許功軍 蔡綏勍

·論著·

miR-203及其下游靶基因p63、生存素在銀屑病皮損中的表達

許功軍 蔡綏勍

目的 檢測尋常性銀屑病皮損中miR-203及其下游靶基因p63、生存素的表達水平。方法 實時PCR法檢測30例尋常性銀屑病患者皮損及30例健康對照皮膚中miR-203、p63、生存素mRNA的表達水平，miR-203以U6為內(nèi)參照，p63和生存素以GAPDH為內(nèi)參照；Western印跡法檢測靶基因p63、生存素蛋白表達水平，兩組間比較采用t檢驗，尋常性銀屑病皮損中miR-203與生存素、p63表達的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。結(jié)果 與健康對照皮膚相比，尋常性銀屑病皮損中miR-203 mRNA表達量為對照組的（0.41±0.11）倍，表達明顯下調(diào)（t=3.16，P＜0.05）；其靶基因 p63、生存素 mRNA表達量分別為對照組的（4.79±0.63）和（3.43±0.46）倍，表達水平明顯上調(diào)（t值分別為4.72、4.35，均P＜0.05）；靶基因p63、生存素蛋白表達量分別為對照組的（2.40±0.23），（3.49± 0.14）倍，表達水平也明顯上調(diào)（t值分別為 3.87、4.36，均 P ＜0.05）。尋常性銀屑病皮損中miR-203 mRNA 與生存素 mRNA 呈負相關(guān)（r=-0.36，P＜0.05），與 p63 mRNA 呈負相關(guān)（r=-0.43，P＜0.05）。結(jié)論 miR-203及其下游靶基因p63、生存素可能參與了銀屑病的發(fā)病過程。

銀屑病；miR-203；基因，p63；生存素

銀屑病的確切病因尚未明確，以往的研究證實，凋亡抑制基因生存素和p63在尋常性銀屑病皮損中高表達［1-2］，且參與角質(zhì)形成細胞異常增殖等病理過程，但其具體的調(diào)控機制不清。miRNA廣泛存在于哺乳動物基因組中，具有高度的保守性，在腫瘤、炎癥等疾病的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用［3］。根據(jù)5′端序列不同，miRNA可分為多個家族，無法劃分為一個家族的稱為孤兒miRNA，其中miR-203位于14q32.33，在上皮組織特異性表達，參與皮膚發(fā)育、穩(wěn)態(tài)及功能維持，是皮膚中重要的調(diào)控因子［4］。此外，miR-203在上皮組織腫瘤中有抑癌和促凋亡作用，參與上皮來源腫瘤的發(fā)生［5］。miR-203為生存素和p63上游重要的調(diào)控基因［6-7］。本研究檢測尋常性銀屑病皮損組織中miR-203、生存素和p63 mRNA及蛋白的表達水平，探討尋常性銀屑病皮損中p63和生存素基因表達上調(diào)的原因。

材料和方法

一、臨床資料

收集2013年1-12月我科病理室保存的30例尋常性銀屑病患者皮損蠟塊標本。其中男15例，女15例，年齡17～56歲，平均年齡30.1歲。部位包括四肢19例，頭面部1例，胸背部10例。另選取30例健康人皮膚為對照組，兩組在年齡、性別、取材部位上相匹配。本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準，所有銀屑病患者與健康人對照組均簽署知情同意書。

二、材料與試劑

石蠟組織miRNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)公司），一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green I實時定量PCR試劑盒（美國羅氏公司），引物（上海吉瑪生物技術(shù)公司），DEPC及RNA-free水（北京索萊寶生物技術(shù)公司），氯仿、異丙醇、無水乙醇等均為分析純（國藥集團上海試劑公司），鼠抗人p63、生存素、β肌動蛋白多克隆抗體（英國Abcam公司）；HRP標記的山羊抗鼠二抗（中杉金橋公司）；苯甲基磺酰氟（PMSF）、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL顯色試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）。

