沈科萍，李國林，畢　陽，張　忠（甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070）

孜然精油對雜擬谷盜的熏蒸效果及代謝酶活的影響

沈科萍，李國林，畢陽*，張忠*
（甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070）

本文研究了孜然精油對雜擬谷盜（Tribolium confusum）的熏蒸效果及部分機理。T.confusum經(jīng)最大劑量30 μL/L孜然精油處理24 h后，死亡率達到了95%，試蟲的死亡率與處理濃度和處理時間呈現(xiàn)出明顯的正相關。T.confusum經(jīng)孜然精油熏蒸處理后乙酰膽堿酯酶（AchE）在8 h出現(xiàn)最高值，解毒酶系中的酸性磷酸酯酶（ACP）呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢；堿性磷酸酯酶（ALP）、羧酸酯酶（CarE）活性明顯高于未熏蒸的對照，且這兩種酶活力均呈現(xiàn)出升高的趨勢；谷胱甘肽-S-轉移酶（GSTs）的酶活性被顯著（p≤0.05）地抑制；保護酶系中的三種酶活性也被精油的處理誘導升高。由此表明，孜然精油對T.confusum的良好熏蒸效果是通過影響試蟲體內(nèi)的神經(jīng)、解毒和保護酶系來實現(xiàn)的。

孜然精油，雜擬谷盜，熏蒸作用，酶活性

儲糧害蟲不僅造成糧食數(shù)量的減少，還降低了糧食的食用、加工、種用和工藝品質，縮短了倉房使用壽命。此外，還會傳播致病微生物，危害消費者的健康［1-2］。雖然采用人工合成的化學防護劑和熏蒸劑可有效控制儲糧害蟲，但因此所造成的“3R”（Residue、Resistance、Resurgence）問題也日趨明顯［3］，因此，亟需尋找新的、更加安全有效的控制方法［4］。采用植物源殺蟲劑可在一定程度上減輕儲糧害蟲的危害，且具有安全、廣譜等特點［5］。

從豬毛蒿（Artemisia scoparia）、桉樹葉（Eucalyptus globulus Labill）和茼蒿（Crassocephalum crepidioides）等多種植物中提取的精油及其活性成分均對儲糧害蟲表現(xiàn)不同程度的熏蒸、觸殺和驅避效果，植物精油及其活性成分對儲糧害蟲的熏蒸抑制機理涉及破壞害蟲的中樞神經(jīng)系統(tǒng)［6-7］、抑制代謝解毒酶系［8-9］以及降低抗氧化保護系統(tǒng)的功能［10］等方面［11］。孜然是重要的調味品，有報道孜然精油具有殺蟲活性，對雜擬谷盜（T.confusum）和地中海粉斑螟（Ephestiakueh niella）等均具有熏蒸殺卵活性，但孜然精油對雜擬谷盜的熏蒸活性的抑制機理尚未見報道。

本研究的目的在于測定孜然精油對T.confusum的熏蒸效果，以乙酰膽堿酯酶（AchE）為指標，研究孜然精油的神經(jīng)毒性，以酸性磷酸酯酶（ACP）、堿性磷酸酯酶（ALP）、羧酸酯酶（CarE）和谷胱甘肽-S-轉移酶（GSTs）為指標，研究孜然精油對T.confusum解毒酶系的影響。此外，以超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）為指標，研究孜然精油對T.confusum抗氧化酶系的影響，以期為開發(fā)孜然精油類防蟲劑提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

孜然（Cuminum cyminum L.）品種敦玉一號，生長于新疆吐魯番市，由敦煌種業(yè)有限公司提供；試蟲雜擬谷盜（T.confusum），由華中農(nóng)業(yè)大學城市有害生物防治研究所提供；5，5’-二硫-二硝基苯甲酸（DTNB）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氮藍四唑（NBT）、聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、對三硝基苯（TNB）、丙酮、牛血清蛋白等均為分析純，上海振企化學試劑有限公司。

