李　斌，武曉雪，孟瑤瑤，王麗波（南陽(yáng)理工學(xué)院，生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南南陽(yáng)473004）

信陽(yáng)毛尖茶色素的超聲提取及其抗氧化活性

李斌，武曉雪，孟瑤瑤，王麗波
（南陽(yáng)理工學(xué)院，生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南南陽(yáng)473004）

目的：優(yōu)化信陽(yáng)毛尖茶色素的超聲提取工藝及研究其抗氧化活性。方法：在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用正交實(shí)驗(yàn)法，考察了料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)得率的影響；通過(guò)二苯基苦基苯肼（DPPH）自由基、超氧自由基以及羥自由基的清除實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)信陽(yáng)毛尖茶色素的抗氧化活性。結(jié)果：所考察因素中，對(duì)信陽(yáng)毛尖茶色素得率的影響程度是料液比＞提取次數(shù)＞超聲溫度＞超聲時(shí)間。超聲提取的最佳條件是料液比1∶30、超聲溫度80℃、超聲時(shí)間120 min、提取次數(shù)3次，該條件下茶色素得率達(dá)到了33.1%。信陽(yáng)毛尖茶色素具有清除體外自由基的活性，其活性在一定濃度范圍內(nèi)隨著濃度的增大而增強(qiáng)，對(duì)羥基自由基清除活性尤為明顯。結(jié)論：采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取條件，明顯提高了信陽(yáng)毛尖茶色素的得率；信陽(yáng)毛尖茶色素具有良好的抗氧化作用，可作為天然抗氧化劑進(jìn)一步開發(fā)和利用。

信陽(yáng)毛尖，茶色素，提取，抗氧化活性

色素是現(xiàn)代食品工業(yè)中不可缺少的食品添加劑之一。人工合成的食用色素化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，色澤鮮艷，著色力強(qiáng)，價(jià)格低廉，被廣泛應(yīng)用在食品行業(yè)中。但是它們本身沒有任何營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，有的具有慢性毒性，甚至有致癌性，所以人們開始尋找新的天然色素資源［1］。茶葉作為我國(guó)消費(fèi)的主流健康飲料，開始受到世界各國(guó)人們的青睞?，F(xiàn)代科學(xué)研究揭示，茶葉中含有豐富的生物活性物質(zhì)，它們具有抗氧化［2-3］、清除自由基［4］、抗突變［5］、抗骨質(zhì)疏松［6］、抗衰老［7-8］、抗癌［5］、抗心血管疾?。?-10］等藥理功效。因此，開展茶葉深加工成為世界茶葉加工的趨勢(shì)所在。我國(guó)盛產(chǎn)茶葉，每年從茶園到加工成茶葉產(chǎn)品的一系列生產(chǎn)環(huán)節(jié)中產(chǎn)生的茶葉副產(chǎn)品數(shù)量相當(dāng)大，將這些副產(chǎn)品及低檔茶用于茶葉功能成分的提取，不僅可以合理開發(fā)利用自然資源，提高茶葉本身的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，還可以獲得一系列茶色素，拓寬色素市場(chǎng)，滿足人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的對(duì)天然色素的需求。

信陽(yáng)毛尖屬未發(fā)酵的綠茶，產(chǎn)于河南省信陽(yáng)市的8個(gè)縣、區(qū)，是我國(guó)十大名茶之一。其品質(zhì)優(yōu)異，外形條索細(xì)、圓、緊、直，色澤翠綠，內(nèi)質(zhì)湯色碧綠明亮，香氣高鮮，滋味鮮濃、爽口，葉底嫩綠且勻整［11］。目前，人們對(duì)于信陽(yáng)毛尖茶多酚［12］、茶多糖［13］、咖啡因［14］等的提取工藝研究都已有報(bào)道，但是還未見有人從事茶色素方面的研究。本實(shí)驗(yàn)對(duì)信陽(yáng)毛尖茶色素提取進(jìn)行了單因素分析，并進(jìn)一步對(duì)提取條件進(jìn)行了正交優(yōu)化，同時(shí)研究了信陽(yáng)毛尖茶色素的抗氧化作用，旨在為深入研究信陽(yáng)毛尖茶色素提供一定參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

