崔建東，梁龍昊，韓　叢，劉容麟（河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北科技大學(xué)，河北石家莊050000）

苯丙氨酸解氨酶仿生固定化及其穩(wěn)定性研究

崔建東，梁龍昊，韓叢，劉容麟
（河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北科技大學(xué)，河北石家莊050000）

利用仿生硅化技術(shù)包埋固定化苯丙氨酸解氨酶（PAL），研究固定化條件對(duì)PAL固定化的影響及固定化PAL的穩(wěn)定性。優(yōu)化的固定化酶制備條件：0.06 mL濃度為6 mg/mL誘導(dǎo)劑聚乙烯亞胺（PEI），25 mmol/L磷酸鹽（pH7.0）作為固定化反應(yīng)介質(zhì)體系，2 mL濃度為1 mol/L正硅酸甲酯（TMOS）水解液和1 mL（2 U/mL）酶液添加量，所得固定化酶的酶活最大回收率是70%。與游離酶相比，固定化PAL的溫度穩(wěn)定性、pH和儲(chǔ)存穩(wěn)定性，以及變性劑耐受性都有較大提高，重復(fù)使用5次，固定化PAL仍能保持初始酶活的40%。

苯丙氨酸解氨酶，仿生硅化，氧化硅，固定化酶，聚乙烯亞胺

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）是連接初級(jí)代謝和苯丙烷類(lèi)代謝、催化苯丙烷類(lèi)代謝第一步反應(yīng)的酶，是苯丙烷類(lèi)代謝的關(guān)鍵酶和限速酶［1］。存在于各種植物和少數(shù)微生物中，PAL可催化L-苯丙氨酸脫氨生成反式肉桂酸，具有廣泛的醫(yī)藥和工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。在醫(yī)藥方面主要被用來(lái)治療某些腫瘤，還可以診斷和治療苯丙酮尿癥［2］；在生物化工領(lǐng)域被用來(lái)酶法生產(chǎn)L-苯丙氨酸。但在應(yīng)用過(guò)程中，該酶表現(xiàn)出較低的酶活和穩(wěn)定性，限制了其廣泛應(yīng)用。

仿生礦化技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的一種新的固定化酶方法。該技術(shù)是人們通過(guò)模擬自然界某些生物體能夠在常溫下精確控制體內(nèi)礦物的形成而發(fā)展起來(lái)的一種技術(shù)。與傳統(tǒng)固定化酶方法相比，該技術(shù)避免了固定化過(guò)程中酸堿催化劑、高速攪拌以及高溫等對(duì)酶分子天然活性構(gòu)象的破壞，有利于酶活保留。且反應(yīng)條件溫和、快速，目前已經(jīng)被成功應(yīng)用在氨基酸氧化酶［3］、脂肪酶［4］、碳酸酐酶［5］等多種酶的固定化中。但關(guān)于仿生硅化過(guò)程用于PAL固定化方面尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以聚乙烯亞胺為誘導(dǎo)劑，通過(guò)模擬仿生硅化過(guò)程，將仿生硅化用于PAL的固定化，優(yōu)化了固定化制備條件，并考察了固定化PAL的催化穩(wěn)定性。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

粘紅酵母（Rhodotorula gluinis）中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC32913）；聚乙烯亞胺（PEI） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；正硅酸甲酯（TMOS）阿拉丁試劑（上海）有限公司；反式肉桂酸阿拉丁試劑（上海）有限公司；其他試劑均為市售分析純。

S-4800-Ⅰ型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡日本HITACHI；752型紫外分光光度計(jì)上海光譜儀器有限公司；TGL-16C型離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；HC-3018型高速離心機(jī)安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；85-1B磁力攪拌器鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；FD-27真空冷凍干燥機(jī)北京德天佑科技發(fā)展有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1PAL的提取將粘紅酵母接于培養(yǎng)基（葡萄糖5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，KH2PO40.5 g/L，（NH4）2HPO41 g/L，L-苯丙氨酸0.5 g/L，pH5.5）中，在28℃，150 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)21 h，培養(yǎng)后的粘紅酵母利用微珠渦流法進(jìn)行細(xì)胞破碎提取PAL粗酶液［6］。

