測(cè)出OD492值，當(dāng)P/N大于等于2.1時(shí)，為陽(yáng)性；當(dāng)P/N小于2.1時(shí)，為陰性。根據(jù)其各自O(shè)D492值及P/N值以判斷其特異性。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖形分析

用Excel 2003統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)，計(jì)算誤差并制圖。

2　結(jié)果與分析

2.1腰果蛋白抗原最佳工作濃度的選擇

抗原（腰果蛋白）的濃度和抗體（腰果蛋白致敏的小鼠血清、酶標(biāo)二抗）的稀釋度棋盤式組合采用間接ELISA法檢測(cè)結(jié)果，如表1所示。

由表1可知，以不同濃度腰果蛋白液為抗原，不同稀釋度的抗體（小鼠血清、酶標(biāo)二抗）的ELISA法實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)得到的OD492值及陰性對(duì)照組的OD492值，其中P/N均大于2.1，均顯陽(yáng)性［5］。抗原的濃度與稀釋度的關(guān)系，隨著蛋白液的濃度降低吸光度值減小。一抗（小鼠陽(yáng)性血清）的稀釋度越高其吸光度越高。酶標(biāo)二抗的稀釋度升高其吸光度降低。當(dāng)包被腰果蛋白濃度為15.92 μg/mL，包被一抗（小鼠血清）稀釋度為1∶400，酶標(biāo)二抗的稀釋度為1∶1000時(shí)OD492值為0.292，且此時(shí)的P/N值為4.29為最高，所以此雙抗體間接法包被抗原最佳濃度為15.92 μg/mL，最佳一抗稀釋度為1∶400，最佳酶標(biāo)二抗的稀釋度為1∶1000。

2.2蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒分析方法配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白后測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線如圖1所示。

表1　棋盤式組合雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)堅(jiān)果過敏結(jié)果分析Table 1　The analysis of the Cashew nuts allergen with checker-board combination double sandwich ELISA

由圖1可知，蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y= 1.4053x-0.1777，R2=0.9931，方程呈線性相關(guān)。

圖1　蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curves of BCA

2.3腰果過敏蛋白抗原佳工作濃度的選擇

抗原的使用濃度過高，既不經(jīng)濟(jì)，又可使本底增高；使用濃度過低，則酶標(biāo)板上有大量位點(diǎn)未吸附抗原，增加了非特異性反應(yīng)，又影響檢測(cè)的靈敏性。所以必須對(duì)抗原的使用濃度予以選擇。

如圖2所示，在不同稀釋度的酶標(biāo)二抗下隨著抗原的濃度降低吸光度值減小。在ELISA中，用抗原吸附在固相載體選擇濃度時(shí)如濃度太高，則低效價(jià)抗體測(cè)不出來(lái)，或抗原過量形成多層抗原吸附，故在操作過程中可能脫落從而降低敏感性和可重復(fù)性。而隨著抗原濃度的降低，減少了空間因素對(duì)抗原抗體結(jié)合的影響。所以吸光度隨著抗原濃度減低而減小。

圖2　包被抗原濃度的確定Fig.2　The determination of envelope antigen concentration

2.4腰果蛋白酶標(biāo)二抗最佳工作濃度的選擇

抗體濃度以，抗原濃度多少對(duì)酶標(biāo)二抗進(jìn)行最佳選擇，結(jié)果見圖3。

圖3　酶標(biāo)二抗最佳工作濃度的確定Fig.3　The determination of enzyme mark 2 against the best work concentration

由圖3可知，在正常陽(yáng)性小鼠血清中IgE含量極低，而通過腰果蛋白致敏后IgE含量異常增高，提取此時(shí)的血清作為一抗。當(dāng)進(jìn)行間接ELISA實(shí)驗(yàn)包被抗體時(shí)特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過程中被洗去。當(dāng)血清濃度過高時(shí)與抗原濃度差異過大產(chǎn)生空間位阻。所以，在同一抗原濃度下陽(yáng)性小鼠血清稀釋度越大吸光度越大。最適的工作濃度就是指酶標(biāo)二抗稀釋至這一濃度時(shí)，產(chǎn)生的本底較低，且可獲得最佳靈敏度，達(dá)到最適的測(cè)定條件和測(cè)定費(fèi)用的節(jié)省。當(dāng)酶標(biāo)二抗稀釋度過高時(shí)，固相載體上為達(dá)到飽和狀態(tài)。所以，隨著酶標(biāo)二抗的稀釋度增大吸光度減小。