信陽(yáng)毛尖信陽(yáng)市浉河區(qū)天潭茶葉有限公司；二苯基苦基苯肼（DPPH）、還原性輔酶I（NADH）、氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）、吩嗪硫酸甲酯（PMS）、抗壞血酸（VC） 美國(guó)Sigma公司；95%乙醇、1，10-菲咯啉、過(guò)氧化氫（H2O2）天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；氯仿天津市華東試劑廠；NaOH天津市化學(xué)試劑六廠三分廠；HCl開封開化有限公司試劑廠，以上試劑均為分析純。

U-1800紫外-可見分光光度計(jì)日本Hitachi公司；UP3200H超聲波清洗器熊貓集團(tuán)南京電子計(jì)量有限公司；JA1003型電子天平上海良平器儀器表有限公司；101-2A型電熱鼓風(fēng)干燥箱天津市泰斯特儀器有限公司；85-1型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；RE-2010型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀鞏義市華予華儀器有限公司；PHS-3C型數(shù)顯pH計(jì)上海雷磁儀器廠；XH-KG66型水平恒溫振蕩器廣東佛山市航星自動(dòng)化設(shè)備有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1工藝流程本工藝流程參考陳麗如等［15］提出的方法。將茶葉用研缽研磨粉碎，過(guò)40目篩，備用。稱取一定量茶葉粉末裝于250 mL錐形瓶中，按照一定的料液比加入蒸餾水，在一定溫度下超聲提取，提取完畢后將提取物于5000 r/min離心20 min，取上清液得到茶色素粗溶液。將濾液在50℃減壓濃縮至15 mL，加入45 mL 95%乙醇沉淀除去多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，并用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)溶液pH為3.2，靜置30 min，5000 r/min離心20 min，取上清液抽濾得濾液。將濾液加入200 g/L NaOH調(diào)節(jié)pH為7.5，抽濾得濾液。將濾液50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，60℃真空干燥。所得結(jié)晶用氯仿萃取除去生物堿和葉綠素，60℃真空，得精制的茶色素。

1.2.2單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1料液比對(duì)茶色素得率的影響茶色素提取溫度60℃下振蕩60 min，以1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（mL/g）料液比對(duì)茶色素得率做單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.2超聲時(shí)間對(duì)茶色素得率的影響茶色素提取的料液比為1∶30，溫度60℃，以30、60、90、120、150 min超聲時(shí)間對(duì)茶色素得率做單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.3超聲溫度對(duì)茶色素得率的影響固定茶色素提取的料液比為1∶30，超聲60 min，以超聲溫度30、45、60、75、90、105、120℃對(duì)茶色素得率做單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.4提取次數(shù)對(duì)茶色素得率的影響茶色素提取的料液比為1∶30，溫度60℃，超聲60 min，按照工藝流程分別提取1、2、3次。

1.2.3正交實(shí)驗(yàn)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以影響茶色素得率的料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間和提取次數(shù)為因素，各取3個(gè)水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。采用L9（34）正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)（正交實(shí)驗(yàn)的因素和水平見表1），并以茶色素得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，計(jì)算得到最優(yōu)工藝條件，并在該條件下重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

表1　正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平表Table 1　The factors and levels of orthogonal test

1.2.4DPPH自由基清除活性的測(cè)定DPPH清除活性的測(cè)定參照Duan等［16］的方法并稍做修改。取100 μL不同濃度的信陽(yáng)毛尖茶色素（20～100 μg/mL），加入2900 μL的120 μmol/L DPPH溶液，混合物在避光條件下37℃反應(yīng)30 min后，分光光度計(jì)測(cè)定517 nm處的吸光度值；同時(shí)，使用VC作為陽(yáng)性對(duì)照按上述方法測(cè)定DPPH清除活性。DPPH的清除活性主要采用下面的公式進(jìn)行計(jì)算：

