王銀娟 顧華 郭美華 涂穎 何黎

·論著·

黃褐斑患者皮損及血液中Toll樣受體2和4的表達

王銀娟 顧華 郭美華 涂穎 何黎

目的 探討Toll樣受體（TLR）2和4與黃褐斑發(fā)病的相關性。方法 黃褐斑患者和健康對照各40例，采集外周血，并收集其中10例黃褐斑及10例健康對照者皮損，用RT-PCR方法檢測血樣及皮損中TLR2和4 mRNA的表達，免疫組化觀察TLR2和4在皮損中的表達及分布，并進行統(tǒng)計分析。結果 黃褐斑皮損中TLR2和TLR4在mRNA水平表達（分別為9.72±2.93，9.52±2.88）明顯高于健康對照（分別為5.10±2.69，4.77±1.90），差異有統(tǒng)計學意義（分別t=3.67、4.36，均P＜0.01）。40例黃褐斑患者及40例健康對照外周血中TLR2和TLR4的表達，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。免疫組化顯示：10例正常皮膚中6例表皮及血管內皮細胞均無TLR2表達，4例表皮基底層有TLR2弱陽性表達，血管內皮細胞未見表達。10例黃褐斑皮損中有3例表皮全層均有TLR2陽性表達，7例基底細胞層及棘層有TLR2陽性表達，真皮淺層血管內皮細胞未見TLR2表達。10例健康對照皮膚表皮及血管內皮細胞均未見TLR4表達。10例黃褐斑皮損基底細胞層均有TLR4強陽性表達，棘層弱陽性表達，其中3例真皮淺層血管內皮細胞可見陽性TLR-4表達。結論 黃褐斑發(fā)病可能與局部皮膚TLR介導的炎癥反應有關。

黃褐斑；Toll樣受體；炎癥

黃褐斑為女性最常見的面部皮膚病之一，嚴重影響容貌，然而病因及發(fā)病機制尚不完全清楚，目前認為與紫外線、化妝品、妊娠、內分泌紊亂、某些慢性疾病、某些藥物、睡眠質量及遺傳等有關。Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）是一種天然免疫的分子家族，不僅在免疫細胞和炎癥細胞表面表達，多種組織細胞，如，角質形成細胞及黑素細胞均有TLR表達。以往研究證實，TLR在多種與炎癥相關的疾病，如，銀屑病、痤瘡、特應性皮炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等的發(fā)病機制中產生作用［1-3］。為了探討TLR介導的免疫反應在黃褐斑發(fā)病中的作用，我們研究TLR2和TLR4在黃褐斑患者及健康人皮損及血液中的表達。

對象與方法

一、對象

2012年1月至2013年6月在昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院皮膚科門診，根據(jù)黃褐斑的診斷標準［4］，收集女性黃褐斑患者皮損10例，均為面頰部長徑約1 cm的楔形皮損；另外收集女性色素痣切除皮損周圍正常皮膚樣本10例，均為女性面頰部長徑約1 cm的楔形皮損。采集黃褐斑患者血樣40例為黃褐斑組，本院體檢中心健康血樣40例為健康對照組，均為女性。采集標本過程中均排除其他系統(tǒng)疾病。黃褐斑組與健康對照組年齡差異無統(tǒng)計學意義。本研究經(jīng)過本院醫(yī)學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

二、主要試劑和儀器

TLR2/TLR4抗體（美國Abnova公司），偶聯(lián)辣根過氧化物酶的二抗及DAB顯色劑（丹麥Dako公司），皮損/全血RNA提取試劑盒（美國Qiagen公司），RevertAidTMFirst Strand cDNA合成試劑盒（加拿大 Fermentas公司），SYBR Green Master（瑞士Roche公司），PCR儀（美國Bio-Rad公司），實時定量PCR儀（美國ABI公司）。

三、方法

1.實時定量PCR：引物由廣州Invitrogen公司合成，序列：TLR2：上游 5′-ATCCTCCAATCAGGCT TCTCT-3′，下游 5′-GGACAGGTCAAGGCTTTTTAC A-3′；TLR4：上游 5′-AGTTGATCTACCAAGCCTTGA GT-3′，下游 5′-GCTGGTTGTCCCAAAATCACTTT-3′；GAPDH：上游 5′-AAAGGGTCATCATCTCTG-3′，下游5′-GCTGTTGTCATACTTCTC-3′。將約 0.1 g 皮膚組織加入Trizol裂解液中，冰浴研磨至無顆粒勻漿液，使用RNA提取試劑盒，通過核酸定量儀檢測RNA濃度。使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis試劑盒合成cDNA第一條鏈，定量PCR檢測。吸取抗凝管中的血液1.5 ml放入去酶離心管，提取總RNA，通過核酸定量儀檢測RNA濃度。用試劑盒合成cDNA第一條鏈，定量PCR檢測。