2.5腰果過敏蛋白靈敏度的測(cè)定

通過建立的雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)靈敏度，如表2所示。

表2　間接ELISA法靈敏度檢測(cè)Table 2　The detection sensitivity of double sandwich ELISA

表3　腰果蛋白致敏小鼠血清特異性檢測(cè)Table 3　The specificity detectionof cashew protein sensitization in mice serum

從表2可以看出，由于酶標(biāo)記抗體是酶分子與抗體分子的結(jié)合物，它可以催化底物分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生放大作用，正因?yàn)榇朔N放大作用而使本法具有很高的敏感性。在不同抗原濃度下建立間接ELISA法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以蛋白的最高稀釋度作為該雙抗體夾心ELISA的檢測(cè)靈敏度。當(dāng)腰果蛋白稀釋為原蛋白液濃度的8倍時(shí)，P/N為2.45，顯陽(yáng)性。但當(dāng)腰果蛋白稀釋為原蛋白液濃度的16倍時(shí)，P/N為1.89，顯陰性。所以本實(shí)驗(yàn)建立的間接ELISA法檢測(cè)最低腰果蛋白濃度為1.99 μg/mL。

2.6腰果過敏蛋白特異性的測(cè)定

對(duì)提取的六種堅(jiān)果（腰果、核桃、榛子、開心果、板栗、杏仁）的蛋白液為抗原，進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，測(cè)出OD492值。

如表3所示，開心果蛋白、杏仁蛋白、核桃蛋白、板栗蛋白、榛子蛋白的P/N值均小于2.1，即均為陰性。表明間接ELISA法對(duì)腰果過敏具有一定的特異性。

3　結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)以陽(yáng)性小鼠血清為一抗，羊抗鼠IgE-HRP為二抗，優(yōu)化間接ELISA法，顯示出了良好的特異性，可用于食品中腰果過敏原的檢測(cè)。以腰果蛋白液作為抗原，找出的較佳檢測(cè)腰果蛋白過敏的抗原、抗體濃度，磷酸鹽緩沖液（PBS）包被酶標(biāo)板，在4℃包被過夜。血清稀釋度為1∶400，牛血清白蛋白（BSA）封閉2 h，包被腰果蛋白濃度15.92 μg/mL，酶標(biāo)二抗的稀釋度為1∶1000，此檢測(cè)方法靈敏度較高，最低檢出限為1.99 μg/mL，該方法對(duì)腰果過敏蛋白具有一定特異性。

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The specific detection research of nuts allergen with indirect-competitive ELISA

FAN Jian-tao1，ZHANG Ai-lin1，2，*，YAO Yao1，ZHANG Yu-xin1，MIAO Ying1，2
（1.Tianjin Agricultural University College of Food Science and Biotechnology，Tianjin 300384，China；2.Tianjin Engineering and Technology Center of Agricultural Products Processing，Tianjin 300384，China）

The methods of the indirect competitive ELISA for determining allergen in nuts were developed by using the self-prepared positive mice serum as a resistance in Cashew protein sensitization.The immunoglubing IgE-HRP for 2 resistance was adopted.Cashew protein was identified through checkerboard microlilution method，the optimal solution was 15.92 μg/mL，the equal dilution multiples of mice IgE and antibody-HRP were 400 and 1000，cashew protein concentration was 1.99 μg/mL.Using the method of cashew nuts and walnuts，hazelnuts，pistachios，chestnut，almond nuts，six test cross reaction in nuts analysis had not been found.The method for rapid detection to allergen about nuts was established firstly by using and sensitivity and reliability，accurately specificity.

nuts；allergens；ELISA；checker board microdilution methods

TS201.1

A

1002-0306（2015）24-0064-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.24.004

2014－04－02

范建濤（1992-），男，大學(xué)本科，研究方向：食品質(zhì)量與安全，E-mail：630101458@qq.com。

張愛琳（1977-），女，博士，研究方向：食品安全與檢測(cè)，E-mail：anlinye_zth@163.com。

中國(guó)博士后基金面上項(xiàng)目（2013M541181）；2014年大學(xué)生國(guó)家創(chuàng)新項(xiàng)目（201410061071）；天津農(nóng)學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目。