SW-CJ-2FD型超凈工作臺蘇州安泰空氣技術有限公司；DHG-9245A型電熱鼓風箱、DHP-9162型恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司；YX280B型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋上海三申醫(yī)療器械有限公司；XH-B微型旋渦混合器江蘇康健醫(yī)療器械有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1精油的提取參照李大強等的水蒸氣蒸餾方法［12］。將孜然用小型電動粉碎機粉碎過40目篩，各稱取粉碎后物料160 g，加入1600 mL蒸餾水浸泡12 h后進行蒸餾（90℃），蒸餾時間為2～3 h，餾出液用冷凝水冷凝收集，然后用無水乙醚（1∶1）萃取，萃取液以無水硫酸鈉干燥后用旋轉蒸發(fā)儀除去溶劑獲得精油，在4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2試蟲的飼養(yǎng)試蟲采用麥麩：面粉為7∶3的混勻比例飼養(yǎng)。飼料使用前均在80℃溫度下消毒2 h，含水量調至13%±1%，然后分裝于罐頭瓶中。接入成蟲后，置于（27±1）℃、相對濕度75%±5%的黑暗人工氣候箱中飼養(yǎng)，7～10 d后篩去成蟲，待下一代成蟲大量出現(xiàn)后1～2周，篩出成蟲供試。在測定過程中，以針觸及成蟲尾部、觸角及足不動視為死亡。

1.2.3不同濃度孜然精油對T.confusum的熏蒸實驗采用呂建華等的方法［7］并略加修改，先將濾紙剪成10 cm×1 cm的濾紙條，取250 mL的容量瓶，每瓶中接入20只試蟲，根據(jù)預實驗結果設置處理劑量梯度為2.50、5.00、10.00、20.00、30.00 μL/L。用微量進樣器將相應量的孜然精油滴加到濾紙條的中部（對照組不滴加精油），粘在試劑瓶瓶口，將瓶蓋擰緊密封，避免試蟲出瓶。每個處理設3次重復，將容量瓶移入與飼養(yǎng)條件相同的培養(yǎng)箱中，分別在處理后2、4、8、12和24 h觀察死亡的試蟲數(shù)，觀察時先將瓶蓋打開散氣10 min后再進行，并按照以下公式計算死亡率和校正死亡率及半致死劑量（LC50）。

1.2.4試蟲的處理選取成蟲數(shù)只，采用孜然精油LC50濃度（2.065 μl/L）進行熏蒸，分別在處理后2、4、8、12和24 h取出試蟲，用錫箔紙包好后倒入液氮速凍，樣品保存于-80℃超低溫冰箱內(nèi)冷凍待測。以不加精油處理作對照，用于AchE、ACP、ALP、CarE、GSTs、SOD、POD、CAT酶活的測定。每處理用蟲30只，重復3次。

粗酶液的提?。喝?.2.4處理后的試蟲30只，加入在4℃預冷的0.1 mol/L、pH8.0的PBS緩沖液3 mL，在冰浴條件下研磨成漿，研缽、研錘用相同磷酸緩沖液洗滌兩次，將勻漿液移至10 mL離心管內(nèi)，在4℃、12000 r/min下離心20 min，取上清液保存于-20℃冰箱內(nèi)備用待測。

1.2.5酶活力的測定

1.2.5.1AchE活性的測定參照Gorun等和王光峰等的方法并修改［13-14］，在試管中按順序依次加入0.1 mol/L pH8.0的PBS緩沖液0.25 mL、0.075 mol/L的碘化硫代乙酰膽堿（Asch）0.05 mL、0.1 mL的酶液，對照管以0.1 mol/L pH8.0的PBS緩沖液代替酶液，加好后振蕩混勻，25℃下水浴保溫反應20 min后，加入3.6 mL DTNB-乙醇-磷酸緩沖液終止反應并顯色，用對照管作參比調零，412 nm處測定各管的吸光度（A），重復測定3次。以每分鐘吸光度變化0.01個單位為一個酶活力單位。

