張娟 趙鵬偉 楊麗敏 李東霞

·論著·

小檗堿對人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞增殖和凋亡的影響

張娟 趙鵬偉 楊麗敏 李東霞

目的 探討小檗堿對人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞株增殖及凋亡相關(guān)信號通路中Bax與Bcl-2表達的影響。方法 體外培養(yǎng)A431細胞，分別用含12.5、25、50、100 mg/L小檗堿的培養(yǎng)液（實驗組）、含250 mg/L順鉑的培養(yǎng)液（陽性對照組）、正常培養(yǎng)液（空白對照組）作用于A431細胞12、24、48、72 h后，用噻唑藍（MTT）法測定小檗堿對A431細胞生長的抑制作用；倒置顯微鏡觀察小檗堿作用后細胞形態(tài)學改變；實時定量RT-PCR法檢測小檗堿對A431細胞Bax和Bcl-2基因表達的影響；免疫熒光法分析Bax和Bcl-2的表達情況。采用SPSS 13.0軟件進行多因素方差分析。結(jié)果 MTT結(jié)果顯示，小檗堿對A431細胞的生長抑制作用隨作用時間的延長而增強（F=510.927，P＜0.001），隨濃度的增加而增強（F=1118.312，P ＜0.001），小檗堿濃度與作用時間的交互作用有統(tǒng)計學意義（F=70.239，P＜0.001），表明不同濃度小檗堿組各時間點的變化趨勢不完全一致。倒置顯微鏡下可見，隨著藥物濃度增加，A431細胞密度減少，由多角形變?yōu)閳A頓皺縮。實時定量RT-PCR結(jié)果表明，小檗堿作用后，隨著時間或濃度的增加，Bax/Bcl-2 mRNA相對表達量增加，同一濃度小檗堿（25、50、100 mg/L）作用 4、8、12 h 組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義（F=226.231、1 300.636、4 325.139，P ＜ 0.001）。免疫熒光染色顯示，小檗堿作用后A431細胞內(nèi)Bax熒光增強，而Bcl-2減弱。結(jié)論 小檗堿對A431細胞的生長抑制作用呈時間和濃度依賴性，Bax和Bcl-2的表達改變可能是小檗堿誘導A431細胞凋亡的途徑之一。

小檗堿；癌，鱗狀細胞；原癌基因蛋白質(zhì)c-bcl-2；bcl-2相關(guān)X蛋白質(zhì)；細胞凋亡；細胞增殖；A431細胞

皮膚鱗狀細胞癌（鱗癌）的早期診斷和及時治療甚為重要，而開發(fā)新藥和合理治療是目前亟待解決的難題及研究熱點。小檗堿（berberine）為一種季胺類化合物，屬異喹啉類生物堿，具有多種藥理作用［1］。近年來隨著對小檗堿藥效作用的深入研究，其抗腫瘤作用成為研究的熱點。本研究通過檢測小檗堿對皮膚鱗癌A431細胞生長抑制及細胞凋亡途徑中相關(guān)因子Bax/Bcl-2的表達情況，探討其作用機制，以期為皮膚鱗癌的治療提供一條新思路。

材料和方法

一、細胞株及主要試劑和儀器

人皮膚鱗癌A431細胞株（中國科學院上海細胞庫）；小檗堿（B325-5G）、噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma公司）；胎牛血清、改良DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；細胞RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒（日本Takara公司）；Bax兔抗人多克隆抗體、Bcl-2兔抗人多克隆抗體（美國Cell Signal公司）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體（美國KPL公司）；異硫氰酸熒光素（FITC）羊抗兔IgG抗體（北京博奧森）；酶標儀（美國Thermo公司）；PCR擴增儀（美國Applied Biosystems公司）。

二、A431細胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、飽和濕度細胞培養(yǎng)箱內(nèi)進行單層傳代培養(yǎng)。