2.免疫組化：皮損常規(guī)石蠟組織包埋、切片，脫蠟至脫水。3%過氧化氫去離子水消化，枸櫞酸緩沖液抗原修復。正常羊血清封閉，室溫孵育。滴加單克隆TLR2/TLR4抗體孵育，繼以二抗。滴加生物素二抗，DAB顯色。水洗，蘇木素復染，脫水，透明，封片。結果判定：胞膜棕黃色染色判定為陽性。

3.統(tǒng)計學分析：用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件作數(shù)據(jù)處理。各組間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、TLR2和TLR4在皮損中的表達

黃褐斑患者皮損中，TLR2和TLR4在mRNA水平表達（分別為9.72±2.93，9.52±2.88）明顯高于健康對照者（分別為 5.10±2.69，4.77±1.90），差異有統(tǒng)計學意義（t=3.67、4.36，均 P ＜ 0.01），見表 1。免疫組化顯示，10例健康皮膚中6例表皮及血管內皮細胞均無TLR2表達（圖1），有4例表皮少量基底層細胞胞膜TLR2弱陽性表達，血管內皮細胞未見表達（圖2）10例黃褐斑皮損中有3例表皮全層均有TLR2陽性表達（圖3），7例僅基底細胞層及棘層胞膜有TLR2陽性表達，真皮淺層血管內皮細胞未見TLR2表達（圖4）。10例健康皮膚表皮及血管內皮細胞均未見TLR4表達；10例黃褐斑皮損基底層細胞胞膜均有TLR4強陽性表達，棘層弱陽性表達（圖5），其中3例真皮淺層血管內皮細胞可見陽性TLR-4表達（圖6）。

二、TLR2和TLR4在血液中的表達

黃褐斑組與健康對照組比較，TLR2和TLR4表達差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表1。

討 論

近年來，TLR在皮膚病中的研究成為熱點，其受微生物和細胞因子的調節(jié)，主要通過識別病原微生物表面的病原體及配體，介導炎癥反應，釋放大量炎癥因子［5-6］。其中TLR2和TLR4是一種具有廣譜識別能力的“模式”識別受體，主要識別革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的標記蛋白，在防御表皮微生物的免疫反應中起到重要作用［7］。TLR2主要見于單核細胞、樹突細胞和中性粒細胞，TLR4主要見于巨噬細胞、內皮細胞、樹突細胞和中性粒細胞。

關于黃褐斑的發(fā)病機制，以往研究主要集中在表皮層黑素細胞的數(shù)量、活力，以及黑素顆粒的分布上，內在因素及外界因素對黑素細胞的刺激最終導致黑素細胞數(shù)量不變而黑素合成能力增加，包括局部微生態(tài)環(huán)境失衡，尤其是褐色素、枯黃色素的微球的顯著增加［8］，以及黑素細胞受到腫瘤壞死因子α、內皮素、白三烯等炎癥介質刺激后，可改變黑素細胞及一些免疫細胞的活性使黑素合成增加［9-11］研究 表 明 ， 黑素 細 胞 中 TLR1、2、3、4、6、7、9 在

圖1 健康皮膚表皮及血管內皮細胞均無表達（DAB染色×200）

圖2 健康皮膚表皮少量基底層細胞胞膜有少量棕色染色，TLR2弱

圖3 黃褐斑皮損表皮全層細胞胞膜均有棕色染色，TLR2陽性表達（DAB染色×200）

圖4 黃褐斑皮損僅基底細胞層及棘層細胞胞膜有棕色染色，TLR2陽性表達，真皮淺層血管內皮細胞未見表達（DAB染色×200）

圖5 黃褐斑皮損基底層細胞胞膜均有TLR4棕色染色，強陽性表達，棘層細胞胞膜淡棕色染色，弱陽性表達（DAB染色×200）

圖6 黃褐斑皮損基底層細胞胞膜及真皮淺層血管內皮細胞可見棕色染色，TLR-4呈陽性表達表達（DAB染色×100）

表1 黃褐斑組與健康對照組皮損和血TLR2、4的檢測結果

陽性表達，血管內皮細胞未見表達（DAB染色×200）mRNA水平上的表達，蛋白水平上證明TLR2、4、7和9的表達［12］。因此，我們推測，黃褐斑的炎癥反應可能與TLR介導的免疫反應相關。

