蔡澤明 趙瑩 張斌 鞏毓剛 西蘭 楊建 章星琪

·研究報道·

早期斑禿皮損處炎癥細胞因子及凋亡因子的異常表達

蔡澤明 趙瑩 張斌 鞏毓剛 西蘭 楊建 章星琪

目的 探討早期斑禿皮損淺層、深層及斑禿生長期毛囊凋亡因子及炎癥細胞因子的表達。方法收集25例早期斑禿皮損及15例正常頭皮病理取材組織標本，通過熒光定量PCR檢測標本中凋亡基因p53、caspase3、Fas和生存素、bcl-2 以及炎癥細胞因子白細胞介素（IL）-4、IL-10、干擾素 γ（IFN-γ）、IL-12 mRNA 表達水平，免疫組化檢測皮損中生長期毛囊P53的蛋白質(zhì)表達。結(jié)果 斑禿生長期毛囊促凋亡因子caspase3、P53、Fas mRNA表達水平較對照組升高，變化倍數(shù)分別為6.78、8.01、9.74，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。抑制凋亡因子bcl-2、生存素mRNA較正常降低，變化倍數(shù)分別為0.08、0.03（均P＜0.01），炎癥細胞因子無改變。斑禿淺層Th1因子IFN-γ、IL-12 mRNA較正常水平升高，變化倍數(shù)分別為2.75、85.67（P值分別＜0.05、0.01）。Th2因子IL-10表達水平降低，變化倍數(shù)為0.002（P＜0.01）。而且，斑禿皮損淺層IL-10及IL-12 mRNA改變幅度高于深層（P值分別＜0.01、0.05）。免疫組化顯示斑禿皮損生長期毛囊每100個細胞中p53陽性細胞數(shù)較對照組升高（t=23.79，P＜0.01）。結(jié)論 斑禿生長期毛囊凋亡因子升高，抑制凋亡因子表達下降提示凋亡因子在斑禿發(fā)病中起一定作用。

斑禿；細胞因子類；凋亡誘導因子；腫瘤抑制蛋白質(zhì)p53

斑禿發(fā)病過程中常伴有局部炎癥反應，典型改變?yōu)樯L期毛囊毛乳頭周圍蜂窩狀淋巴細胞浸潤，該處炎癥細胞在斑禿發(fā)病中具體作用存在爭議。我們對斑禿皮損進行病理檢查發(fā)現(xiàn)，早期斑禿存在頭皮淺層炎癥，前期研究還發(fā)現(xiàn)具有此類改變的斑禿預后較好，均提示淺層炎癥在斑禿發(fā)病中有一定作用［1-4］。探討斑禿發(fā)病時所存在的淺深層炎癥及Th1/Th2因子、細胞凋亡因子變化將有助于了解斑禿發(fā)病機制。我們檢測早期斑禿皮損邊緣頭皮淺層、深層及分離的生長期毛囊炎癥細胞因子及凋亡因子mRNA表達水平，并分析各部位細胞因子變化差異，進而探討Th1/Th2因子變化及凋亡因子在斑禿發(fā)病中的作用。

一、資料

1.2010年8月至2011年3月，收集本院脫發(fā)?？圃缙冢?］斑片型斑禿患者25例，其中男13例，女12例，年齡20～47歲，平均27.13歲，平均病程1.78個月。25例患者中1例有斑禿家族史，1例有特應性皮炎病史。正常對照組男8例，女7例，年齡16～49歲，平均29.4歲，與斑禿組在性別及年齡上差異無統(tǒng)計學意義。所有患者近1個月內(nèi)未系統(tǒng)或局部使用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑，15例對照來自本院外科頭皮手術(shù)如皮膚良性腫瘤或色素痣切除邊緣頭皮組織正常頭皮。本研究通過中山大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

2.試劑與儀器：RNA試劑盒產(chǎn)自美國Qiagen公司，S1000 thermal cyclerPCR儀產(chǎn)自美國伯樂BIO-RAD公司，Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒產(chǎn)自寶生物工程（大連）有限公司。

二、方法

1.取材：斑禿皮損邊緣約1 cm處行組織病理檢查，切取約10 mm×8 mm皮膚組織，分為兩份。一份用4%甲醛固定，石蠟包埋，切片后行免疫組化染色；另一份標本在皮脂腺水平離斷，分為頭皮淺層、頭皮深層并置入RNA保存液中。部分標本行毛囊分離，頭皮深層刀片沿毛囊生長方向切成3 mm×6 mm小份，在解剖顯微鏡下眼科鑷夾住外毛根鞘將毛囊從皮下脂肪組織中拉出，將分離后的毛囊置入RNA保存液中，-20 ℃保存［3］。

