孫銘苑，方懷盛，才學鵬

(中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，甘肅蘭州730046)

豬帶絳蟲(Taenia solium)是一種重要的人畜共患寄生蟲，豬囊尾蚴能夠引起豬和人的囊蟲病。鑒于豬帶絳蟲病不僅能對養(yǎng)殖業(yè)造成危害，引發(fā)巨大的經(jīng)濟損失，而且還會危害公共衛(wèi)生安全，加之分布廣泛，該病已經(jīng)被聯(lián)合國衛(wèi)生組織列為“需要根除的六大疾病”之一。迄今為止，針對豬帶絳蟲病或豬囊尾蚴病的藥物以及疫苗的使用仍存在許多問題。蛋白酶是在從病毒到脊椎動物都廣泛存在的一類酶，大分子蛋白質和低聚肽均可被其降解。同時，蛋白酶與寄生蟲的生長發(fā)育和其在宿主體內(nèi)的存活息息相關。根據(jù)蛋白酶的蛋白水解機制，可將蛋白酶分為半胱氨酸蛋白酶和蘇氨酸蛋白酶等8類。組織蛋白酶B是半胱氨酸蛋白酶家族的重要成員之一。大量試驗研究表明，組織蛋白酶B在寄生蟲攝取營養(yǎng)、生長發(fā)育、組織遷移、蛋白處理和活化以及免疫逃避等方面發(fā)揮重要作用，是預防及治療多種寄生蟲疾病的潛在靶標分子。筆者首次克隆了豬帶絳蟲組織蛋白酶B基因的開放閱讀框序列，將去掉信號肽的部分進行了原核表達，用重組蛋白免疫青紫藍灰兔，制備了高效價抗血清。

1 材料與方法

1.1 蟲體、試驗動物及主要試劑 豬帶絳蟲由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所寄生蟲研究室提供;Trizol Reagent購自Invitrogen公司;大腸桿菌DH5α感受態(tài)、BL21(DE3)感受態(tài)、Trans 2k DNA Marker，均購自北京全式金公司;pMD18-T克隆載體、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser和Primer STAR HS DNA Polymerase均購自TaKaRa(大連)有限公司;T4DNA連接酶購自NEB公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自Axygen公司;健康青紫藍灰兔，購于蘭州生物制品研究所有限責任公司;原核表達載體pET-30a購自Merck公司;限制性內(nèi)切酶EcoRI(HF)、NotⅠ購自NEB公司;聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，購自 Millipore公司;鎳NTA瓊脂糖凝膠FF購自GenScript公司;兔抗豬辣根過氧化物酶(HRP)酶標IgG、山羊抗兔辣根過氧化物酶(HRP)酶標IgG均購自Sigma公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 豬帶絳蟲總RNA的提取及cDNA合成。豬帶絳蟲總RNA的提取按照Trizol Reagent(Invitrogen)說明書進行操作，相關器皿經(jīng)高溫烘烤，試劑、耗材均使用無RNase產(chǎn)品。按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書要求進行操作，利用提取的RNA和隨機引物合成第一鏈cDNA，于-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 組織蛋白酶B基因的擴增。通過比對豬帶絳蟲數(shù)據(jù)庫和GeneDB，篩選到組織蛋白酶B的開放閱讀框序列，利用Primer 5.0軟件設計特異性引物:

TscpB-F:5＇-ATGTCTGCGATGAAGATGTC-3＇

TscpB-R:5＇-CTAGTTTTGCGGGAGACCG-3＇

以第一鏈cDNA為模板，進行PCR擴增，PCR反應程序如下:95 ℃ 4 min;98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 70 s，35個循環(huán);72℃10 min;4℃終止。使用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物與pMD18-T載體于16℃水浴中連接過夜。將連接產(chǎn)物轉化到DH5α。通過菌液PCR對轉化產(chǎn)物進行鑒定，將陽性克隆送至上海桑尼生物科技有限公司測序。