三、實驗方法

1.總RNA和miRNA提?。喝コ龢吮局車M量多的石蠟，10 μm連續(xù)切片，取4張切片裝入1個無RNase的Ep管中，二甲苯脫蠟，無水乙醇洗滌并晾干，后續(xù)提取步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。應(yīng)用微量紫外分光光度計測定總RNA的純度和濃度。

2.實時熒光定量RT-PCR檢測miR-203、生存素及p63 mRNA的表達：采用一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用20 μl反應(yīng)體系，具體參見試劑盒說明書，miRNA的反轉(zhuǎn)錄采用加尾。SYBR green I染料法進行實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)，取1 μl上述cDNA為模板，miR-203以U6作為內(nèi)參照，生存素和p63以GAPDH作為內(nèi)參照。每個檢測樣本做3個復孔，反應(yīng)條件為：95℃預熱 3 min；95℃ 12 s，60℃40 s，40個循環(huán)。ΔCt值=目的基因Ct值-同組內(nèi)參Ct值，ΔΔCt=ΔCt實驗-ΔCt對照。以對照組目的基因表達量為1，2-ΔΔCt值即為實驗組目的基因較對照組目的基因表達的倍數(shù)。

3.Western印跡法檢測生存素及p63蛋白的表達水平：同一批健康對照組新鮮皮膚組織和銀屑病患者新鮮皮損組織中加入含1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液，經(jīng)玻璃勻漿器勻漿直至充分裂解。14 000×g離心5 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度。以30 μg上樣量經(jīng)SDS-PAGE膠電泳（濃縮膠80 V、分離膠120 V），以200 mA恒流1.5 h濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，鼠抗人p63、生存素、β肌動蛋白多克隆抗體4℃孵育過夜（工作濃度1∶1 000），TBST洗膜 3次，每次 10 min。加入 HRP標記的二抗（1∶5 000）孵育 1 h，TBST洗膜 3次，每次10 min，ECL法顯色。Image J分析軟件分析目的蛋白條帶的平均灰度值，以β肌動蛋白作為內(nèi)參，以目的蛋白與β肌動蛋白的灰度比值作為目的蛋白的相對表達量，進行統(tǒng)計學分析。

四、統(tǒng)計學處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，miR-203、生存素、p63的表達水平以±s表示，兩組之間的差異比較采用t檢驗，應(yīng)用Pearson相關(guān)性分析，分析miR-203 miRNA表達與生存素miRNA、p63 miRNA表達之間的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、miR-203、生存素、p63 mRNA在尋常性銀屑病皮損中的表達水平

銀屑病皮損中miR-203 mRNA表達量為對照組的0.41±0.11倍，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（t=3.16，P＜0.05）。生存素和p63 mRNA在銀屑病皮損中的表達量分別為對照組的3.43±0.46和4.79±0.63倍，兩組間差異均有統(tǒng)計學意義（t值分別為 4.35、4.72，均 P＜0.05）。經(jīng) Pearson相關(guān)性分析，miR-203 mRNA與生存素mRNA呈負相關(guān)（r=-0.36，P＜0.05），與 p63 mRNA 呈負相關(guān)（r=-0.43，P ＜ 0.05）。

二、靶基因生存素、p63蛋白在尋常性銀屑病皮損中的表達水平

生存素和p63蛋白在銀屑病皮損中的表達量分別為對照組的3.49±0.14和2.40±0.23倍，經(jīng)t檢驗，兩組差異有統(tǒng)計學意義（t值分別為4.36、3.87，均 P ＜ 0.05）。見圖 1。

討 論

miRNA是內(nèi)源性非蛋白編碼單鏈小分子RNA，主要功能為轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達，參與基因表達的調(diào)控過程，從而在細胞分化、增殖、凋亡、抗病毒及腫瘤免疫中發(fā)揮作用［3］，miRNA對其靶基因的調(diào)節(jié)障礙會導致不同疾病的發(fā)生［8］。miR-203是一種具有高度皮膚特異性的miRNA，明顯表達于表皮基底層，通過抑制增殖潛能、誘導細胞周期退出，促進表皮的分化［4-5］，其低表達于銀屑病皮損中，這與本研究的結(jié)果一致。

