萬(wàn)光升　劉麗麗　鄧志紅　許建華　李敬瑜　彭維真　李　萍　方　萍　梁　芳　張曉曉　孫　玨△

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，上海200062；2.廣西壯族自治區(qū)桂林市中醫(yī)醫(yī)院，廣西桂林541002）

·研究報(bào)告·

健脾解毒方對(duì)多藥耐藥人結(jié)腸癌裸鼠異位移植瘤多藥耐藥相關(guān)基因蛋白mdr1及P-gp的影響*

萬(wàn)光升1劉麗麗1鄧志紅2許建華1李敬瑜1彭維真1李萍1方萍1梁芳1張曉曉1孫玨1△

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，上海200062；2.廣西壯族自治區(qū)桂林市中醫(yī)醫(yī)院，廣西桂林541002）

目的觀察健脾解毒方對(duì)裸鼠皮下移植瘤mdr1基因及P-gp的影響。方法采用HCT8/V細(xì)胞制作裸鼠皮下移植瘤，隨機(jī)分為4組，生理鹽水組（空白組）、長(zhǎng)春新堿組（化療組）、健脾解毒方組（中藥組）、長(zhǎng)春新堿聯(lián)合健脾解毒方組（聯(lián)合組），觀察各組多藥耐藥相關(guān)基因蛋白的影響。結(jié)果健脾解毒方聯(lián)合化療組mdr1基因表達(dá)水平顯著低于空白組，P-gp表達(dá)量下降。結(jié)論中藥復(fù)方健脾解毒方能在一定程度上可聯(lián)合化療逆轉(zhuǎn)多藥耐藥，與化療藥具有協(xié)同作用。

大腸癌多藥耐藥裸鼠健脾解毒方

大腸癌是臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤，目前上海大腸癌發(fā)病率逐年升高，死亡率居高不下。盡管外科治療是目前最根本的治療方法，但相當(dāng)一部分病患無(wú)法手術(shù)。對(duì)于手術(shù)切除者，姑息治療是其中的治療方法之一。術(shù)后絕大多數(shù)患者需要進(jìn)行術(shù)后輔助化療，而不能切除者，姑息化療甚為重要。目前大腸癌的西藥逆轉(zhuǎn)劑有三苯氧胺［1］、自噬對(duì)苯丙素苷［2］、環(huán)孢霉素［3］等對(duì)大腸癌耐藥細(xì)胞有一定的逆轉(zhuǎn)作用，但均限于實(shí)驗(yàn)階段。中醫(yī)藥在逆轉(zhuǎn)大腸癌耐藥方面具有廣泛的前途，目前報(bào)道的有中藥制劑有片仔癀［4］、姜黃素［5］、粉防己堿［6］等，但大部分均為中藥單體的研究，復(fù)方研究較少。本課題組成員前期研究健脾解毒方［7］體外可有效減低耐藥腫瘤細(xì)胞內(nèi)Akt磷酸化，從而抑制PI3K/Akt信號(hào)通路活性，MDR1表達(dá)下降，從而增加長(zhǎng)春新堿對(duì)大腸癌細(xì)胞的敏感性。課題組成員許建華博士［8］通過(guò)藥物灌胃健脾解毒方干預(yù)，結(jié)果表明G1期細(xì)胞明顯增加，S期細(xì)胞減少，細(xì)胞凋亡率明顯增加，其作用可能與誘導(dǎo)細(xì)晌凋亡有關(guān)。在前期研究［9］的基礎(chǔ)上，筆者發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方可明顯抑制裸鼠異位移植瘤的生長(zhǎng)，且中藥復(fù)方可聯(lián)合長(zhǎng)春新堿抑制腫瘤生長(zhǎng)，減少腫瘤細(xì)胞的異形性，并出現(xiàn)部分細(xì)胞核固縮，且在一定程度上誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。但其具體作用機(jī)制尚未明確，故本課題組成員繼續(xù)從多藥耐藥方面研究其具體作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物與細(xì)胞SPF級(jí)BALB/c裸小鼠，平均每只體質(zhì)量（20±5）g左右，雌雄各半，購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［許可證號(hào)為scxk（滬）：2012-0016］。人大腸癌多藥耐藥細(xì)胞株HCT-8/VCR，購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，檢測(cè)該細(xì)胞的多重耐藥性，并對(duì)至少3種不同的化療藥物產(chǎn)生耐藥性。

1.2試劑與儀器細(xì)胞培養(yǎng)液、血清、胰蛋白酶等試劑購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱為英國(guó)RS Biotech公司生產(chǎn)。中藥復(fù)方健脾解毒方，組成為：生黃芪、生白術(shù)、黨參、豬苓、八月札、薏苡仁、野葡萄藤、紅藤，含生藥濃度為1.46 g/mL，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院監(jiān)制。人大腸癌多藥耐藥細(xì)胞株HCT-8/VCR所需的培養(yǎng)液為RPMI-1640培養(yǎng)液（含有青霉素100 U/mL、鏈霉素鏈霉素100 μg/mL、長(zhǎng)春新堿濃度為2 μg/mL、10%胎牛血清的），生長(zhǎng)環(huán)境為5%CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)。