1.2.2仿生硅化固定化苯丙氨酸解氨酶取0.152 g TMOS與1 mmol/L鹽酸溶液混合，振蕩10 min，制得濃度為1 mol/L TMOS水解液。取一定量的PAL酶（溶解在25 mmol/L磷酸鹽，pH7.0）與一定量的PEI充分混勻后，加入濃度為1 mol/L TMOS水解液，混合5 min后，混合物經(jīng)10000×g離心5 min，得到的沉淀物用去離子水洗滌3次，即得固定化PAL。

1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化固定化PAL制備條件在粗酶液量1 mg/mL、PEI濃度是6 mg/mL條件下，考察TMOS水解液濃度（0.5、0.8、1、1.2、1.5 mmol/L）對(duì)固定化PAL酶活回收率的影響；在粗酶液量1 mg/mL、TMOS濃度是1 mmol/L條件下，考察不同PEI濃度（2、4、6、8、10 mg/mL）對(duì)固定化PAL酶活回收率的影響；在TMOS濃度是1 mmol/L、PEI濃度是6 mg/mL條件下，考察粗酶液量（0.2、0.5、0.8、1、1.2 mg/mL）對(duì)固定化PAL酶活回收率的影響；在粗酶液量1 mg/mL、TMOS濃度是1 mmol/L、PEI濃度是6 mg/mL條件下，考察不同緩沖液體系（25 mmol/L Tris-HCl，pH7.0，25 mmol/L磷酸鹽，pH7.0或去離子水）對(duì)固定化PAL酶活回收率的影響。

1.2.4固定化PAL的形態(tài)觀察固定化PAL樣品經(jīng)真空冷凍干燥后，在真空條件下噴鉑金后利用電子掃描顯微鏡（電子發(fā)射電壓60～100 kV）檢測(cè)。

1.2.5酶活測(cè)定方法以紫外分光光度法測(cè)定PAL的酶活［7］。酶促反應(yīng)液包括0.1 g的酶樣品，2.5 mL 50 mmol/L L-苯丙氨酸和2 mL 25 mmol/L Tris-HCl，pH8.8，在30℃振蕩保溫10 min，然后加入0.2 mL 6 mol/L鹽酸終止反應(yīng)。10000×g離心5 min，取上清在278 nm下測(cè)吸光值。根據(jù)反式肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y= 14.083X-0.5621，R2=0.9999，計(jì)算酶活。一個(gè)酶活力單位定義為每分鐘催化L-苯丙氨酸生成1 μmol反式肉桂酸的酶量。

1.2.6酶活回收率

1.2.7固定化PAL的穩(wěn)定性考察對(duì)于溫度穩(wěn)定性，將游離酶和固定化PAL分別置于60℃下處理15、30、45、60 min后，分別檢測(cè)酶活。對(duì)于pH穩(wěn)定性，將游離酶和固定化PAL分別置于pH為3、5、7、8和11的緩沖液中處理30 min后，檢測(cè)酶活。對(duì)于變性劑穩(wěn)定性，將游離酶和固定化PAL分別置于2%SDS、20%乙醇和6 mol/L尿素中處理15 min，檢測(cè)酶活。對(duì)于儲(chǔ)存穩(wěn)定性，將游離酶和固定化PAL分別保存在25 mmol/L磷酸鹽（pH7.0）中，于25℃放置1、5、15、25 d，并在相對(duì)應(yīng)的儲(chǔ)存時(shí)間檢測(cè)酶活。

1.2.8固定化PAL的重復(fù)使用穩(wěn)定性考察轉(zhuǎn)化液的配制［8］：740 mg反式肉桂酸溶解到45 mL氨水（0.28 mol/L）中，用硫酸調(diào)pH為10，去離子水定容到100 mL。