2.p53免疫組化染色：常規(guī)制備。以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替p53單抗作陰性對照。在×400光鏡下，隨機選取5個生長期毛囊中部水平的視野，計數(shù)每個視野100個有核細胞中陽性細胞數(shù)。

3.熒光定量PCR檢測皮損炎癥細胞因子及凋亡因子mRNA表達水平：

（1）引物設(shè)計：參照基因序列軟件由寶生物工程（大連）有限公司合成引物如下：β肌動蛋白，上游5′-CGACAACGG CTCCGGCATGTGC-3′，下游 5′-CGTCACCGGAGTCCATCAC GATGC-3′；白細胞介素（IL）-4，上游 5′-CTTCCCCCTCTGTT CTTCCT-3′，下游 5′-TTCCTGTCGAGCCGTTTCCAG-3′；IL-10，上游 5′-TGCTAACCGACTCCTTAATGCAGGAC-3′，下游 5′-CC TTGATTTCTGGGCCATGCTTCTC-3′；IL-12，上游 5′-TGGGTG GGTCAGGTTTGATG-3′，下游 5′-GCCCAGCTCTGAGGAGAG T-3′；caspase，上游 5′-GACTCTGGAATATCCCTGGACAAC-3′，下游 5′-CTGAGGTTTGCTGCA TCGACA-3′；bcl-2，上游 5′-A GGCACCCAGGGTGATGCAA-3′，下游 5′-GTGGAGGAGCTCTTC AGGGA-3′；p53，上游 5′-TCCA ATACAGCATGACTG-3′，下游5′-AGCCTCCAACATCCTTGAT TTCT-3′；Fas，上游 5′-TTGGT GGACCCGCTCAGTA-3′，下游5′-AATCTAGCAACAGACTAA GAACAAG-3′；生存素，上游5′-CCAAGTCTGGCTCGTTCTC AG-3′，下游 5′-CAGATTTGA ATCGCGGGACCC-3′。

（2）總RNA提取：根據(jù)試劑盒說明書提取頭皮淺層、生長期毛囊以及頭皮深層組織中總RNA，Thermo Nanodrop 2000測定RNA濃度，-80℃保存或立即合成為cDNA。

（3）cDNA的合成：使用S1000 thermal cyclerPCR儀合成cDNA，按照 Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒（DDR037A）20 μl反應體系行總RNA逆轉(zhuǎn)錄，反應體系如下：緩沖液4 μl，隨機引物1 μl，反轉(zhuǎn)錄酶混合物 1 μl，寡 dT 引物 1 μl，總 RNA 300 ng加水至 20 μl。反應條件如下：37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s cDNA-20℃保存。

（4）熒光定量PCR反應：反應體系20 μl如下：SYBR染料 Taq TM 酶 10 μl，Rox 校正液 0.4 μl，雙蒸水 7.8 μl，DNA模板1 μl（0.25 ng），上下游引物各0.4 μl（20 nmol/L）。反應條件：預變性 95℃ 1 min，95℃ 5 s、63℃ 1 min 40個循環(huán)，95℃1 min、65℃30 s 1個循環(huán)?；虮磉_倍數(shù)改變（fold change）計算公式為2-ΔΔCt，ΔCt為樣本待測目的基因的Ct值與內(nèi)參照β肌動蛋白Ct差值的均數(shù)，ΔΔCt為樣本目的基因ΔCt與正常對照ΔCt的差值，以2-ΔΔCt作為基因的相對表達水平。

4.統(tǒng)計學方法：采用SPSS 13.0軟件包進行統(tǒng)計分析。熒光定量PCR計量資料先用Shapiro-Wilk法檢驗正態(tài)性，兩個均數(shù)的比較采用獨立樣本t檢驗，多個均數(shù)及兩兩比較分別采用單因素方差分析（One-way ANOVA）及LSD-t檢驗免疫組化結(jié)果采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

三、結(jié)果

1.斑禿皮損邊緣淺層、深層及生長期毛囊炎癥細胞因子及凋亡因子mRNA表達：斑禿皮損邊緣分離的生長期毛囊促凋亡基因如caspase3、p53、Fas mRNA表達水平均較正常對照組升高（t=2.41、2.27、2.73，均P＜ 0.05），抑制凋亡因子如bcl-2、生存素mRNA表達水平顯著降低（t=6.76 6.87，均P＜0.01）。斑禿皮損中生長期毛囊炎癥細胞因子IFN-γ、IL-12、IL-10及IL-4mRNA表達水平與正常毛囊差異均無統(tǒng)計學意義。見表1，2。