國外學者對健康人皮膚TLRl～5的分布情況進行了研究，發(fā)現(xiàn)健康人表皮表達TLRl、TLR2、TLR5，而TLR3和TLR4幾乎檢測不到，本實驗發(fā)現(xiàn)健康人皮膚TLR2弱表達而無TLR4表達與國外研究結果類似［13］，而TLR2和TLR4在黃褐斑皮損中表達陽性，黃褐斑患者的黑素細胞中TLR2和TLR4的表達相對健康人有所上調，提示黃褐斑的形成可能與TLR介導的相關信號傳導產生炎癥因子，增加黑素的合成有關。研究結果顯示，紫外線誘導的內皮細胞因子1，前列腺素及干細胞因子1分泌增多可使黑素細胞中黑素小體合成增多并促使其自角質形成細胞轉運［14-15］。提示，紫外線誘導的炎癥反應在色素形成過程中發(fā)揮重要作用。另外，在一些炎癥疾病中，腫瘤壞死因子α、γ干擾素等炎癥因子也可上調Toll樣受體的表達［16］，提示黃褐斑皮損中TLR2和TLR4表達增加也可能與紫外線照射等刺激產生的炎癥因子升高有關。我們的結果還顯示，黃褐斑患者及健康人群血液TLR2和TLR4的mRNA表達比較，差異無統(tǒng)計學意義，提示免疫反應在黃褐斑的發(fā)病機制中無影響。

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Expressions of Toll-like receptors 2 and 4 in skin lesions and peripheral blood from patients with chloasma

Wang Yinjuan*,Gu Hua,Guo Meihua,Tu Ying,He Li.*Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650032,China.

ObjectiveTo investigate the relationship of Toll-like receptors （TLRs）2 and 4 with the occurrence of chloasma.MethodsPeripheral blood samples were collected from 40 patients with chloasma and 40 healthy human controls,and skin samples were also collected from the lesions of 10 of the patients and normal skin of 10 of the healthy controls.Real time （RT）-PCR was performed to measure the mRNA expressions of TLR2 and TLR4 in skin lesions and blood samples.An immunohistochemical test was conducted to observe the expressions of TLR2 and TLR4 in skin lesions.Statistical analysis was carried out byttest.ResultsThe expressions of TLR2 and TLR4 mRNAs were both significantly higher in skin lesions of the patients than in normal skin of the controls（9.72±2.93 vs.5.10±2.69,t=3.67,P＜0.01;9.52±2.88 vs.4.77±1.90,t=4.36,P＜0.01）,while no significant difference was found in the mRNA expressions of TLR2 or TLR4 in peripheral blood between the patients and controls（bothP＞0.05）.As the immunohistochemical test revealed,TLR2 was absent in both the epidermis and vascular endothelial cells in 6 normal control skin samples,weakly expressed in the basal layer of the epidermis but absent in vascular endothelial cells in 4 normal skin samples,and no TLR4 expression was observed in either the epidermis or vascular endothelial cells in these control skin samples.Among the 10 skin samples from chloasma lesions,3 showed TLR2 expression in the whole epidermis,7 in both basal cell layer and prickle cell layer but not in vascular endothelial cells in the superficial dermal layer,all showed strong TLR4 expression in the basal cell layer and weak TLR4 expression in the prickle cell layer,and 3 exhibited TLR4 expression in vascular endothelial cells in the superficial dermal layer.ConclusionTLR-mediated immune responses in local skin might be related to the occurrence of chloasma.

Chloasma;Toll-like receptors;Inflammation

He Li,Email:helikm2662@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.02.010

教育部2013年度創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃（IRT13067）；云南省衛(wèi)生高層次人才培養(yǎng)計劃（L-201211）；2012年中華醫(yī)學會薇姿研究項目（V2012080514）

650032昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院皮膚科（王銀娟、顧華、涂穎、何黎）；昆明醫(yī)科大學科技處（郭美華）

何黎，Email：helikm2662@126.com

2014-05-23）

（本文編輯：吳曉初）