黃曉鳳 劉海洋 郭美華 龐勤 鄒菥 楊小燕 楊成 馬驍 何黎

滇山茶、銀線草、車桑子、重樓對黑素細胞株增殖活性和酪氨酸酶影響的研究

黃曉鳳 劉海洋 郭美華 龐勤 鄒菥 楊小燕 楊成 馬驍 何黎

目的 探討滇山茶、銀線草、車桑子、重樓提取物的美白作用。方法 7種植物提取物（滇山茶枝葉提取物、滇山茶枝葉提取物70%乙醇洗脫物、滇山茶花蕾提取物、滇山茶花蕾提取物70%乙醇洗脫物、銀線草提取物、車桑子提取物、重樓提取物）分別設立10、25、50、100、200、400、800 mg/L 7個濃度作用于體外培養(yǎng)人表皮黑素細胞株，同時設立陰性對照組、空白對照組和100 μg/ml熊果苷陽性對照組。采用噻唑藍比色法測定植物提取物對黑素細胞增殖影響，體外氧化多巴反應法測定提取物對酪氨酸酶活性的影響。結果 對黑素細胞增殖活性的影響：400 mg/L滇山茶枝葉提取物，10～100 mg/L滇山茶枝葉提取物70%乙醇洗脫物，10～25 mg/L滇山茶花蕾提取物，10 mg/L滇山茶花蕾提取物70%乙醇洗脫物和10～25 mg/L車桑子提取物對黑素細胞增殖活性的抑制作用與100 mg/L熊果苷相當（P＞0.05）。800 mg/L滇山茶枝葉提取物對HEM-m細胞增殖活性的抑制作用低于熊果苷（P＜0.05）。余不同濃度提取物對HEM-m細胞增殖的抑制作用均強于熊果苷（P＜0.05或P＜0.01）。對黑素細胞酪氨酸酶活性的影響：10 mg/L滇山茶枝葉提取物，10～400 mg/L滇山茶枝葉提取物70%乙醇洗脫物，10～25 mg/L滇山茶花蕾提取物，50～100 mg/L滇山茶花蕾提取物70%乙醇洗脫物，10～50和400 mg/L銀線草提取物，10～800mg/L車桑子提取物，10和100～200mg/L重樓提取物對酪氨酸酶活性的抑制作用與100 mg/L熊果苷相當（P＞0.05）。10～25 μg/ml滇山茶花蕾提取物70%乙醇洗脫物對酪氨酸酶的抑制作用明顯低于熊果苷（P＜0.05）。其余不同濃度的提取物對酪氨酸酶的抑制活性均優(yōu)于熊果苷組（P＜0.05或P＜0.01）。結論 滇山茶、車桑子提取物于特定濃度時，能抑制酪氨酸酶活性。

植物提取物；黑素細胞；細胞增殖；酪氨酸酶

研究表明，天然植物有效成分除具有美白作用外，還具有安全、低毒等特性，已有學者對多種植物提取物進行研究證實有抑制酪氨酸酶作用［1］。云南山茶花也叫滇山茶，屬于山茶科山茶屬植物，原產(chǎn)云南省。銀線草為金粟蘭科植物，民間雖已有廣泛應用，但對銀線草的藥理學研究鮮見報道。車桑子，屬于無患子科車桑子屬，云南省紅河州、元謀等干熱河谷地區(qū)種植較多。重樓，為延齡草科重樓屬植物，云南是我國重樓最主要的產(chǎn)地之一。我們利用云南省植物資源優(yōu)勢，與中國科學院昆明植物所聯(lián)合，著眼從滇山茶的花、枝、葉，銀線草、車桑子、重樓中提取有效成分，通過作用于體外培養(yǎng)的人表皮黑素細胞株（HEM-m），與熊果苷作對比，觀察不同濃度梯度的植物提取物對細胞增殖活性、酪氨酸酶活性影響，以篩選出具有美白作用的植物提取物。

一、資料

1.細胞來源：人黑素細胞-中色（HEM-m）購于美國Sciencell公司。

2.藥品和試劑：滇山茶提取物、銀線草提取物、車桑子提取物、重樓提取物由中國科學院昆明植物所提供。熊果苷、左旋多巴購于北京壇墨質檢公司，MelM基礎培養(yǎng)基及補充物、胰蛋白酶/EDTA溶液、胰蛋白酶中和溶液購于美國Sciencell公司，噻唑藍購于美國Biosharp公司，TritonX-100購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