三、MTT法檢測A431細胞增殖

取對數(shù)生長期細胞，0.25%胰酶消化，調(diào)整細胞數(shù)為1.0×105/ml，以每孔100 μl接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后去原培養(yǎng)液進行實驗。實驗分為空白對照組（正常培養(yǎng)液）、陽性對照組（含順鉑250 mg/L的培養(yǎng)液）、實驗組（含12.5、25、50、100mg/L小檗堿的培養(yǎng)液），各100 μl，每個濃度設(shè)3個復孔，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入 MTT（5 mg/L）20 μl。培養(yǎng)結(jié)束時，棄上清，加入DMSO 150 μl，振蕩 10 min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶標儀分別測定培養(yǎng)12、24、48、72 h 吸光度（A490值），細胞存活率=（實驗組平均A值/空白對照組平均A值）×100%。

四、A431細胞形態(tài)觀察

將A431細胞消化后調(diào)整細胞密度為1.0×105/ml，以每孔1 ml接種于6孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，待細胞貼壁生長約24 h，細胞融合至60%~70%時，棄原培養(yǎng)液，分別加入含小檗堿 0、25、50、100 mg/L 的培養(yǎng)液2 ml，培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

五、實時定量RT-PCR法檢測Bax和Bcl-2 mRNA的表達

1.提取A431細胞總 RNA：收集0、25、50、100mg/L小檗堿分別作用4、8、12 h后的細胞，用RNiso Plus試劑盒提取細胞總RNA，紫外分光光度儀測定總RNA濃度及純度，測定A260/A280值在1.8~2.0，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量。

2.逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：總反應體系20 μl（5×PrimeScript RT Master Mix 4 μl，總 RNA 與無 RNase水共 16 μl），在 37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s，4 ℃終止反應條件下進行逆轉(zhuǎn)錄反應，產(chǎn)物置-20℃冰箱保存待用。

3.實時定量RT-PCR擴增Bax、Bcl-2和內(nèi)參GAPDH目的片段：引物序列見表1。PCR反應體系為 20 μl：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ （2 ×）10 μl；上、下游引物（0.4 μmol/L）各 0.8 μl；ROX Reference Dye 0.4 μl；合成 cDNA 2 μl；無 RNase 水 6 μl。反應條件為：95℃ 10 min（1個循環(huán)）；變性 95℃ 15 s→退火Tm60s→延伸72℃30s（40個循環(huán)）；延伸：72℃7 min，4℃終止，測定A值，計算目的基因與內(nèi)參基因GAPDH的ΔCt（ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因），以空白對照組為對照，各試驗組的ΔCt減去空白對照組的ΔCt即為ΔΔCt值，最后轉(zhuǎn)化為相對差異倍數(shù)，即QR=2-ΔΔCt。

表1 實時定量RT-PCR擴增Bax、Bcl-2和內(nèi)參GAPDH目的片段所用引物序列（5′-3′）

六、免疫熒光法檢測細胞內(nèi)Bax和Bcl-2蛋白表達

將蓋玻片置于6孔板，取對數(shù)生長期細胞，0.25%胰酶消化后，用培養(yǎng)液稀釋成單細胞懸液，以1×104個/ml接種于6孔板中，每孔2 ml；細胞貼壁生長后去除培養(yǎng)液，分別加入含小檗堿0、50 mg/L的培養(yǎng)液2 ml；培養(yǎng)24 h后，去上清液，加入2 ml磷酸鹽緩沖液（PBS），3 min后吸去PBS，反復浸洗3次；加入4%多聚甲醛4℃固定15 min，吸去液體，PBS洗3次；0.5%Triton X-100室溫通透20 min，PBS洗3次，吸干殘留液體，在玻片上滴加羊血清封閉30 min，吸掉封閉液，在玻片上滴加足量稀釋好的一抗 Bax（1 ∶2 000）、Bcl-2（1 ∶500），放入暗盒，4 ℃孵育過夜；PBS浸洗3次，滴加1∶500稀釋的熒光標記二抗（FITC羊抗兔IgG抗體），暗盒中37℃孵育1 h，PBS浸洗，滴加4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸（DAPI）復染核，室溫避光孵育5 min，再用PBS洗3次，吸水紙吸干液體，甘油封片，4℃避光保存，熒光顯微鏡下觀察。