圖1 Western印跡法檢測尋常性銀屑病皮損與健康對照組皮膚組織中生存素以及p63蛋白的相對表達量 上圖為Western印跡結(jié)果，下圖為相對灰度值的柱狀圖。與對照組相比，尋常性銀屑病皮損中生存素和p63表達顯著上調(diào)（P＜0.05）

生存素和p63都是miR-203進化保守的靶基因。生存素主要在細胞周期G2/M期表達，定位于細胞有絲分裂的紡錘體，具有促進細胞有絲分裂的作用［9］。此外，生存素還可以直接抑制各種凋亡途徑的終末效應(yīng)蛋白Caspase-3和Caspase-7，發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用［10］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，尋常性銀屑病皮損中生存素mRNA的表達水平較健康對照皮膚組織明顯上調(diào)，這與國內(nèi)外的研究結(jié)果均一致［11-14］。生存素的高表達與銀屑病角質(zhì)形成細胞的異常增殖和分化有關(guān)，同時參與了真皮乳頭層毛細血管的增生、擴張［15］。p63基因是腫瘤抑制基因p53家族成員之一，其在細胞死亡、分化、腫瘤發(fā)生中扮演重要角色，在維持表皮干細胞和表皮的分層中發(fā)揮較大作用［16］，控制著角質(zhì)形成細胞的增殖和分化。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p63在銀屑病皮損中表達上調(diào)，這與國外的研究結(jié)果一致［17-18］，有研究表明，p63基因可能參與銀屑病的早期階段，并與表皮突的延伸相關(guān)。經(jīng)統(tǒng)計分析，miR-203 mRNA的表達水平與生存素mRNA的表達水平呈負相關(guān)，與p63 mRNA的表達水平呈負相關(guān)，由此推測，miR-203的異常表達可能導致生存素和p63基因表達上調(diào)，進而促進角質(zhì)形成細胞增殖，抑制其凋亡，參與皮損的形成過程。

綜上所述，miR-203可能通過調(diào)控其下游靶基因生存素、p63的異常表達參與尋常性銀屑病皮損的形成過程。

［1］Abdou AG,Hanout HM.Evaluation of survivin and NF-kappaB in psoriasis,an immunohistochemical study［J］.J Cutan Pathol,2008,35（5）:445-451.

［2］Shen CS,Tsuda T,Fushiki S,et al.The expression of p63 during epidermal remodeling in psoriasis［J］.J Dermatol,2005,32（4）:236-242.

［3］Wang Y,Stricker HM,Gou D,et al.MicroRNA:past and present［J］.Front Biosci,2007,12:2316-2329.

［4］Wei T,Orfanidis K,Xu N,et al.The expression of microRNA-203 during human skin morphogenesis［J］.Exp Dermatol,2010,19（9）:854-856.

［5］Viticchiè G,Lena AM,Cianfarani F,et al.MicroRNA-203 contributes to skin re-epithelialization［J］.Cell Death Dis,2012,3:e435.

［6］Bian K,Fan J,Zhang X,et al.MicroRNA-203 leads to G1 phase cell cycle arrest in laryngeal carcinoma cells by directly targeting survivin［J］.FEBS Lett,2012,586（6）：804-809.

［7］Lena AM,Shalom-Feuerstein R,Rivetti di Val Cervo P,et al.miR-203 represses ′stemness′by repressing DeltaNp63［J］.Cell Death Differ,2008,15（7）:1187-1195.

［8］王凌霄,彭代輝,方貽儒.微小RNA在精神疾病中的研究進展［J］.中華精神科雜志,2012,45（4）:247-250.

［9］陳濤,田伏洲.Survivin基因與腫瘤研究進展［J］.中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志,2002,9（5）:364-366.