1.2.3 組織蛋白酶B基因序列分析。通過ProtParam在線軟件(http://web.expasy.org/protparam/)對蛋白質的基本理化性質進行分析。利用SignalP 4.1在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對蛋白質信號肽進行預測。通過PredictProtein在線軟件(https://www.predictprotein.org/)預測蛋白質的二級結構。利用MotifScan在線軟件(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)對糖基化位點以及翻譯后的修飾位點等進行預測;通過SMART在線軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)對結構域進行預測;使用BioEdit軟件的Kyte＆Doolittle方法計算蛋白質序列的疏水性分布。通過SWISS-MODEL在線軟件(http://swissmodel.expasy.org/)預測3D結構。

1.2.4 重組表達載體的構建。根據(jù)克隆到的TscpB序列及序列分析，在信號肽之后設計帶酶切位點的引物，送至上海生工生物技術有限公司合成。以測序正確的PCR產(chǎn)物為模板，用帶酶切位點的引物進行PCR擴增。

將純化后的PCR產(chǎn)物和表達載體pET-30a分別經(jīng)EcoRI和NotⅠ雙酶切后連接過夜。利用PCR和雙酶切對其進行鑒定，將陽性克隆送交上海桑尼生物技術有限公司測序。將測序正確的重組質粒命名為pET30a-TscpB。

1.2.5 豬帶絳蟲組織蛋白酶B的原核表達及表達形式鑒定。將含有重組質粒的菌液接于5 ml Kan濃度為100 mg/ml的LB培養(yǎng)液中，于37℃ 220 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)12 h。同時設置空載體和未誘導組作為對照。將培養(yǎng)12 h后的菌液再轉接至含5 ml Kan濃度為100 mg/ml的 LB培養(yǎng)液中，于37℃ 220 r/min條件下振蕩培養(yǎng)至吸光度OD600=0.6，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，于37℃條件下振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)6 h時分別從未誘導和誘導組中各取出1 ml菌液。12 000 r/min離心1 min后，收集菌體。將處理后的樣品進行SDS-PAGE電泳，確定表達后鑒定蛋白的表達形式。

1.2.6 蛋白純化及Western-blotting分析。按照確定的誘導條件大量(1 L)誘導表達，收集菌體。經(jīng)PBS反復洗滌、-70℃凍融3次處理后，按照Invitrogen公司的鎳瓊脂糖凝膠FF操作說明對樣品進行純化。將純化后的樣品進行SDS-PAGE電泳。電泳后進行電轉，用5%脫脂奶粉于4℃過夜封閉。用1∶200倍稀釋的豬囊尾蚴病陰性血清和陽性血清分別與PVDF膜于室溫下振蕩孵育1.5 h后，加入HRP標記的兔抗豬IgG(1∶20 000倍稀釋)，于室溫下振蕩孵育1 h后，加入DAB底物溶液顯色。

1.2.7 多克隆抗體的制備及免疫血清效價的測定。測定純化后的蛋白濃度，將蛋白于-20℃保存?zhèn)溆?。免疫前，在試驗兔耳緣靜脈采血并分離血清，于-20℃下保存，作為陰性對照。每3周免疫1次，共免疫4次，每只兔子的免疫劑量為200 μg/次。第1次免疫使用弗氏完全佐劑，蛋白與佐劑采用1∶1比例混合，使用乳化機將混合物乳化至穩(wěn)定的油包水型乳劑。在兔子背部及大腿實施皮下多點注射，免疫7 d后在耳緣靜脈采血，將分離的血清于-20℃下保存?zhèn)溆?此后的3次免疫都使用弗氏不完全佐劑。待抗體的滴度符合要求后頸動脈采血，將分離的血清于-20℃條件下保存?zhèn)溆?。采用間接ELISA方法對制備的免疫血清的效價進行測定，使用酶標儀讀取OD450nm值。