重復(fù)使用穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：將固定化PAL與轉(zhuǎn)化液按照1∶4（v/v）在30℃條件下進(jìn)行第一輪轉(zhuǎn)化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化1 h后，10000×g離心5 min分離出固定化酶，用Tris-HCl（pH8.8）緩沖液洗滌后，在固定化酶中加入新的轉(zhuǎn)化液進(jìn)行第二輪轉(zhuǎn)化，依此分批轉(zhuǎn)化，每次轉(zhuǎn)化后分別檢測(cè)固定化酶剩余的酶活。直到檢測(cè)不到酶活為止。

1.2.9統(tǒng)計(jì)分析所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次，利用SAS軟件（v8.0）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1固定化PAL制備條件優(yōu)化

2.1.1TMOS水解液濃度對(duì)固定化酶的影響從圖1可以得出，TMOS水解液濃度對(duì)固定化PAL酶活有顯著影響（p＜0.05），隨著TMOS水解液濃度的增加，固定化酶的酶活回收率增加；在TMOS水解液濃度為1 mol/L時(shí)，酶活回收率最高；但隨著TMOS水解液濃度的進(jìn)一步增加，酶活回收率開(kāi)始下降。這可能是由于反應(yīng)體系中PEI的濃度一定，PEI只能催化聚合一定量的TMOS形成氧化硅，對(duì)游離酶進(jìn)行包埋，但當(dāng)TMOS濃度過(guò)大時(shí)，剩余的TMOS不能被PEI催化聚合形成氧化硅，導(dǎo)致對(duì)PAL的包埋率下降，使酶活回收率降低［4］。

圖1　TMOS水解液濃度對(duì)酶活的影響Fig.1　Effect of TMOS concentration on activity

2.1.2PEI濃度對(duì)固定化酶的影響由圖2可以看出，隨著PEI濃度增加，固定化酶的酶活也在增加，當(dāng)PEI濃度達(dá)到6 mg/mL時(shí)，酶活回收率達(dá)到最高，而隨著PEI濃度的繼續(xù)增加，酶活開(kāi)始下降。這可能是由于TMOS硅前體的量一定，PEI只能沉淀一定量的硅膠對(duì)酶進(jìn)行包埋，而過(guò)剩的PEI對(duì)酶形成靜電屏障，使酶無(wú)法與硅前驅(qū)體相互吸引，導(dǎo)致包埋效率降低［4］，從而使酶活回收率下降。

圖2　PEI濃度對(duì)酶活的影響Fig.2　Effect of PEI concentration on on activity

2.1.3酶量對(duì)固定化酶的影響從圖3可知，當(dāng)PAL酶量小于1 mg/mL時(shí)，隨著酶濃度的增加，固定化酶的酶活回收率增加，當(dāng)酶濃度達(dá)到1 mg/mL時(shí)，酶活回收率達(dá)到最高，達(dá)到70%以上。但當(dāng)酶濃度高于1 mg/mL時(shí)，固定化酶的酶活回收率并沒(méi)有繼續(xù)顯著增加（p＞0.05），反而有所降低。這是由于當(dāng)酶濃度過(guò)高時(shí)，多余的酶分子不能被包埋在硅膠中，且酶濃度過(guò)高也會(huì)使納米級(jí)氧化硅載體包埋過(guò)量的酶分子，使被包埋的酶分子無(wú)法正常伸展形成正確的空間構(gòu)象［9］，導(dǎo)致固定化酶酶活有所下降。

圖3　酶量對(duì)固定化酶酶活的影響Fig.3　Effect of PAL concentration on activity

2.1.4不同緩沖液體系對(duì)固定化酶的影響研究表明，仿生硅化過(guò)程中，反應(yīng)介質(zhì)對(duì)誘導(dǎo)形成的仿生氧化硅的形態(tài)有較大影響［10］，而氧化硅載體形態(tài)又會(huì)直接影響固定化酶的最終酶活。結(jié)果見(jiàn)圖4，當(dāng)用磷酸鹽作為反應(yīng)介質(zhì)時(shí)，固定化酶的酶活回收率最高，而水作為反應(yīng)介質(zhì)時(shí)固定化酶的酶活回收率最低，可能是由于緩沖液中的陰離子充當(dāng)了離子交聯(lián)劑，促進(jìn)帶正電的PEI與酶分子通過(guò)分子間或分子內(nèi)靜電作用自組裝形成聚合體，進(jìn)而為硅前體的縮聚提供模板［10］，使酶分子更多的包埋在硅膠中。