斑禿皮損邊緣淺層IFN-γ、IL-12較正常對照頭皮淺層升高（t值分別為 2.59、10.51，P值分別 ＜ 0.05，0.01），IL-10降低（t=9.42，P＜ 0.01）。凋亡因子如 caspase3、p53、Fas mRNA表達水平在斑禿皮損淺層和正常頭皮之間差異無統(tǒng)計學意義。斑禿皮損邊緣深層IL-12 mRNA表達水平較正常對照頭皮深層顯著升高（t=3.28，P ＜ 0.05），IL-4、IFN-γ、IL-10表達水平差異無統(tǒng)計學意義。斑禿皮損深層各凋亡因子表達水平與正常對照之間差異無統(tǒng)計學意義。見表1，2。

表1 斑禿皮損邊緣及淺層、深層生長期毛囊各炎癥細胞因子表達水平（2-ΔΔCt）

表2 斑禿生長期毛囊、淺層、深層凋亡因子表達水平（2-ΔΔCt）

斑禿皮損淺層IL-12、IL-10變化幅度高于皮損深層，差異均有統(tǒng)計學意義（F=6.36、35.16，P 值分別 ＜ 0.05、0.01）。斑禿淺深層 IFN-γ、IL-4、p53、Fas凋亡受體、bcl-2、生存素等因子變化幅度比較差異無統(tǒng)計學意義。

2.生長期毛囊p53表達情況：免疫組化染色中p53為核內(nèi)著色，在正常對照的表皮基底層、毛囊內(nèi)外毛根鞘、皮脂腺、小汗腺以及皮下脂肪細胞均可見p53染色陽性的細胞，其中以毛囊周期性部分的外毛根鞘細胞p53表達程度較強，陽性率較高（圖1A）。早期斑禿皮損邊緣的生長期毛囊p53陽性細胞數(shù)目和陽性率顯著高于正常對照，正常對照生長期毛囊細胞中p53陽性細胞數(shù)為47.65±5.27，斑禿生長期毛囊細胞 p53陽性細胞數(shù)為 89.58±5.32（t=23.79，P ＜0.01），見圖1。

四、討論

目前研究多認為斑禿發(fā)病是在具有遺傳易感性基礎(chǔ)上，在環(huán)境、神經(jīng)內(nèi)分泌、免疫等多因素影響下的，由T細胞介導以Th1型反應為特征、針對生長期毛囊的器官特異性自身免疫性疾?。?］。免疫豁免喪失是斑禿發(fā)病的重要機制之一，正常生長期毛囊局部主要組織相容性復合體Ⅰ、Ⅱ類分子（MHC-Ⅰ、Ⅱ）、細胞間黏附因子1（ICAM-1）低表達而處于免疫豁免，斑禿發(fā)病時上述因子表達升高致免疫豁免喪失，毛囊抗原被自身T淋巴細胞識別而發(fā)生免疫應答［5-7］。

研究中，我們發(fā)現(xiàn)早期斑禿皮損邊緣生長期毛囊僅出現(xiàn)凋亡因子水平上升而趨向凋亡，毛囊自身并不出現(xiàn)可改變周期的炎癥細胞因子變化，提示斑禿毛囊的凋亡更可能源于皮損中細胞因子的變化，而不是自身周期的體現(xiàn)。斑禿皮損淺層Th1類細胞因子如IL-12、IFN-γmRNA表達水平顯著升高，Th2類細胞因子IL-10表達水平顯著降低，該結(jié)果與既往研究一致，即Th1占優(yōu)勢的Th1/Th2是斑禿重要發(fā)病機制。我們還發(fā)現(xiàn)斑禿皮損淺層的Th1類細胞因子IFN-γ升高幅度、Th2類因子IL-10降低幅度均大于深層，細胞因子在皮膚內(nèi)分布一般由高濃度區(qū)向低濃度區(qū)彌散，提示引起斑禿的Th1/Th2因子失衡的源頭可能存在于淺層，即淺層的炎癥重要性可能大于深層，深層毛乳頭附近的炎癥可能為繼發(fā)性或反應性的。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)早期斑禿頭皮淺層血管周圍有炎癥浸潤以及淺層毛囊外毛根鞘的外層細胞液化變性［1］。另有報道斑禿皮損毛乳頭附近出現(xiàn)含有異物巨細胞的肉芽腫，支持該處的炎癥可能是針對毛囊細胞死亡釋放產(chǎn)物的Th1型肉芽腫反應［8］。我們曾在急性進展期彌漫性斑禿患者中發(fā)現(xiàn)毛乳頭附近出現(xiàn)異物巨細胞，估計可能是局部區(qū)域內(nèi)全體毛囊細胞快速凋亡并釋放大量細胞產(chǎn)物所致［9-10］。上述過程臨床上表現(xiàn)為斑禿生長期毛囊急速廣泛退行性變，導致皮損深層毛乳頭附近出現(xiàn)繼發(fā)性炎癥，以清除大量出現(xiàn)的退行凋亡毛囊細胞及其分解產(chǎn)物。至于斑禿的發(fā)病，我們曾發(fā)現(xiàn)斑禿患者的表皮聚絲蛋白表達水平下降，以及斑禿小鼠的垂體-腎上腺系統(tǒng)反應異常，均可作為斑禿的誘發(fā)因素［11-12］。