2 結果與分析

2.1 豬帶絳蟲總RNA的提取 經(jīng)核酸電泳檢測，提取的總RNA呈現(xiàn)28 S、18 S和5 S共3條條帶(圖1)。

2.2 豬帶絳蟲組織蛋白酶B基因的擴增 重新設計帶酶切位點的特異性引物，通過PCR擴增得到不含信號肽序列的組織蛋白酶B的基因片段(圖2)。測序結果表明，擴增的序列為1 025 bp，與GeneDB數(shù)據(jù)庫預測(http://www.genedb.org/)顯示的數(shù)據(jù)完全一致。

2.3 組織蛋白酶B基因的序列分析 序列分析表明，TscpB蛋白由20種氨基酸組成，其中Leu含量最多，Trp含量最少。TscpB蛋白的理論分子質量為39.71 ku，等電點為6.63，原子組成為C1757H2696N488O518S24。帶電荷的殘基共占20.8%，其中負電荷殘基占10.7%，正電荷殘基占10.1%。不穩(wěn)定系數(shù)為48.47，證明該蛋白質可能不穩(wěn)定。脂肪系數(shù)為71.32，總平均親水性為-0.384。通過對該蛋白二級結構的預測結果發(fā)現(xiàn)，TscpB二級結構中α-螺旋占27.5%，β-折疊占14.8%，無規(guī)則卷曲(L)占57.7%。對蛋白進行磷酸化位點分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有7個Tyr、4個Thr、8個Ser，為可能的蛋白激酶磷酸化位點。通過SignalP 4.1 Server分析發(fā)現(xiàn)，TscpB最可能的剪切位點在第23和24位氨基酸殘基之間，證明該蛋白可能存在信號肽。利用MotifScan對蛋白結構域進行分析，結果表明該蛋白有3個半胱氨酸蛋白酶活性位點，分別為半胱氨酸活性位點、組氨酸活性位點、天冬酰胺活性位點;2個N端糖基化位點;6個蛋白激酶C磷酸化位點;4個CK2蛋白激酶磷酸化位點;6個肉豆蔻?；稽c，具有組織蛋白酶B結構域。SMART分析表明，1～23位氨基酸構成該蛋白的信號肽序列，證明該蛋白可能是分泌型蛋白(圖3)。該蛋白3D結構的預測結果與二級結構分析相一致(圖4)。

2.4 重組表達質粒的鑒定 重組質粒經(jīng)過EcoRI和NotI雙酶切，產(chǎn)物出現(xiàn)預期大小的目的片段(圖5)。測序結果表明，已經(jīng)成功構建了重組表達質粒。

2.5 組織蛋白酶B的原核表達及蛋白純化 將重組質粒pET30a-TscpB轉化入感受態(tài)，經(jīng)誘導表達后進行SDSPAGE電泳，結果發(fā)現(xiàn)有大約38 ku的表達條帶，與預期結果相一致(圖6)。經(jīng)鑒定，該重組蛋白以包涵體的形式進行表達。

將所有重組蛋白過柱層析純化，經(jīng)SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)最終獲得了較高純度的重組蛋白(圖7)。定量檢測純化后的蛋白最終質量濃度為1 mg/ml。

2.6 rTscpB的Western blotting結果 從圖8可以看出，rTscpB與豬囊尾蚴病陽性血清反應，在38 ku左右處出現(xiàn)特異性條帶，而與陰性血清無反應，證明rTscpB具有抗原性。2.7 ELISA檢測結果 從圖9可以看出，4次免疫后兔子血清的抗體效價可達1∶2.04×105。