1.2.5.2ACP活性的測定參照Bessey等［15］的方法并略加修改，在試管中按順序依次加入0.2 mol/L pH4.6的醋酸緩沖液2.15 mL、0.0075 mol/L的對硝基磷酸二鈉溶液0.45 mL、粗酶液0.1 mL，對照管以0.2 mol/L pH4.6的醋酸緩沖液代替酶液，加好后振蕩混勻。將各試管在37℃水浴中保溫振蕩30 min后，加入1.8 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液終止反應。在400 nm處測定各管吸光度，以對硝基酚為底物做標準曲線。以對照管做參比調零，重復測定3次。按OD值在標準曲線上求出對硝基酚的量，按下式計算出ACP的比活力（μmol/mg·min）。

ACP比活力=對硝基酚/（蛋白質含量×30min）

1.2.5.3ALP活性的測定用0.04 mol/L pH9.6的巴比妥鈉-鹽酸緩沖溶液代替0.2 mol/L pH4.6的醋酸緩沖液，其他方法同1.2.5.2 ACP活性的測定。

1.2.5.4CarE活性的測定參照Asperen等［16］方法并略加修改，在試管中按順序依次加入含有1×10-7mol/L毒扁豆堿的0.1 mol/L、pH7.8的PBS 3.49 mL，4×10-4mol/L的α-乙酸萘酯溶液0.5 mL、粗酶液0.01 mL，對照管以含1×10-7mol/L毒扁豆堿的0.1 mol/L、pH7.8的PBS代替酶液，加好后混合均勻。將各試管在37℃水浴中保溫振蕩30 min后，加入0.5 mL顯色液（1%堅固藍B∶5%SDS=2∶5，體積比），再在室溫下放置10 min后，在600 nm處測定各管吸光度，以α-萘酚為底物做標準曲線。以對照管作參比調零，重復測定3次。根據(jù)制作的標準曲線和酶原蛋白含量的測定結果，將OD值換算成比活力（μmol/mg·min）。

1.2.5.5GSTs活性的測定參照Clark等［17］的方法并修改，在試管中依次加入含2×10-3mol/L EDTA的0.1 mol/L、pH6.5的PBS 2.5mL，50 mmol/L GSH 0.1 mL，50 mmol/L CDNB 0.1 mL，粗酶液0.3 mL，對照管以含有2×10-3mol/L的EDTA，0.1 mol/L PBS（pH6.5）代替酶液，加好后混合均勻，以對照管作參比調零，立即在340 nm處測定各管的吸光度值，重復測定3次。

1.2.5.6SOD活性的測定參照程偉霞等［18］的方法并略加修改，在試管中依次加入0.1 mol/L PBS 1.5 mL、0.13 mol/L甲硫氨酸（MET）溶液0.3 mL、750 μmol/L氮藍四唑（NBT）溶液0.3 mL、100 μmol/L乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）溶液0.3 mL、粗酶液0.4 mL，最后加入20 μmol/L核黃素0.3 mL，另取兩支試管分別加入上述試劑，以pH7.5 0.1 mol/L的磷酸緩沖液代替粗酶液，混勻后將1支試管放于暗處，其他各試管放于4000 LUX光照條件下反應15 min，要求各管照光情況均勻一致，溫度在（30±1）℃。待反應結束后，以暗處放置試管作空白對照調零，于560 nm處測定其他各管的吸光度值（A）。重復測定3次。SOD活性以每毫克蛋白抑制氮藍四唑（NBT）光化還原的50%為酶活性單位（U/mg蛋白）表示。

其中：A0—照光對照管；AX—樣品管；P—蛋白含量。

1.2.5.7CAT活性的測定參照Clairbone等［19］的方法并修改，在各試管中按順序依次加入20 mmol/L H2O2（用50 mmol/L、pH7.5的PBS緩沖液配制），200 μL粗酶液。以蒸餾水作參比，加入粗酶液30 μL后立即開始記錄反應體系在240 nm處的吸光度（A），連續(xù)測定2 min，重復測定3次。以每分鐘吸光度值變化0.01為1個CAT活力單位（U），以U/mg蛋白表示其活性。