七、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、MTT法測定小檗堿對A431細胞增殖的影響

多因素方差分析顯示，小檗堿對A431細胞的生長抑制作用隨作用時間的延長而增強（F=510.927，P＜0.001），隨濃度的增加而增強（F=1118.312，P＜0.001）；小檗堿濃度與作用時間的交互作用有統(tǒng)計學意義（F=70.239，P ＜ 0.001），表明不同濃度小檗堿組各時間點的變化趨勢不完全一致。小檗堿對A431細胞的抑制作用具有明顯的時效依賴性和量效依賴性。見圖1。

二、細胞形態(tài)學觀察

倒置顯微鏡下觀察，空白對照組細胞生長狀態(tài)良好，為扁平的多角形，均質(zhì)性，折光性強，細胞間相互銜接，排列緊密，融合成片；藥物作用24 h后，25 mg/L小檗堿組折光性下降，細胞皺縮變圓，體積縮小，細胞間隙拉寬，散在懸浮細胞；隨著小檗堿濃度增加，懸浮細胞逐漸增多，細胞呈圓形散在分布。

三、實時定量RT-PCR檢測凋亡蛋白Bax/Bcl-2 mRNA表達情況

Bax mRNA在低濃度組表達較弱，在高濃度組表達較強；而Bcl-2 mRNA在低濃度組表達明顯，而高濃度組表達較弱。高濃度組（100 mg/L）Bax/Bcl-2 mRNA相對表達水平較低濃度小檗堿組（25、50mg/L）顯著升高；隨著作用時間延長，不同濃度藥物作用組Bax/Bcl-2 mRNA相對表達水平逐漸增高。相同濃度4、8、12 h組間比較差異均有統(tǒng)計學意義。見表2。

四、免疫熒光法檢測A431細胞內(nèi)Bax和Bcl-2蛋白的表達情況

免疫熒光觀察小檗堿對A431細胞中Bax和Bcl-2蛋白表達的影響及細胞生長抑制作用（圖2、3）。Bax蛋白和Bcl-2蛋白均分布于細胞質(zhì)中，藥物作用組與空白對照組比較，Bax蛋白表達增加（圖2），Bcl-2蛋白表達減少（圖3）（綠染熒光），活細胞數(shù)目減少（DAPI藍染細胞），二者疊加表現(xiàn)更加明顯和直觀。

討 論

近年來，抗癌藥物的研究熱點已逐漸轉(zhuǎn)向天然植物，中醫(yī)中藥治療腫瘤已成為腫瘤治療領(lǐng)域的一大特色［2-4］。小檗堿具有多種藥理作用，最初作為清熱解毒藥和抗菌藥物應用于臨床治療胃腸道疾病，小檗堿還有降血糖、降血脂、抗心力衰竭、抗消化性潰瘍等藥理作用［5］。近年來其抗腫瘤作用得到廣泛關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)［6］，小檗堿對鼻咽癌、肺癌、宮頸癌、前列腺癌等腫瘤細胞均有抑制作用，其作用機制主要為通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡、細胞周期阻滯等實現(xiàn)抗腫瘤作用。

圖1 不同濃度小檗堿對A431細胞存活率的影響 1：空白對照組；2～ 5：分別為 12.5、25、50、100 mg/L 小檗堿組；6：陽性對照組。隨時間延長和藥物濃度的增加，A431細胞存活率下降。a：與同一時間空白對照組比較，P＜0.05；b：與同一時間陽性對照組比較，P＜0.05