1.3分組與造模1）動(dòng)物模型的建立。選擇生長(zhǎng)良好、旺盛、無(wú)局部腫瘤壞死的裸鼠，脫頸椎處死，局部皮膚消毒，通常先用1%碘伏消毒，再用75%酒精消毒，小心仔細(xì)用眼科剪局部剪開(kāi)包繞皮膚的腫瘤，沿移植瘤包膜小心剝離皮下腫瘤組織，將剝離的移植瘤塊于無(wú)菌條件下，0.9%氯化鈉注射液沖洗凈表面的血污，去除壞死組織和纖維組織，通常組織類(lèi)似魚(yú)肉樣。用眼科剪剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，在超凈臺(tái)用20 G套管針接種于裸小鼠背部右側(cè)近前肢皮下，共接種40只裸鼠。3周后裸鼠多藥耐藥裸鼠異位移植瘤生長(zhǎng)良好，模型建立成功。2）實(shí)驗(yàn)分組。選擇瘤體直徑0.5 cm左右、腫瘤生長(zhǎng)良好、無(wú)自發(fā)性出血，無(wú)壞死、瘤周無(wú)感染病灶的荷瘤裸鼠共32只，作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，造模成功率為80%，并隨機(jī)分組。共分為4組，空白組為生理鹽水組，化療組為長(zhǎng)春新堿組，中藥組為健脾解毒方組，聯(lián)合組為健脾解毒方聯(lián)合長(zhǎng)春新堿組。3）細(xì)胞培養(yǎng)。HCT8/VCR細(xì)胞生長(zhǎng)在上述濃度的培養(yǎng)液中，穩(wěn)定傳代。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，常規(guī)胰蛋白酶消化制備單細(xì)胞懸液。用生理鹽水重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL。4）細(xì)胞的接種。接種方法參考《細(xì)胞培養(yǎng)》［10］，將上述懸浮的細(xì)胞快速接種于4～6周齡BALB/c裸鼠右側(cè)腋下。接種之前常規(guī)酒精消毒，用1 mL微量注射器及23號(hào)針頭吸取人大腸癌耐藥細(xì)胞株HCT8/V單細(xì)胞懸液，確定針頭位于裸鼠右側(cè)近前肢皮下后，注入0.2 mL制備好的單細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)約為2×106個(gè)，共接種6只裸鼠。將接種后的裸鼠繼續(xù)在SPF級(jí)隔離籠內(nèi)生長(zhǎng)，每日可見(jiàn)接種部位裸鼠逐漸長(zhǎng)大，觀察至18 d時(shí)，裸鼠皮下腫瘤生長(zhǎng)至0.8～1.2 cm時(shí)。實(shí)驗(yàn)給藥見(jiàn)表1。

表1　動(dòng)物及給藥情況

1.4觀察指標(biāo)熒光定量PCR法檢測(cè)多藥耐藥基因mdr1，總RNA提取，進(jìn)行鑒定，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，擴(kuò)增定量檢測(cè)上述基因mRNA水平。以GAPDH為內(nèi)參，采用TaKaRa公司SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒，ABI PRISM 7300Real-Time PCR（FQ-PCR）System對(duì)p53、Bax、Bcl-2進(jìn)行擴(kuò)增，定量檢測(cè)上述基因mRNA水平。免疫印跡法檢測(cè)P-gp的水平，組織的蛋白質(zhì)抽提，蛋白質(zhì)定量，SDS-PAGE電泳，制備分離膠（pH8.8），制備積層膠（pH6.8），樣品準(zhǔn)備，加入電泳緩沖液，上樣，電泳，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移，膜的封閉和抗體孵育，去除過(guò)量的溶液，將膜夾在兩塑料薄膜之間，以X光膠片曝光，然后將圖片自動(dòng)掃描，以jpg格式保存于電腦，用ImageJ分析軟件將灰度值具體數(shù)字化。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以（±s）表示，方差齊性檢驗(yàn)后，采用單因素多樣本均數(shù)比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組多藥耐藥基因mdr1的比較見(jiàn)表2，圖1和圖2。熒光定量PCR（FQ-PCR）結(jié)果顯示，與空白組相比，化療組mdr1基因表達(dá)水平顯著上調(diào)，聯(lián)合組mdr1基因表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.05），而中藥組無(wú)明顯差異（P＞0.05），而與化療組相比，中藥組能下調(diào)mdr1基因表達(dá)（P＜0.05），聯(lián)合組下調(diào)mdr1基因表達(dá)（P＜0.01）。

表2　各組治療后mdr1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（）

表2　各組治療后mdr1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（）

與空白組比較，*P＜0.05；與化療組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

分組n mdr1 mR NA（×10-3）空白組8化療組8中藥組8 1.03±0.18 2.13±0.76*1.20±0.21△聯(lián)合組80.59±0.11△△