3.實驗儀器：倒置顯微鏡購于德國Carl Zeiss公司，全自動酶標儀購于美國Biotek公司，低速自動平衡離心機購于長沙英泰公司，CO2孵箱、超凈工作臺購于美國Thermo公司。

二、方法

1.植物提取物的制備：滇山茶（Camellia reticulata Lindl）枝葉提取物：干燥滇山茶枝葉和花蕾分別粉碎，75%乙醇回流提取3次（每次2小時），回收溶劑，得到枝葉提取物。取部分該提取物溶于水，經(jīng)過D101大孔樹脂柱，水洗脫，除去糖類等物質，70%乙醇洗脫，回收溶劑，得到滇山茶枝葉和花蕾70%乙醇洗脫物。銀線草（Chloranthus japonicas Sieb）提取物：干燥銀線草全草粉碎，95%乙醇回流提取3次（每次2小時），回收溶劑。車桑子［Dodonaea viscosa（Linn.）Jacq.Enum］提取物及滇重樓 ［Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis（Fr.）Hand.-Mazz］提取物：干燥車桑子枝葉及滇重樓根莖粉碎，75%乙醇回流提取3次（每次2小時），回收溶劑。

2.HEM-m的培養(yǎng)：細胞凍存管放入37℃水槽復蘇，將管內(nèi)細胞重新懸浮。按5 000個細胞/cm2分配至多聚左旋賴氨酸包被T75培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱。第2天更換培養(yǎng)基以清除殘留的二甲基亞砜（DMSO）和未附壁的細胞，細胞接近50%融合前，每隔1天更換1次培養(yǎng)基，細胞接近50%融合后每天更換，融合接近80%時傳代培養(yǎng)。健康的細胞呈現(xiàn)樹枝狀形態(tài)，2～3 d細胞翻倍。

3.不同植物提取物對細胞增殖的影響：用噻唑藍進行測定。用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）溶液消化處于對數(shù)生長期的細胞，胰蛋白酶中和液對其進行終止，離心后用MelM培養(yǎng)基將黑素細胞稀釋成1×105個/ml，取稀釋后液體接種于96孔板100 μl/孔，接種密度為104個/孔。過夜待細胞貼壁，吸去培養(yǎng)液，分別加入含藥培養(yǎng)液（7種不同植物提取物的培養(yǎng)液終濃度分別為 10、25、50、100、200、400、800 mg/L，熊果苷100 mg/L）100 μl/孔，每個濃度均設立3個復孔。并設立陰性對照組（黑素細胞+黑素細胞培養(yǎng)基）和空白對照組（單純黑素細胞培養(yǎng)基）。培養(yǎng)72 h，棄上清，PBS液沖洗細胞2遍，每孔加入5 mg/ml的MTT液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄上清，每孔加入DMSO 100 μl，置于振蕩器上低速振蕩10 min，用酶標儀測定標本吸光度（A）值，測定波長為490 nm。細胞增殖率=［（藥物組平均吸光值-空白組平均吸光值）/（陰性對照組平均吸光值-空白組平均吸光值）］×100%

4.黑素細胞酪氨酸酶活性的測定：按上述方法接種黑素細胞于96孔培養(yǎng)板并加入含藥培養(yǎng)基作用72 h，棄上清PBS液沖洗細胞2次，分別于每孔中加入100 μl含1%TritonX-100（PBS液配置）溶液，振蕩器上低速振蕩30 min，放置于-20℃冰箱中1 h，室溫下融化，使黑素細胞完全裂解。每孔加入100 μl濃度為0.1%L多巴溶液，繼續(xù)置于37℃孵箱2 h，酶標儀測定標本吸光度（A）值，測定波長為490 nm。酪氨酸酶相對活性=［（藥物組平均吸光值-空白組平均吸光值）/（陰性對照組平均吸光值-空白組平均吸光值）］×100%。

5.統(tǒng)計學分析：采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件建立數(shù)據(jù)庫，進行整理，計算均值，兩組間計量資料采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