［10］蔣偉忠.Survivin在胃癌組織中的表達和意義及其與p53、Bcl-2及Bax蛋白表達的相關(guān)性研究［D］.福州：福建醫(yī)科大學,2004.

［11］Bowen AR,Hanks AN,Murphy KJ,et al.Proliferation,apoptosis,and survivin expression in keratinocytic neoplasms and hyperplasias［J］.Am J Dermatopathol,2004,26（3）：177-181.

［12］Markham T,Mathews C,Rogers S,et al.Downregulation of the inhibitor of apoptosis protein survivin in keratinocytes and endothelial cells in psoriasis skin following infliximab therapy［J］.Br J Dermatol,2006,155（6）：1191-1196.

［13］江從軍,劉貞富,徐秋梅,等.生存素在尋常型銀屑病皮損中的表達［J］.中國麻風皮膚病雜志,2007,23（5）：391-392.

［14］Abdou AG,Hanout HM.Evaluation of survivin and NF-kappaB in psoriasis,an immunohistochemical study ［J］.J Cutan Pathol,2008,35（5）：445-451.

［15］孫波,徐雨.銀屑病皮損中Survivin、VEGF和Ang-2的表達［J］.中國麻風皮膚病雜志,2012,28（5）：320-323.

［16］孔繁飛,黃清怡,孔煥宇.p63在皮膚發(fā)生發(fā)育及損傷修復中的作用［J］.中國組織工程研究與臨床康復,2007,11（49）：9989-9992.

［17］Shen CS,Tsuda T,Fushiki S,et al.The expression of p63 during epidermal remodeling in psoriasis［J］.J Dermatol,2005,32（4）：236-242.

［18］Kim SY,Cho HJ,Kim DS,et al.Differential expression of p63 isoforms in normal skin and hyperproliferative conditions ［J］.J Cutan Pathol,2009,36（8）：825-830.

Expressions of miR-203 and its downstream target genes p63 and survivin in psoriatic lesions

Xu Gongjun,Cai Suiqing*.*Department of Dermatology,Second Affiliated Hospital,Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou 310009,China

Cai Suiqing,Email:caisuiqing@163.com

ObjectiveTo measure the expressions of miR-203 and its downstream target genes p63 and survivin in psoriasis vulgaris lesions.MethodsTissue specimens were collected from lesions of 30 patients with psoriasis vulgaris and normal skin of 30 healthy human controls.Real-time PCR was performed to detect miR-203 mRNA expression with U6 as the internal control,as well as p63 and survivin mRNA expressions with glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）as the internal control,and Western blot to measure the protein expressions of miR-203 targets p63 and survivin.Statistical analysis was carried out byttest for intergroup comparisons and by Pearson correlation analysis for the analysis of correlation between miR-203,p63 and survivin expressions in psoriasis vulgaris lesions.ResultsCompared with the normal control skin,psoriasis vulgaris lesions showed significantly decreased mRNA expression level（2-△△C）tof miR-203（0.41±0.11,t=3.16,P＜0.05）,but increased mRNA expression levels of p63（4.79±0.63,t=4.72,P＜0.05）and survivin（3.43±0.46,t=4.35,P＜0.05）.The protein expression levels of p63 and survivin in these lesions were（2.40 ± 0.23）times（t=3.87,P ＜ 0.05）and（3.49 ± 0.14）times（t=4.36,P ＜ 0.05）those in the normal control skin respectively.In psoriasis vulgaris lesions,the mRNA expression level of miR-203 showed a significantly negative correlation with that of survivin （r=-0.36,P＜0.05）and p63 （r=-0.43,P＜0.05）.ConclusionmiR-203 and its downstream target genes p63 and survivin may participate in the occurrence of psoriasis vulgaris.

Psoriasis;MiR-203;Genes,p63;Survivin

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.04.005

310009杭州，浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院皮膚科［許功軍（現(xiàn)在浙江省金華市第五醫(yī)院，321000）、蔡綏勍］

蔡綏勍，Email：caisuiqing@163.com

2015-01-28）

（本文編輯：顏艷）