其中，Ablank是對(duì)照實(shí)驗(yàn)的吸光度值（即以水代替樣品），Asample是樣品實(shí)驗(yàn)的吸光度值。

1.2.5超氧自由基清除活性的測(cè)定超氧自由基清除活性的測(cè)定參照Liu等［17］的方法并稍做修改。取1 mL不同濃度的信陽(yáng)毛尖茶色素（20～100 μg/mL），先后加入由0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH7.4）配制的156 μmol/L的NADH，52 μmol/L的NBT和20 μmol/L的PMS溶液各1 mL，混合物在25℃反應(yīng)5 min后，分光光度計(jì)測(cè)定560 nm處的吸光度值；同時(shí)，使用VC作為陽(yáng)性對(duì)照按上述方法測(cè)定超氧自由基清除活性。超氧自由基的清除活性主要采用下面的公式進(jìn)行計(jì)算：

其中，Ablank是對(duì)照實(shí)驗(yàn)的吸光度值（即以水代替樣品），Asample是樣品實(shí)驗(yàn)的吸光度值。

1.2.6羥基自由基清除活性的測(cè)定羥基自由基清除活性的測(cè)定參照J(rèn)in等［18］的方法并稍做修改。取1 mL不同濃度的信陽(yáng)毛尖茶色素（20～100 μg/mL），先后加入1 mL的1，10-菲咯啉、1.5 mL的0.15 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH7.4）、1 mL的0.75 mmol/L的FeSO4和1 mL的H2O2溶液（0.01%，v/v），混合物在37℃反應(yīng)30 min后，分光光度計(jì)測(cè)定536 nm處的吸光度值；同時(shí)，使用VC作為陽(yáng)性對(duì)照按上述方法測(cè)定羥基自由基清除活性。羥基自由基的清除活性主要采用下面的公式進(jìn)行計(jì)算：

其中，Ablank是對(duì)照實(shí)驗(yàn)的吸光度值（即以水代替樣品），Asample是樣品實(shí)驗(yàn)的吸光度值，A0是以水替代反應(yīng)體系中的H2O2和樣品的吸光度值。

1.2.7數(shù)據(jù)分析所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以±SD表示，數(shù)據(jù)分析采用SAS 9.2軟件。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1料液比對(duì)茶色素得率的影響料液比是影響茶色素得率的重要因素之一，料液比對(duì)茶色素得率的影響如圖1所示。由圖1可以看出，隨著溶液量的增加，茶色素的得率先增大后減少，當(dāng)料液比為1∶40時(shí)達(dá)到最大值。這是由于茶葉需要吸收較多的水分才能充分溶脹，從而有利于色素的溶出；當(dāng)料液比達(dá)到1∶40時(shí)，色素充分溶出，但是繼續(xù)增加溶液量后，其他成分過(guò)多溶出反而不利于色素的提取?？紤]到降低后續(xù)工序濃縮的能耗以及提高效率，料液比應(yīng)該控制在1∶40以內(nèi)。

圖1　不同料液比對(duì)茶色素得率的影響Fig.1　Effect of liquid-to-material ratio on extraction rate of Xinyang Maojian tea pigment

2.1.2超聲時(shí)間對(duì)茶色素得率的影響由圖2可知，超聲時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)提高信陽(yáng)毛尖茶色素的得率有一定的影響，在30～90min之間，得率呈上升趨勢(shì)，而在90～150min之間得率趨于平衡。因此，提取時(shí)間宜控制在90～150min內(nèi)。

圖2　不同超聲時(shí)間對(duì)茶色素得率的影響Fig.2　Effect of ultrasonic time on extraction rate of Xinyang Maojian tea pigment