2.2各組多藥耐藥相關(guān)蛋白P-gp水平的比較見(jiàn)圖3。Western Blot結(jié)果顯示，四處理組對(duì)移植瘤細(xì)胞均有一定的影響，空白組、化療組、中藥組、聯(lián)合組表達(dá)量分別為0.870、1.032、0.622、0.450，相對(duì)于空白組，化療組多藥耐藥相關(guān)蛋白P-gp表達(dá)量略有升高，中藥組P-gp表達(dá)下降，聯(lián)合用藥組P-gp表達(dá)量最低。臨床癥狀、提高生活質(zhì)量、延長(zhǎng)患者生存期的作用，復(fù)方制劑既可治療化療引起的惡心嘔吐，又可以扶正抗癌，通過(guò)增加患者白細(xì)胞、血小板等達(dá)到患者一定程度耐受化療的目的。且本研究從體內(nèi)、體外均充分驗(yàn)證了中藥復(fù)方制劑可逆轉(zhuǎn)大腸癌的耐藥，其部分作用機(jī)制可能與下調(diào)mdr1、降低p-gp的表達(dá)密切相關(guān)。

圖1　給藥后各組mdr1 mRNA相對(duì)表達(dá)

圖2　mdr1及GAPDH擴(kuò)增曲線

由于逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的機(jī)制可能與肺耐藥蛋白、膜運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、蛋白激酶等有關(guān)，故本實(shí)驗(yàn)從膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的P-gp著手研究，探討中藥復(fù)方逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的部分作用機(jī)制。由于中藥復(fù)方的多靶點(diǎn)性，其機(jī)制必然相當(dāng)復(fù)雜，需要后續(xù)課題組成員進(jìn)一步深入研究，明確中藥復(fù)方制劑的作用機(jī)制。故擺在我們當(dāng)前的任務(wù)是，尋找治療中藥復(fù)方逆轉(zhuǎn)耐藥的作用最強(qiáng)靶點(diǎn)，為中醫(yī)藥走向國(guó)際化鋪平道路。

圖3　處理后各組對(duì)HCT8/V裸鼠移植P-gp的表達(dá)圖

3　討論

大腸癌的首選治療方式仍然為手術(shù)切除，但根治性切除的比率較低，術(shù)后轉(zhuǎn)移及局部復(fù)發(fā)比率居高不下，達(dá)70%［11］，目前大腸癌的化療方案有：FOLFIRI、FOLFOX4等，但臨床上有效比率不高。其原因可能與大腸癌的化療不敏感性有直接關(guān)系。而化療的耐藥是擺在臨床醫(yī)師面前的一個(gè)十分棘手的問(wèn)題。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，大腸癌的發(fā)生發(fā)展主要是因?yàn)檎龤獠蛔?，濕毒、邪氣等蘊(yùn)結(jié)于腸道，日久形成腫塊，進(jìn)一步耗傷正氣。而手術(shù)后患者脾氣虧虛愈加明顯，氣損愈加嚴(yán)重，且化療屬于外毒范疇，更能加重脾氣虧虛，癌毒聚集，導(dǎo)致氣滯的發(fā)生?；诖?，本課題從病機(jī)著手，擬健脾益氣解毒法，創(chuàng)制健脾解毒方，方中生黃芪、生白術(shù)、黨參、豬苓為君，扶助正氣，八月札為臣助君行氣，薏苡仁、野葡萄藤、紅藤共為佐使，可化濕解毒，諸藥合用共奏健脾理氣解毒之功，符合臨床病機(jī)。

中藥復(fù)方制劑充分通過(guò)辨證施治，具有改善患者

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Effects of JianPi JieDu Decoction on Multidrug Resistance Associated Gene MDR1 and P-gp in Trans-planted Tumor of Nude Mice

WAN Guangsheng，LIU Lili，DENG Zhihong，et al.
Tumor department of TCM，Putuo Hospital Attached to Shanghai University of Chinese Medicine，Shanghai 200062，China

Objective：To investigate the effects of JianPi JieDu Decoction on transplantated tumor gene MDR1 and P-gp in nude mice.Methods：HCT8/V cells were subcutaneously injected into the flank of nude mice.Then mice were divided into four groups randomly：normal saline group（the control group），vincristine（VCR）group（chemotherapy group），Jianpi Jiedu Decoction group（Chinese medicine group），vincristine combined with Jianpi Jiedu Decoction group（the combined group）.The expressions of multidrug resistance associated proteins and genes in each group were monitored.Results：The expression of MDR1 in vincristine combine with Jianpi Jiedu Decoction group was significant lower than that of the control group.The expression of P-gp was downregulated. Conclusion：Tranditional Chinese Medicine compound（JianPi JieDu Decoction）combined with chemotherepy can reverse the resistanse of multidrug in a certain extent，which has a synergistic effect with chemotherepy.

Colorectal cancer；Multidrug resistance；Chinese compounds JianPi JieDu Decoction

R285.5

A

1004-745X（2015）12-2113-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.12.014

2015-07-20）

上海中醫(yī)藥大學(xué)預(yù)算內(nèi)科研項(xiàng)目（2013JW63）

（電子郵箱：great-sunny@163.com）