圖4　不同緩沖液對(duì)固定化酶酶活的影響Fig.4　Effect of buffer on activity

2.2固定化PAL掃描電鏡形態(tài)觀察

圖5是掃描電鏡觀察的固定化PAL的圖片。從圖5中可以看出，在同樣的標(biāo)尺下（500 nm），當(dāng)沒(méi)有包埋酶分子時(shí)，PEI誘導(dǎo)TMOS硅前體所形成的氧化硅顆粒非常小，大致呈微球型，顆粒與顆粒之間團(tuán)聚的非常致密（圖5A）。而包埋有PAL的固定化酶氧化硅顆粒明顯增加，呈現(xiàn)出較大的球形顆粒，且顆粒之間出現(xiàn)較多空隙（圖5B）。說(shuō)明在固定化過(guò)程中，酶的加入有助于阻止硅前體縮合形成的顆粒進(jìn)一步相互連接團(tuán)聚。這種較疏松的結(jié)構(gòu)有利于酶促反應(yīng)過(guò)程中底物和產(chǎn)物的傳遞。

圖5　固定化酶的電鏡圖片（105×）Fig.5　SEM images（105×）

2.3固定化PAL催化穩(wěn)定性

2.3.1固定化PAL溫度穩(wěn)定性圖6是固定化PAL的溫度穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖6表明，與游離酶相比，固定化酶具有更高的耐受高溫的能力。在60℃下處理30 min時(shí)，游離酶損失了初始酶活的50%以上，而固定化酶僅損失了20%左右的酶活；當(dāng)處理1 h后，游離酶幾乎喪失了所有酶活，而固定化酶卻還能保留40%以上的酶活。說(shuō)明當(dāng)酶分子被包埋在仿生氧化硅中后，酶分子的天然空間構(gòu)象得以保持［11］，特別是由于有氧化硅的外層保護(hù)，溫度的傳遞速度減緩，使高的溫度不能直接作用于酶分子，從而降低了酶的失活率。

圖6　固定化PAL的溫度穩(wěn)定性Fig.6　Thermostability of encapsulated PAL

2.3.2固定化酶pH穩(wěn)定性圖7是固定化酶的pH穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖7表明，固定化酶耐受極端pH的能力明顯高于游離酶；游離酶在pH3～8時(shí)均有一定的酶活保留率，但固定化酶的酶活保留率要高于游離酶；當(dāng)趨向于強(qiáng)堿條件時(shí)，游離酶酶活損失較大，而固定化酶卻能保留較高的酶活；在pH11的條件下處理30 min，游離酶僅能保留47%的酶活，而固定化酶基本不失活。這可能是由于PAL被包埋在氧化硅載體中后，防止了極端pH條件下大量OH-和H+對(duì)酶分子的攻擊，使酶活性中心的結(jié)構(gòu)保持下來(lái)，保護(hù)酶不失活［12］。

圖7　固定化PAL的pH穩(wěn)定性Fig.7　pH-stability of encapsulated PAL

2.3.3固定化酶變性劑穩(wěn)定性圖8是固定化酶對(duì)變性劑的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖8表明，在變性劑作用下，游離酶和固定化酶都有不同程度的失活，但固定化酶表現(xiàn)出對(duì)變性劑更高的耐受性。特別是當(dāng)用2% SDS處理30 min后，游離酶基本失活，只能殘留12%的酶活，但固定化酶還能保留47%的酶活。固定化酶對(duì)變性劑的耐受可能是由于游離的酶分子被包埋在仿生氧化硅載體中，氧化硅載體阻礙了變性劑與酶分子的直接接觸，使酶分子的活性結(jié)構(gòu)得以保持，導(dǎo)致酶活被保留下來(lái)［4，13］。