表2 不同濃度小檗堿作用A431細胞后Bax/Bcl-2 mRNA相對表達水平的變化（±s）

表2 不同濃度小檗堿作用A431細胞后Bax/Bcl-2 mRNA相對表達水平的變化（±s）

分組 小檗堿濃度25 mg/L 50 mg/L 100 mg/L 4 h 0.326 8±0.013 6 0.571 1±0.002 7 2.961 1±0.065 7 8 h 0.349 4±0.000 9 0.784 2±0.001 5 4.057 9±0.032 7 12 h 0.465 8±0.005 7 1.005 1±0.177 9 6.138 7±0.006 3 F值 226.231 1 300.636 4 325.139 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

本研究觀察小檗堿對A431細胞株增殖、凋亡的影響，并檢測Bax/Bcl的表達變化情況，探討小檗堿對A431細胞增殖、凋亡變化的影響。MTT結(jié)果表明，與250 mg/L順鉑陽性對照組比較，不同濃度（12.5、25、50、100 mg/L）小檗堿對 A431 細胞的增殖均有明顯的抑制作用，且隨藥物濃度的增加、作用時間的延長，細胞抑制率明顯增加，呈時間-劑量依賴性。倒置顯微鏡觀察顯示，隨小檗堿濃度的增加，A431細胞生長受到抑制，細胞形態(tài)皺縮，細胞間連接松散，漂浮細胞增多。免疫熒光染色結(jié)果顯示，小檗堿作用后，藍染的A431活細胞數(shù)目明顯減少，表明小檗堿具有體外抑制A431細胞增殖及存活的作用。

圖2 免疫熒光染色觀察50 mg/L小檗堿作用后Bax蛋白在A431細胞中表達情況和活細胞密度（×200） 小檗堿作用組與空白對照組比較，活細胞數(shù)目減少，Bax分布于胞質(zhì)，表達增加

圖3 免疫熒光染色觀察50 mg/L小檗堿作用后Bcl-2蛋白在A431細胞中表達情況和活細胞密度（×200） 小檗堿作用組與空白對照組比較，活細胞數(shù)目減少，Bcl-2分布于胞質(zhì)，表達減弱

細胞凋亡是受多基因調(diào)控的細胞自然死亡過程［7-9］。在凋亡調(diào)控基因中，Bcl-2是目前發(fā)現(xiàn)與凋亡關(guān)系密切的原癌基因之一，Bcl-2家族包括Bax、Bcl-2、Bad、Bcl-xl等，Bcl-2 和 Bax 分別是 Bcl-2家族中最有代表性的凋亡抑制因子和凋亡促進因子［10］，Bcl-2 可阻斷 Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋出，使依賴于 Ca2+的核酸內(nèi)切酶活性降低，從而阻斷DNA消化和細胞凋亡［11-12］，Bcl-2蛋白還可以和Bax蛋白相結(jié)合，從而抑制細胞凋亡［13］。Bcl-2與Bax的比值決定了細胞接受凋亡信號后細胞的存活與否，如果Bax占優(yōu)勢，細胞死亡，反之則細胞存活。Bax/Bcl-2比值對決定細胞是否進入凋亡狀態(tài)具有重要意義。實時定量RT-PCR和免疫熒光染色結(jié)果均顯示，小檗堿作用A431細胞后，凋亡促進蛋白Bax表達上調(diào)，而凋亡抑制蛋白Bcl-2表達下降，Bax/Bcl-2比值隨小檗堿濃度的增加上調(diào)，提示小檗堿誘導A431細胞凋亡可能通過上調(diào)Bax/Bcl-2比值而實現(xiàn)。

綜上所述，小檗堿對皮膚鱗癌A431細胞生長具有明顯抑制作用，且呈時間-劑量依賴性，其機制可能與上調(diào)Bax蛋白、下調(diào)Bcl-2蛋白的表達誘導細胞凋亡有關(guān)。

［1］李波,朱維良,陳凱先.小檗堿及其衍生物的研究進展［J］.藥學學報,2008,43（8）:773-787.

［2］楊菁,林菁.小檗堿抗腫瘤作用機制的研究進展［J］.中國中藥雜志,2007,32（10）:881-883,934.