1.2.5.8POD活性的測定參照Simon等［20］的方法并修改，在各試管中按順序依次加入2.0 mL 0.2 mol/L PBS（pH6.0）緩沖液，0.12 mol/L愈創(chuàng)木酚2.0 mL，0.1 mol/L H2O2（用0.2 mol/L pH6.0 PBS緩沖液配制），粗酶液0.2 mL?；旌暇鶆蚝笤?5℃水浴中反應10 min，以蒸餾水作參比，在470 nm處測定反應體系的吸光度（A），重復測定3次。以每分鐘吸光度值變化0.01為1個POD活力單位（U），以U/mg蛋白表示其活性。

1.3蛋白含量的測定

參照Bradford［21］方法，以牛血清蛋白為標準蛋白制作標準曲線，計算蛋白含量。

1.4數(shù)據(jù)處理

全部實驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010和SPSS 18.0（SPSS Inc.，USA）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行分析，計算毒力回歸方程和LC50等參數(shù)，用Duncan’s法進行多重顯著性分析和標準偏差（±SD）計算。

圖1　孜然精油熏蒸對T.confusum成蟲AchE活性的影響Fig.1　Effect of C.cyminum essential oil on the AchE activities in T.confusum

表1　不同濃度孜然精油對T.confusum的熏蒸效果（平均數(shù)±標準偏差）Table 1　Fumigant toxicity of essential oil from C.cyminum against T.confusum（x±SD）

2　結果與分析

2.1不同濃度孜然精油對T.confusum的熏蒸效果

孜然精油對T.confusum成蟲具有良好的熏蒸效果，由表1可知，熏蒸效果隨著處理濃度的增加而明顯增強。在較低濃度下也表現(xiàn)出了不同的熏蒸效果，2.50 μL/L孜然精油熏蒸2 h后，成蟲的校正死亡率僅為6.67%，處理24 h后可達56.67%，為2 h熏蒸處理的8.6倍；當濃度升至30.00 μL/L時，2 h后校正死亡率為50.00%，24 h后達到95%，為2 h的1.9倍。

對T.confusum害蟲熏蒸24 h結果做probit回歸分析求得熏蒸毒力方程為y=-0.395+1.254x，計算得到T.confusum害蟲的LC50為2.065 μL/L。由此可見，T.confusum對孜然精油的熏蒸較敏感。該結果與Rajendran和Purohit等在二斑葉螨上（Tetranychus urticae）的研究結果相似［22-23］。

2.2孜然精油熏蒸對T.confusum的AchE影響

AchE是昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)的關鍵酶，通過調控水解神經(jīng)遞質——乙酰膽堿來實現(xiàn)正常的神經(jīng)傳遞［24］，隨著乙酰膽堿分解的加速，試蟲反應速度變慢，表現(xiàn)出一種自身的應激反應［25］。由圖1可知，處理組AchE活性在2 h時最低，8 h達到最大；對照組酶活呈先降低后升高的趨勢；處理組除在2、4 h時低于對照組外，8、12、24 h均分別高為同期對照1.47、1.16和1.32倍。本研究結果表明LC50孜然精油處理可有效誘導試蟲體內(nèi)的AchE活性。有研究表明，低劑量的殺蟲劑可以誘導試蟲體內(nèi)AchE的活性，但高劑量可能抑制其活性，導致試蟲因過度興奮而死亡［26］。

2.3孜然精油熏蒸對T.confusum成蟲解毒酶系的影響

CarE、ACP、ALP和GSTs是昆蟲體內(nèi)的重要解毒酶系，可分解環(huán)境中的有毒因子，ACP和ALP酶活性的提高可提高試蟲對殺蟲劑的耐受性［27-29］。有研究發(fā)現(xiàn)，ACP活性的改變會影響B(tài).germanica對殺蟲劑的敏感性，導致抗藥性的產(chǎn)生［30-31］。

2.3.1孜然精油熏蒸對T.confusum成蟲ACP酶活的影響由圖2可知，對照組ACP活性呈先升高后下降的趨勢，12 h時達到最大；而處理組的酶活性先下降，在8 h時最低，24 h時活性最大，為同期對照組的1.4倍。結果表明LC50孜然精油處理可以有效誘導試蟲體內(nèi)的ACP活性。

圖2　孜然精油熏蒸對T.confusum成蟲ACP活性的影響Fig.2　Effect of C.cyminum essential oil on the ACP activities in T.confusum