圖1 免疫組化檢測生長期毛囊p53表達（DAB×100） 1A：正常對照頭皮；1B：斑禿皮損

我們推測斑禿可能的發(fā)病機制如下：在一定遺傳因素下，各種原因如皮膚屏障缺陷或神經(jīng)因素所致的淺層炎癥觸發(fā)Th1類因子升高和（或）Th2類因子降低，淺層毛囊屬于永久毛囊，含有干細胞以及可能對毛囊周期的變化起決定性作用的成分，引起局部區(qū)域內(nèi)毛囊發(fā)生退行性變。淺層的細胞因子通過彌散作用逐漸致深層Th1類因子升高、Th2類因子降低，從而誘導深層附近毛囊MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類分子和ICAM-1表達升高，導致毛囊免疫赦免喪失，局部自身抗原暴露，被抗原提呈細胞提呈，加之細胞凋亡后釋放的細胞產(chǎn)物，引起毛囊周圍繼發(fā)性CD4+及CD8+T淋巴細胞浸潤及活化，后者進一步分泌釋放各種細胞因子，趨化單核巨噬細胞，吞噬死亡細胞產(chǎn)物，引起免疫反應級聯(lián)擴大，導致斑禿皮損進一步擴大。

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Abnormal expressions of inflammatory cytokines and apoptosis-related factors in lesions of early alopecia areata

Cai Zeming*,Zhao Ying,Zhang Bin,Gong Yugang,Xi Lan,Yang Jian,Zhang Xingqi.*Department of Dermatology,Third Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 332000,China

ObjectiveTo detect the expressions of apoptosis-related factors and inflammatory cytokines in superficial and deep layers of as well as anagen hair follicles in lesions of early alopecia areata （AA）.MethodsScalp biopsy samples were collected from 25 patients with early AA and 15 healthy human controls.Fluorescence-based quantitative PCR was performed to detect mRNA expressions of apoptosis-related genes p53,caspase 3,Fas,survivin and bcl-2,as well as those of inflammatory cytokines interleukin （IL）-4,IL-10,IL-12 and interferon （IFN）-γ.An immunohistochemical assay was conducted to measure the expression of p53 protein in anagen hair follicles.ResultsCompared with control skin samples,anagen hair follicles in AA lesions showed significantly increased mRNA expression levels（expressed as 2-ΔΔCt）of pro-apoptotic factors caspase 3,p53 and Fas（6.78,8.01,9.74,respectively,all P ＜ 0.05）,but decreased mRNA expression levels of antiapoptotic factors bcl-2 and survivin （0.08 and 0.03 respectively,bothP ＜ 0.01）,and similar mRNA expression levels of inflammatory cytokines.There was a significant increase in mRNA expression levels of Th1 cytokines IFN-γ and IL-12（2.75 vs.1.00,P＜0.05;85.67 vs.1.00,P＜0.01）,but a significant decrease in the expression level of the Th2 cytokine IL-10 （0.002 vs.1.000,P ＜ 0.01）in superficial layers of AA lesions compared with those of normal control skin.The degree of changes in mRNA expression levels of IL-10 and IL-12 was significantly higher in superficial layers than in deep layers of AA lesions （P＜0.01 and 0.05 respectively）.The immunohistochemical assay showed that the number of p53-positive cells per 100 cells in anagen hair follicles of AA lesions was higher than that in those of control skin （t=23.79,P＜0.01）.Conclusions Anagen hair follicles in AA lesions exhibit high expressions of pro-apoptosis factors,but low expressions of antiapoptotic factors,suggesting that apoptotic factors play a role in the occurrence of AA.

Alopecia areata;Cytokines;Apoptosis-inducing factor;Tumor suppressor protein p53

Zhang Xingqi,Email:xingqi.zhang@aliyun.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.02.017

332000南昌大學第三附屬醫(yī)院皮膚科（蔡澤明）；山東菏澤市立醫(yī)院皮膚科（趙瑩）；中山大學附屬第一醫(yī)院皮膚科（張斌、鞏毓剛、西蘭、楊建、章星琪）

章星琪，Email：xingqi.zhang@aliyun.com

2014-03-09）

（本文編輯：尚淑賢）