三、結果

1.不同植物提取物對黑素細胞增殖活性的影響：與陰性對照組比較，除10 mg/L滇山茶枝葉提取物70%乙醇洗脫物和10 mg/L車桑子提取物對HEM-m細胞無明顯影響外（P＞0.05），其余不同濃度植物提取物均顯示對細胞增殖活性有一定的抑制作用（P＜0.05或P＜0.01）。與陽性對照組熊果苷比較，400 mg/L滇山茶枝葉提取物，10～100 mg/L滇山茶枝葉提取物70%乙醇洗脫物，10～25 mg/L滇山茶花蕾提取物10 mg/L滇山茶花蕾提取物70%乙醇洗脫物，10～25 mg/L車桑子提取物對HEM-m細胞增殖活性的抑制作用與100 mg/L熊果苷相當（P＞0.05）。800 mg/L滇山茶枝葉提取物對HEM-m細胞增殖活性的抑制作用低于熊果苷（P＜0.05）。余不同濃度提取物對HEM-m細胞增殖的抑制作用均強于熊果苷（P＜0.05）。見表 1。

2.不同植物提取物對黑素細胞酪氨酸酶活性的影響：與陰性對照組比較，100 mg/L熊果苷和各濃度的植物提取物對HEM-m細胞酪氨酸酶活性均具有顯著的抑制作用（P＜0.05）。與陽性對照組熊果苷比較，10 mg/L滇山茶枝葉提取物，10～400 mg/L滇山茶枝葉提取物70%乙醇洗脫物，10～25 mg/L滇山茶花蕾提取物，50～100 mg/L滇山茶花蕾提取物70%乙醇洗脫物，10～50和400 mg/L銀線草提取物，10～800 mg/L車桑子提取物，10和100～200 mg/L重樓提取物對酪氨酸酶活性的抑制作用與100 mg/L熊果苷相當（P＞0.05）。10～25 mg/L滇山茶花蕾提取物70%乙醇洗脫物對酪氨酸酶的抑制作用明顯低于熊果苷（P＜0.05）。其余不同濃度的提取物對酪氨酸酶的抑制活性均優(yōu)于熊果苷組。見表2。

表1 不同植物提取物對黑素細胞增殖活性的影響（%，±s）

表1 不同植物提取物對黑素細胞增殖活性的影響（%，±s）

注：n=3。a：與陰性對照組比較，P ＜ 0.05；b：與陽性對照組比較，P ＜ 0.05

組別樣品（mg/L）800 400 200 100 50 25 10熊果苷滇山茶枝葉提取物 74.82±7.60ab47.88±2.01a 7.07±4.83ab 1.67±0.57ab 6.09±0.65ab 9.11±7.65ab 12.59±7.72ab57.32±4.72a滇山茶枝葉提取物70%乙醇洗脫物10.07±1.85ab28.89±1.57ab24.34±5.39ab51.68±12.88a66.37±4.00a 66.42±14.00a 71.82±14.14 57.32±4.72a滇山茶花蕾提取物 44.25±1.36ab22.54±0.75ab 9.8±2.0ab 3.72±2.25ab18.59±9.86ab55.16±9.04a 55.64±1.84a 57.32±4.72a滇山茶花蕾提取物70%乙醇洗脫物9.59±1.85ab 0.67±0.50ab 0.07±0.03ab 2.44±1.70ab19.54±3.19ab36.81±8.41ab 34.41±10.88a57.32±4.72a銀線草提取物 7.35±4.86ab 6.60±5.87ab 1.22±0.91ab11.46±2.42ab28.34±3.63ab26.87±7.47ab 31.33±7.90ab76.79±8.01a車桑子提取物 48.43±0.51ab26.69±1.62ab28.19±4.93ab44.68±2.95ab58.32±2.56ab60.87±5.85a 76.61±15.67 76.79±8.01a重樓提取物 0.063±0.049ab0.48±0.49ab 2.84±0.62ab 4.42±0.95ab 5.23±1.21ab 2.19±1.15ab 23.91±0.72ab76.79±8.01a