2.3.2孜然精油熏蒸對T.confusum成蟲ALP酶活的影響由圖3可知，LC50孜然精油處理后ALP的酶活性隨著處理時間的延長而增加。對照組酶活性呈先下降后升高的趨勢，在8 h處最低，處理組為對照組的1.52倍。2 h時處理組活性低于對照組，隨著時間的延長，處理組的酶活顯著（p≤0.05）高于對照組，分別是同期對照組的1.07、1.52、1.20和1.22倍。

圖3　孜然精油熏蒸對T.confusum成蟲ALP活性的影響Fig.3　Effect of C.cyminum essential oil on the ALP activities in T.confusum

孜然精油處理后試蟲體內(nèi)ACP和ALP活性的變化說明當試蟲接觸到低濃度的精油時，先對酶活性產(chǎn)生了抑制作用，之后激發(fā)了體內(nèi)防御性應激反應，使酶活性升高。

2.3.3孜然精油熏蒸對T.confusum成蟲CarE酶活的影響由圖4可知，處理組酶活在2 h最低，隨著時間的延長，活性逐漸升高，在24 h到達最大值。處理組酶活性均隨著時間的延長而呈現(xiàn)出緩慢增長的趨勢，除24 h時處理組的酶活顯著（p≤0.05）高于對照組（為對照組的1.11倍）外，其他時間點處理組酶活均低于同期對照組，與尚利娜等［32］用黃花蒿精油處理玉米象的結果相似。結果表明孜然精油明顯誘導了CarE的活性，其可以提高試蟲的CarE活性。

圖4　孜然精油熏蒸對T.confusum成蟲CarE活性的影響Fig.4　Effect of C.cyminum essential oil on the CarE activities in T.confusum

2.3.4孜然精油熏蒸對T.confusum成蟲GSTs酶活的影響圖5表明處理組和對照組的酶活力均呈先下降后上升的趨勢，處理組的酶活性始終顯著（p≤0.05）低于對照組，兩組處理均在4 h時，活性降到最低，之后上升，在24 h處到達最大值。12 h時，處理組與對照組的差異達到最大，處理比對照低0.4個活性單位，為對照組的85%。結果表明經(jīng)孜然精油處理后試蟲體內(nèi)的GSTs活性被顯著抑制。該結果與程偉霞等［18］發(fā)現(xiàn)的敵敵畏和對氧磷對虱的抑制結果相似。由此推斷，GSTs可能是孜然精油殺蟲作用的主要作用位點。

圖5　孜然精油熏蒸對T.confusum成蟲GSTs活性的影響Fig.5　Effect of C.cyminum essential oil on the GSTs activities in T.confusum

2.4孜然精油熏蒸對T.confusum保護酶系的影響

SOD、CAT和POD被認為是昆蟲體內(nèi)的保護酶系，與昆蟲的正常生長與死亡有著密切的關系，在動物和植物體內(nèi)都存在著各種各樣的自由基，其中主要有過氧化氫、超氧陰離子、羥自由基，它們會對昆蟲的細胞產(chǎn)生毒害，SOD、CAT和POD可以消除自由基在體內(nèi)的存留時間，減少對機體產(chǎn)生傷害。其中SOD可以催化降解超氧陰離子自由基生成過氧化氫，過氧化氫又可以被CAT和POD催化降解，從而起到保護機體的作用［33］。

2.4.1孜然精油熏蒸對T.confusum成蟲SOD酶活的影響由圖6可知處理組酶活性的變化呈先下降后上升的趨勢，在4 h處，酶活性達到最低；4 h后處理組試蟲的SOD活性明顯升高，在24 h處達到最大值，較4 h時提高了64%，較同期對照組提高了22%。所以，孜然精油可以有效誘導試蟲的SOD活性。

圖6　孜然精油熏蒸對T.confusum成蟲SOD活性的影響Fig.6　Effect of C.cyminum essential oil on the SOD activities in T.confusum

2.4.2孜然精油熏蒸對T.confusum成蟲CAT酶活的影響由圖7知，處理和對照組試蟲的CAT活性變化基本一致，均呈先下降后上升的趨勢。2 h時處理組為對照組的0.91倍；在4、24 h時，處理組活性均高于對照組，分別是對照組的1.05和1.07倍。表明孜然精油可以提高試蟲的CAT活性。