［3］Youns M,Hoheisel JD,Efferth T.Traditional Chinese medicines（TCMs）for molecular targeted therapies of tumours［J］.Curr Drug Discov Technol,2010,7（1）:37-45.

［4］Li-Weber M.Targeting apoptosis pathways in cancer by Chinese medicine［J］.Cancer Lett,2013,332（2）:304-312.

［5］Mokhber-Dezfuli N,Saeidnia S,Gohari AR,et al.Phytochemistry and pharmacology of berberis species［J］.Pharmacogn Rev,2014,8（15）:8-15.

［6］張娟.小檗堿抗腫瘤作用機制的研究進展［J］.醫(yī)學綜述,2014,20（4）:634-637.

［7］陳華,谷容,趙曉東,等.比較小檗堿對HEPG2蛋白質(zhì)組的抗腫瘤作用［J］.重慶醫(yī)學,2014,43（18）:2303-2304,2311.

［8］Gomez-Bougie P,Amiot M.Apoptotic machinery diversity in multiple myeloma molecular subtypes［J］.Front Immunol,2013,4:467.

［9］Chidambara Murthy KN,Jayaprakasha GK,Patil BS.The natural alkaloid berberine targets multiple pathways to induce cell death in cultured human colon cancer cells［J］.Eur J Pharmacol,2012,688（1-3）:14-21.

［10］Moldoveanu T,Follis AV,Kriwacki RW,et al.Many players in BCL-2 family affairs［J］.Trends BiochemSci,2014,39（3）:101-111.

［11］鄧亮,吳娣,洪一江,等.BCL-2家族的研究新進展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學,2012,40（7）:1936-1938,2073.

［12］金鑫,宋智琦,王雅坤,等.Bcl-2對皮膚鱗狀細胞癌細胞系SCL-1細胞Fas凋亡通路調(diào)控的研究［J］.中華皮膚科雜志,2007,40（7）:424-427.

［13］張燕捷.Bcl-2、Bax、Bax-Bcl-2異二聚體在胃癌中的表達及意義［J］.國外醫(yī)學（消化系疾病分冊）,2002,22（4）:219-221.

·學術(shù)動態(tài)·

奧馬珠單抗在H1抗組胺藥物治療下癥狀仍反復的慢性自發(fā)性/特發(fā)性蕁麻疹治療中的有效性和安全性：一項隨機、對照研究

Sarbjit等的一項名為ASTERIA I的隨機、雙盲、對照試驗，評價了奧馬珠單抗在難治性慢性自發(fā)性蕁麻疹治療中的有效性和安全性。入組319例患者，隨機均分成奧馬珠單抗75 mg、150 mg、300 mg治療組和安慰劑組，每4周給予皮下注射藥物1次，共治療24周，隨訪16周。主要評價指標為瘙癢嚴重程度積分（ISS7）及蕁麻疹活動度積分（UAS7）。結(jié)果表明，奧馬珠單抗在控制癥狀和疾病活動情況中有明顯療效，其中300 mg組最為明顯。據(jù)此，F(xiàn)DA和EMA批準了奧馬珠單抗用于治療慢性自發(fā)性蕁麻疹。［JID,2015,135（1）:67-75］