表2 不同植物提取物對黑素細胞酪氨酸酶活性的影響（%，±s）

表2 不同植物提取物對黑素細胞酪氨酸酶活性的影響（%，±s）

注：n=3。a：與陰性對照組比較，P ＜ 0.05；b：與陽性對照組比較，P ＜ 0.05

組別樣品（mg/L）800 400 200 100 50 25 10熊果苷滇山茶枝葉提取物 4.58±0.25ab 3.73±0.96ab 0.08±0.05ab 0.18±0.04ab 1.1±0.86ab 1.1±1.25ab 12.04±2.31a 30.11±11.65a滇山茶枝葉提取物70%乙醇洗脫物2.39±1.14ab14.34±2.72a 27.40±1.49a 36.89±8.47a 44.36±6.44a 46.48±22.96a 44.36±19.82a30.11±11.65a滇山茶花蕾提取物 8.91±4.46ab 2.88±0.53ab10.00±1.4ab 7.38±4.85ab 2.59±2.61ab33.08±7.25a 45.21±3.22a 30.11±11.65a滇山茶花蕾提取物70%乙醇洗脫物5.17±1.18ab 4.16±1.62ab 2.98±1.07ab22.08±25.07a34.18±5.61a 74.13±13.12ab74.81±5.51ab30.11±11.65a銀線草提取物 5.92±0.41ab 6.90±2.55a 2.47±1.26ab 4.95±3.38ab17.68±8.80a 25.29±7.09a 29.97±13.15a41.11±21.63a車桑子提取物 22.28±1.60a 25.02±1.26a 6.90±3.53a 22.01±1.86a 29.09±4.14a 42.44±7.03a 31.83±5.18a 41.11±21.63a重樓提取物 1.41±2.14ab 5.66±1.33ab 6.54±1.06a 7.34±2.11a 5.92±1.36ab 4.07±1.53ab 6.98±2.22a 41.11±21.63a

四、討論

山茶屬（CamelliaLinn）植物屬于山茶科（Theaceae），全世界約有280余種，主要分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)，我國有250種以上，主要產(chǎn)于西南部和東南部地區(qū)。目前韓國、日本對山茶花的花、枝、葉、果實提取物的藥理學研究較多。Nakamura等［2］研究發(fā)現(xiàn)，山茶花花蕾提取物可抑制黑素生成、促進成纖維細胞分化。山茶花提取物可通過清除人類HaCaT細胞內(nèi)活性氧ROS和增強抗氧化酶活性達到抗氧化作用［3］，山茶花油具有抗炎活性［4］，山茶花籽油提取物通過外用可以抑制基質金屬蛋白酶（MMP-1）活性、誘導一型膠原蛋白合成此外［5］，山茶花籽油還可以減少經(jīng)皮水分流失，恢復皮膚屏障［6］。國外研究大多集中在抗真菌［7］、抗炎活性［8］、抗氧化和自由基清除活性［9］等作用中。Yan 等［10］從車桑子地上部分提取出Dodoviscin A作用于B16-F10黑素瘤細胞，發(fā)現(xiàn)該單體提取物顯著抑制黑素瘤細胞黑素合成的同時對細胞活性無影響。

本研究表明，滇山茶枝葉提取物于800 mg/L對細胞增殖影響與抑制酪氨酸酶活性作用均優(yōu)于100 mg/L熊果苷，于400 mg/L時對細胞增殖影響與熊果苷相當，但其抑制酪氨酸酶活性作用優(yōu)于熊果苷；10～100mg/L滇山茶枝葉提取物70%乙醇洗脫物、10～25mg/L滇山茶花蕾提取物及10～25mg/L車桑子提取物對細胞增殖和酪氨酸酶活性的抑制作用均與熊果苷的作用相當。可見上述植物提取物具有植物美白劑的應用前景。盡管銀線草、重樓提取物抑制酪氨酸酶活性的作用顯著，但其對細胞增殖率影響過大，能否作為美白劑開發(fā)，尚待研究。

將篩選出來的滇山茶枝葉提取物、滇山茶枝葉提取物70%乙醇洗脫物、滇山茶花蕾提取物、車桑子提取物這幾個提取物間進行組間方差分析表明：從滇山茶不同提取工藝和方法來看，滇山茶枝葉提取物美白活性優(yōu)于枝葉提取物70%乙醇洗脫物（P＜0.05）；從滇山茶不同的提取部位來看，滇山茶枝葉提取物美白活性優(yōu)于花蕾提取物（P＜0.05）。滇山茶枝葉提取物具有最強的美白作用，各濃度滇山茶枝葉提取物70%乙醇洗脫物、滇山茶花蕾提取物及車桑子提取物之間美白作用差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。國外學者雖已提取出一部分具有抑制黑素生成的化學成分，但是涉及成分少，而且這類植物種屬繁多，加至提取工藝、提取部位不同而各具功效。因此對滇山茶、車桑子在皮膚美白劑中的研發(fā)空間還很大。