圖7　孜然精油熏蒸對T.confusum成蟲CAT活性的影響Fig.7　Effect of C.cyminum essential oil on the CAT activities in T.confusum

2.4.3孜然精油熏蒸對T.confusum成蟲POD酶活的影響由圖8得，處理和對照組均呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢，對照組最低點出現(xiàn)在8 h，而處理組的最低點在12 h；除在12 h處，處理組酶活性都顯著（p≤0.05）大于對照組，分別比同期對照組高17.6%、47.8%、65%和41.4%。所以，孜然精油可以增強試蟲的POD活性。

圖8　孜然精油熏蒸對T.confusum成蟲POD活性的影響Fig.8　Effect of C.cyminum essential oil on the POD activities in T.confusum

本研究發(fā)現(xiàn)，孜然精油處理后試蟲體內(nèi)的CAT和SOD活性均被誘導升高，這可能與昆蟲對外界防御機制有關。Brattsten等［34］提出，昆蟲體內(nèi)的酶合成受外界和自身條件的調控，當試蟲接觸精油時，會產(chǎn)生應激反應從而加快代謝外源的有毒物質。李周直等［33］研究發(fā)現(xiàn)昆蟲體內(nèi)保護酶活性的大小與昆蟲的抗藥性有關，因此對保護酶系的研究有助于更深入的了解昆蟲抗病性的產(chǎn)生機理并且預防這種不利方面帶來的影響，維持殺蟲劑對昆蟲的毒殺作用。

3　結論

孜然精油對T.confusum具有良好的熏蒸作用，對T.confusum體內(nèi)的多種酶活性均有影響，對AchE、解毒代謝酶系（如ACP、ALP、CarE）和保護酶系（如SOD、CAT、POD）有誘導激活的作用，在部分處理時間內(nèi)處理組酶活性高于對照組，這可能是昆蟲自身的一種防御應激反應，GSTs可能是孜然精油對T. confusum發(fā)揮作用的靶點之一。前期的研究表明，孜然精油的主要成分為枯茗醛和α-蒎烯其可能參與了孜然精油的抗蟲作用［35-36］，但精油的組成復雜，尋找并分離精油中高效活性成分也成為有效防治儲糧害蟲的新思路和新方法，孜然精油的抗蟲機理還有待進一步研究。

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Control with essential oils of cumin（Cuminum cyminum）against Tribolium confusum and influence of metabolic enzyme activity

SHEN Ke-ping，LI Guo-lin，BI Yang*，ZHANG Zhong*
（College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

The study was used the methods of fumigant to measure the effects of physiological and biochemical index of T.confusum.The motality of T.confusum was 95%after 24 h of treatment at 30 μL/L cumin essential oil.The motality rate showed positive correlation with concentration and treatment time.Through T.confusum fumigant by the essential oil of cumin，the result showed that the activity of AchE was appeared highest at 8 h，detoxification enzymes ACP presented variation trend，increased at first and then decreased.ALP and CarE activity were significantly higher than the control fumigation and vitality of these two enzymes were shown a rising trend.The activity of GST was significant inhibited（p≤0.05）during the treatment.In conclusion，the essential oil of cumin possessed activity of repellency and fumigation，and contact toxicity against T.confusum. The insectieidal mechanism mainly involved the activities of many impotant enzymes.

Cuminum cyminum L.essential oil；T.confusum；fumigant；enzymatic activity

TS201.1

A

1002-0306（2015）18-0320-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.056

2015－01－22

沈科萍（1987-），女，碩士，研究方向：采后生物學與技術，E-mail：15002585408@163.com。

畢陽（1962-），男，博士，教授，研究方向：采后生物學與技術，E-mail：biyang@gsau.edu.cn。張忠（1977-），男，博士，副教授，研究方向：天然抗菌活性物質，E-mail：zhangzhong@gsau.edu.cn。

國家自然科學基金（31360416）；甘肅省自然科學基金（1308RJZA162）。