3 討論

在最早的生化試驗中，蠕蟲的提取物被發(fā)現(xiàn)具有木瓜蛋白酶的活性，且這種活性能夠被一些蛋白酶抑制劑特異性抑制。從20世紀80年代開始，隨著生物技術的發(fā)展和應用，這些蛋白酶中的某些成分被證明具有和哺乳動物組織蛋白酶B相似的活性［1］。在絳蟲中，多房棘球絳蟲的組織蛋白酶B基因的研究較多。研究表明，多房棘球絳蟲能夠分泌兩種組織蛋白酶B，主要定位于原頭蚴、可育囊和生發(fā)層［2］。在酸性環(huán)境下，該酶能夠發(fā)揮水解活性，降解BSA、IgG、纖連蛋白和膠原蛋白［3-6］。迄今為止，關于豬帶絳蟲組織蛋白酶B的研究報道非常少，僅有試驗表明豬帶絳蟲六鉤蚴時期ES抗原中含有組織蛋白酶B［7］。

大腸桿菌原核表達系統(tǒng)是目前被最廣泛使用的外源蛋白表達系統(tǒng)。作為一種常用的表達系統(tǒng)，大腸桿菌表達系統(tǒng)具有很多優(yōu)點，如工藝簡單、成本低廉、表達周期短及表達量高等。大腸桿菌表達系統(tǒng)的突出優(yōu)點是可以高水平地表達外源基因，其表達產(chǎn)量可以達到自身總蛋白的80%以上。

筆者擴增到豬帶絳蟲組織蛋白酶B的開放閱讀框，長度為1 074 bp，編碼357個氨基酸。利用生物信息學工具對其進行序列分析，結果表明豬帶絳蟲組織蛋白酶B的理論蛋白分子質量約為39.71 ku，其1～23位氨基酸構成該蛋白的信號肽序列，說明豬帶絳蟲組織蛋白酶B很可能是一種分泌型的蛋白。筆者采用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)對目的蛋白進行大量表達，成功獲得了大小約為38 ku的豬帶絳蟲組織蛋白酶B的重組蛋白，此目的蛋白以包涵體的形式存在。Western blotting結果表明，豬囊尾蚴病陽性血清可以與純化的重組蛋白發(fā)生特異性結合，而陰性血清不發(fā)生反應。這說明被豬囊尾蚴感染過的豬血清中存在組織蛋白酶B的抗體，同時也證實了該蛋白具有抗原性，可能具有潛在的免疫診斷價值。該試驗中高效價抗血清的制備為進一步探究該酶的生物學特性奠定了基礎。

［1］CAFFERY C R，RYAN M F.Characterisation of proteolytic activity of excretory-secretory products from adultStrongylus vulgaris［J］.Veterinary Parasitology，1994，52(3/4):285-296.

［2］SAKO Y，NAKAYA K，ITO A.Echinococcus multilocularis:Identification and functional characterization of cathepsin B-like peptidases from metacestode［J］.Experimental Parasitology，2011，127(3):693-701.

［3］GHONEMIN H，KLINKERT M Q.Biochemical properties of purified cathepsin B fromSchistosoma mansoni［J］.International Journal for Parasitology，1995，25(12):1515-1519.

［4］WILSON L R，GOOD R T，PANACCIO M，et al.Fasciola hepatica:Characterization and cloning of the major cathepsin B protease secreted by newly excysted juvenile liver fluke［J］.Experimental Parasitology，1998，88(2):85-94.

［5］LI A H，MOON S U，PARK Y K，et al.Identification and characterization of a cathepsin L-like cysteine protease fromTaenia soliummetacestode［J］.Veterinary Parasitology，2006，141(3/4):251-259.

［6］BECKHAM S A，PIEDRAFITA D，PHILLIPS C I，et al.A major cathepsin B protease from the liver flukeFasciola hepaticahas atypical active site features and a potential role in the digestive tract of newly excysted juvenile parasites［J］.The International Journal of Biochemistry ＆ Cell Biology，2009，41(7):1601-1612.

［7］ZIMIC M J，INFANTES J，LóPEZ C，et al.Comparison of the peptidase activity in the oncosphere excretory/secretory products ofTaenia soliumandTaenia saginata［J］.The Journal of Parasitology 2007，93(4):727-734.