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Effects ofCamellia retic ulata,Chloranthus japonicas,Dodonaea viscosaandParis polyphyllaon the proliferation of and tyrosinase activity in a melanocyte cell line

Huang Xiaofeng*,Liu Haiyang,Guo Meihua,Pang Qin,Zou Xi,Yang Xiaoyan,Yang Cheng,Ma Xiao,He Li.*Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Kunming Medical University;Innovation Team of Ministry of Education,Collaborative Innovation Center of Yunnan Province;Engineering and Technology Research Center of Yunnan Province,Kunming 650000,China

ObjectiveTo estimate the whitening effect of extracts ofCamellia reticulata,Chloranthus japonicas,Dodonaea viscosaandParis polyphylla.MethodsA human epidermal melanocyte cell line HEM-m was culturedin vitro,and classified into several groups to be treated with 7 concentrations（10,25,50,100,200,400,800 mg/L）of different plant extracts,includingCamellia reticulataleaf extract,70%ethanol-eluted fraction ofCamellia reticulataleaf extract,extract ofCamellia reticulataalabastrum,70%ethanol-eluted fraction of extract ofCamellia reticulata alabastrum,Chloranthus japonicasextract,Dodonaea viscosaextract,andParis polyphyllaextract.At the same time,the negative control group,blank control group and positive control group（treated with 100 mg/L arbutin）were set up.After 72 hours of treatment,MTT assay was performed to detect cell proliferation,and dopa-oxidation assay to estimate tyrosinase activity in melanocytes.ResultsAs far as the inhibitory effect on the proliferation of HEM-m cells was concerned,400 mg/LCamellia reticulataleaf extract,70%ethanol-eluted fraction ofCamellia reticulataleaf extract at 10－100 mg/L,extract ofCamellia reticulataalabastrum at 10－25 mg/L,70%ethanol-eluted fraction of extract of Camellia reticulataalabastrum at 10 mg/L andDodonaea viscosaextract at 10－25 mg/L were equivalent to（allP＞0.05）,800 mg/LCamellia reticulataleaf extract was significantly weaker than （P ＜ 0.05）,while the other concentrations of these plant extracts were significantly stronger than （P＜0.05 or 0.01）,100 mg/L arbutin.In the case of inhibitory effect on tyrosinase activity,100 mg/L arbutin was similar to 10 mg/LCamellia reticulataleaf extract,70%ethanol-eluted fraction ofCamellia reticulataleaf extract at 10－400 mg/L,extract ofCamellia reticulataalabastrum at 10－25 mg/L,70%ethanol-eluted fraction of extract ofCamellia reticulataalabastrum at 50－100 mg/L,Chloranthus japonicasextract at 10－50 mg/L and 400 mg/L,Dodonaea viscosaextract at 10－800 mg/L andParis polyphyllaextract at 10 and 100－200 mg/L（allP＞0.05）,stronger than 70%ethanol-eluted fraction of extract ofCamellia reticulataalabastrum at 10－25 mg/L （P＜0.05）,but weaker than the other concentrations of these plant extracts（P＜0.05 or 0.01）.ConclusionSpecial concentrations ofCamellia reticulateandDodonaea viscosecan inhibit tyrosinase activity.

Plant extracts;Melanocytes;Cell proliferation;Tyrosinase

He Li,Email:drheli2662@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.02.019

650000昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院皮膚科、教育部創(chuàng)新團隊、云南省協(xié)同創(chuàng)新中心、云南省工程技術研究中心（黃曉鳳、郭美華、何黎）；中國科學院昆明植物所（劉海洋）；云南薇諾娜皮膚醫(yī)療美容中心（龐勤、鄒菥、楊小燕、楊成）；昆明貝泰妮生物科技有限公司（馬驍）

何黎，Email：drheli2662@126.com

2014-05-23）

（本文編輯：吳曉初）