（第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院皮膚科 陳奇權(quán)摘譯）

銀屑病不是一種自身免疫性疾??？

本文對銀屑病是一種自身免疫性疾病的觀點提出了質(zhì)疑。自身免疫性疾病的發(fā)生是基于鏈球菌和角蛋白之間存在一些分子結(jié)構(gòu)類似的同源肽，對這些同源肽能做出反應的是外周血中CD8+T細胞，而不是CD4+T細胞，但銀屑病發(fā)生的主要始動因素是CD4+T細胞。近年來一些研究發(fā)現(xiàn)，在正常皮膚及銀屑病皮損的細菌微生物群中厚壁菌門及鏈球菌屬是最常見的。銀屑病的發(fā)病與固有免疫的激活有關(guān)，近年來有關(guān)銀屑病基因?qū)W的研究也證實了其易感基因與固有免疫系統(tǒng)相關(guān)。目前發(fā)現(xiàn)，克羅恩病、牙周炎和銀屑病之間有一定聯(lián)系，銀屑病患者和克羅恩病患者間存在一些相同的和固有免疫有關(guān)的基因突變。機體對腸道內(nèi)細菌的免疫不耐受導致了克羅恩病。這些發(fā)現(xiàn)都提示，銀屑病有可能是在特定遺傳背景下機體對皮膚中菌群的異常反應而促發(fā)的。［Exp Dermatol,2014,27.doi:10.1111/exd.12572.］

（成都市第二人民醫(yī)院皮膚科 張力文陳濤摘譯）

Effect of berberine on the proliferation and apoptosis of a human skin squamous cell carcinoma cell line A431

Zhang Juan,Zhao Pengwei,Yang Limin,Li Dongxia*.*Department of Dermatovenereology,Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical College,Hohhot 010050,China

Li Dongxia,Email:ldx828@sina.com

ObjectiveTo estimate the effect of berberine on the proliferation of and expressions of apoptosisrelated factors Bax and Bcl-2 in a human skin squamous cell carcinoma cell line A431.Methods A431 cells were culturedin vitro,and classified into various groups to be treated with berberine at different concentrations（12.5,25,5,100 mg/L）or cisplatin at 250 mg/L （positive control group）for different durations（12,24,48 and 72 hours）.The A431 cells remaining untreated served as the negative control group.Subsequently,methyl thiazolyl tetrazolium （MTT）assay was performed to evaluate cell growth,and inverted microscopy to observe cell morphology.Real time quantitative reverse transcription-PCR and an immunofluorescence assay were conducted to measure the mRNA and protein expressions of Bax and Bcl-2 respectively.Statistical analysis was done by multi-way analysis of variance（ANOVA）using the software SPSS 13.0.ResultsMTT assay showed that berberine inhibited the growth of A431 cells,and the inhibitory effect increased with the increase in concentration（F=1118.312,P＜0.001）and treatment duration（F=510.927,P＜0.001）of berberine.Moreover,there was a significant interaction between the concentration and treatment duration of berberine（F=70.239,P＜0.001）.Inverted microscopy revealed that when the concentration of berberine increased,cell density was reduced,and cell morphology changed from polygonal to round with cell body shrinkage.The ratio of bax to Bcl-2 mRNA was elevated with the increase in treatment duration and concentration of berberine,and there were significant differences in the mRNA ratio among cells treated with berberine for different time durations at same concentrations（F=226.231,1300.636,4325.139 for berberine at 25,50 and 100 mg/L respectively,allP ＜ 0.001）.Immunofluorescence staining indicated that the fluorescence intensity of Bax was enhanced,while that of Bcl-2 was weakened after berberine treatment.ConclusionsBerberine inhibits the growth of A431 cells in a dose-and timedependent manner,and may induce the apoptosis of A431 cells via regulating the expressions of Bax and Bcl-2.

Berberine;Carcinoma,squamous cell;Proto-oncogene proteins c-bcl-2;bcl-2-Associated X protein;Apoptosis;Cell proliferation;A431 cell

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.04.013

內(nèi)蒙古自然科學基金面上項目（2011MS1117）；內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生和計劃生育委員會醫(yī)療衛(wèi)生科研計劃項目（201302063）；2014年內(nèi)蒙古自治區(qū)科技計劃項目（kjt14sf16）

010050呼和浩特，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院皮膚性病科［張娟（現(xiàn)在玉溪市人民醫(yī)院，653199云南玉溪）、李東霞］；內(nèi)蒙古醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院微生物免疫教研室（趙鵬偉、楊麗敏）

李東霞，Email：ldx828@sina.com

2014-04-30）

（本文編輯：周良佳 顏艷）