2.1.3超聲溫度對(duì)茶色素得率的影響由圖3可知，隨著溫度在30～120℃之間的升高，信陽(yáng)毛尖茶色素的得率顯著增加，其原因可能與溫度越高，茶色素?cái)U(kuò)散到溶劑中的速度越快以及茶葉中本身含有的簡(jiǎn)單多酚氧化轉(zhuǎn)化為聚合多酚形式的茶色素越多有關(guān)。從實(shí)際生產(chǎn)情況考慮，超聲溫度不宜超過(guò)100℃。

圖3　不同超聲溫度對(duì)茶色素得率的影響Fig.3　Effect of ultrasonic temperature on extraction rate of Xinyang Maojian tea pigment

2.1.4提取次數(shù)對(duì)茶色素得率的影響由圖4可知，信陽(yáng)毛尖茶色素的得率受到提取次數(shù)的影響，隨著提取次數(shù)的增多，得率增加，在提取3次后得率可以達(dá)到25.1%，但3次差異較小，所以本實(shí)驗(yàn)綜合分析之后，選擇提取1、2、3次來(lái)做進(jìn)一步考察。

圖4　提取次數(shù)對(duì)得率的影響Fig.4　Effect of extraction times on extraction rate

2.2信陽(yáng)毛尖茶色素提取條件的優(yōu)化

由表2可以看出影響茶色素得率的因素大小依次為A＞D＞C＞B，即料液比、提取次數(shù)、超聲溫度、超聲時(shí)間。由正交實(shí)驗(yàn)可以得到各因素的最優(yōu)組合為：A2B2C1D3，即料液比1∶30、超聲時(shí)間120 min、超聲溫度80℃、提取次數(shù)3次。三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得率分別為：33.5%、33.1%、32.8%，平均得率為33.1%±0.4%。大于9組實(shí)驗(yàn)中的任意組，為最佳組合。

2.3信陽(yáng)毛尖茶色素的DPPH自由基清除活性

在本實(shí)驗(yàn)中，抗氧化劑將穩(wěn)定的DPPH自由基（紫色）還原為非自由基形式的DPPH-H（黃色）［19］。信陽(yáng)毛尖茶色素的DPPH自由基清除活性的結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，樣品的DPPH自由基清除活性隨著樣品濃度的增加而增加。在樣品濃度為100 μg/mL時(shí)，信陽(yáng)毛尖茶色素的DPPH自由基清除活性是80.38%，明顯低于VC（p＜0.05），VC是被公認(rèn)的具有最強(qiáng)DPPH自由基清除活性［7］，因此信陽(yáng)毛尖茶色素具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除活性。

表2　正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果Table 2　Results of orthogonal test

圖5　信陽(yáng)毛尖茶色素的DPPH自由基清除活性Fig.5　Scavenging activity of Xinyang Maojian pigment and ascorbic acid at various concentrations on DPPH free radical

2.4信陽(yáng)毛尖茶色素的超氧自由基清除活性

在本實(shí)驗(yàn)中，超氧自由基產(chǎn)生于PMS/NADH體系，并與NBT發(fā)生還原反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)混合物的吸光度值的降低來(lái)計(jì)算超氧自由基的清除活性。信陽(yáng)毛尖茶色素的超氧自由基清除活性的結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，隨著樣品濃度的增加，超氧自由基的清除活性逐漸升高。在樣品濃度為100 μg/mL時(shí)，信陽(yáng)毛尖茶色素的超氧自由基清除活性是85.33%，因此信陽(yáng)毛尖茶色素具有較強(qiáng)的超氧自由基清除活性。

圖6　信陽(yáng)毛尖茶色素的超氧自由基清除活性Fig.6　Scavenging activity of Xinyang Maojian pigment and ascorbic acid at various concentrations on superoxide radicals

2.5信陽(yáng)毛尖茶色素的羥基自由基清除活性

在本實(shí)驗(yàn)中，羥基自由基是通過(guò)Fenton反應(yīng)體系產(chǎn)生的。羥基自由基能氧化Fe2+成為Fe3+，而只有Fe2+能和1，10-菲咯啉形成1，10-菲咯啉-Fe2+的復(fù)合體，因而通過(guò)測(cè)定反應(yīng)體系吸光度值的降低可以計(jì)算出羥基自由基清除活性［20］。信陽(yáng)毛尖茶色素的羥基自由基清除活性的結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，隨著樣品濃度的增加，羥基自由基的清除活性逐漸升高。在樣品濃度為100 μg/mL時(shí)，信陽(yáng)毛尖茶色素的羥基自由基清除活性是88.68%，因此信陽(yáng)毛尖茶色素具有較高的羥基自由基清除活性。

圖7　信陽(yáng)毛尖茶色素的羥基自由基清除活性Fig.7　Scavenging effects of Xinyang Maojian pigment and ascorbic acid at various concentrations on hydroxyl radicals

3　結(jié)論

采用信陽(yáng)毛尖為原料，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，確定了在各因素水平下的最佳條件。由正交實(shí)驗(yàn)可以得到各因素的最優(yōu)組合為：料液比1∶30、超聲時(shí)間120 min、超聲溫度80℃、提取次數(shù)3次，此時(shí)茶色素的得率為33.1%±0.4%。因此，利用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)信陽(yáng)毛尖茶色素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，可獲得最優(yōu)的工藝參數(shù)，有效減少了工藝操作中的盲目性，從而為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

用分光光度法對(duì)信陽(yáng)毛尖茶色素清除體外自由基的能力進(jìn)行了測(cè)定，測(cè)定結(jié)果表明信陽(yáng)毛尖茶色素對(duì)DPPH自由基、超氧自由基、羥自由基有較強(qiáng)的清除作用，其清除體外自由基的能力由強(qiáng)到弱依次是：羥自由基＞超氧自由基＞DPPH自由基。因此，信陽(yáng)毛尖茶色素具有良好的抗氧化作用，可以作為一種天然的抗氧化劑。

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Research of ultrasound-assisted extraction of Xinyang Maojian tea pigment and its antioxidant activity

LI Bin，WU Xiao-xue，MENG Yao-yao，WANG Li-bo
（College of Biological and Chemical Engineering，Nanyang Institute of Technology，Nanyang 473004，China）

Objective：To optimize the extraction process for Xinyang Maojian tea pigment and explore its antioxidant activity.Methods：Effect of four factors on the extraction，including ratio of solid to liquid，ultrasonic temperature，ultrasonic time and extraction times were studied by single factor and the optimum extraction conditions were then determined through the orthogonal experiment.1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）free radical scavenging assay，superoxide and hydroxyl radical scavenging assay were used to evaluate the antioxidant activity of the pigment.Results：The order of factors to affect flavonoids extraction was ratio of material/solution＞extraction times＞ultrasonic temperature＞ultrasonic time.The optimal extraction conditions were material/solvent ratio 1∶30，extraction temperature of 80℃and extraction time of 120 min，for three times.Under such conditions，the yield of the melanin reached 33.1%.The Xinyang Maojian tea melanin exhibited a moderate antioxidant activity.It was clearly demonstrated that free radical scavenging increases with increasing melanin concentration. The melanin had strong scavenging activity on hydroxyl radical.Conclusion：The extraction rate of Xinyang Maojian tea pigment was improved by orthogonal experiment.The pigment had antioxygenation effect obviously，and it could be further developed and utilized as a natural antioxidant.

Xinyang Maojian tea；tea pigment；extraction；antioxidant activity

TS202.3

B

1002-0306（2015）18-0281-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.048

2015-01-30

李斌（1984-），女，博士，講師，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：binbin27_lee@163.com。