圖8　固定化PAL的變性劑穩(wěn)定性Fig.8　Encapsulated PAL against denaturants

2.3.4固定化酶儲(chǔ)存穩(wěn)定性固定化酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)固定化酶應(yīng)用價(jià)值的重要指標(biāo)［13］。圖9是固定化PAL儲(chǔ)存穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在儲(chǔ)存過(guò)程中，游離酶和固定化酶酶活都有所下降，但固定化酶儲(chǔ)存穩(wěn)定性顯著優(yōu)于游離酶（p＜0.05），在儲(chǔ)存到第25 d時(shí)，游離酶已經(jīng)完全失活，但固定化酶還能保留24%的酶活。說(shuō)明PAL經(jīng)過(guò)仿生硅化固定化后儲(chǔ)存穩(wěn)定性有顯著改善，這個(gè)結(jié)果和張羽飛［14］的研究結(jié)果一致。

圖9　固定化PAL的儲(chǔ)存穩(wěn)定性Fig.9　Storage stability of encapsulated PAL

2.4固定化PAL重復(fù)使用性

圖10是固定化酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖10表明，經(jīng)過(guò)仿生硅化包埋的PAL具有一定的重復(fù)使用穩(wěn)定性，連續(xù)重復(fù)使用5次后固定化酶仍然能保留近40%的酶活。但是，使用到第7次后，固定化酶基本檢測(cè)不到酶活。這可能是由于仿生硅化包埋的PAL的顆粒是納米級(jí)的，顆粒較小，在反復(fù)離心回收過(guò)程中，部分顆粒太小的固定化酶難以回收，導(dǎo)致?lián)p失，同時(shí)高速離心產(chǎn)生的剪切力也會(huì)使固定化酶顆粒被打碎，使酶泄漏，導(dǎo)致酶活損失。

圖10　固定化酶重復(fù)使用穩(wěn)定性Fig.10　Recycling stability of encapsulated PAL

3　結(jié)論

本研究首次將溫和的仿生硅化過(guò)程用于PAL酶的固定化，固定化的最佳條件是：0.06 mL濃度為6 mg/mL聚乙烯亞胺作為誘導(dǎo)劑，25 mmol/L磷酸鹽（pH7.0）作為固定化的反應(yīng)介質(zhì)體系，2 mL濃度為1 mol/L正硅酸甲酯水解液和酶液添加量1 mg/mL（2 U/mL），所得固定化酶的酶活最大回收率是70%。與游離酶相比，固定化酶表現(xiàn)出優(yōu)越的溫度、pH、變性劑和儲(chǔ)存穩(wěn)定性，此外，固定化酶還具有一定的重復(fù)使用穩(wěn)定性，在連續(xù)重復(fù)使用5批次后，固定化酶還能保持初始酶活的近40%。上述結(jié)果表明這種固參考文獻(xiàn)

定化酶方法在工業(yè)應(yīng)用中具有較好的實(shí)用前景。

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Immobilization of phenylalanine ammonia lyase by biomimetic silica and its stability

CUI Jian-dong，LIANG Long-hao，HAN Cong，LIU Rong-lin
（Research Center for Fermentation Engineering of Hebei，College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050000，China）

In this study，phenylalanine ammonia lyase（PAL）was encapsulated by in polyallylamine-mediated biomimetic silica.The conditions for the preparation of encapsulated PAL were optimized.Moreover，stability of the encapsulated PAL was examined.The optimal activity recovery（70%）of PAL were achieved when 0.06 mL polyallylamine（PEI）of 6 mg/mL，2 mL tetramethoxysilane（TMOS）of 1 mol/L and 1 mL PAL（2 U/mL）in 25 mmol/L phosphate buffer（pH7.0）were used.Compared with free PAL，the encapsulated PAL showed better properties in pH，thermal and storage stabilities，as well as the tolerance abilities against denaturants.In additional，the encapsulated PAL still retained 40%of its initial activity after consecutive 5 cycles.

phenylalanine ammonia lyase；biomimetic silica；monox；Immobilization enzyme；polyethyleneimine

TS202.3

A

1002-0306（2015）18-0193-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.030

2015－01－20

崔建東（1974-），男，博士，教授，研究方向：生物催化與微生物資源開(kāi)發(fā)，E-mail：cjd007cn@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金（21072041）；河北省自然科學(xué)基金（B2014208054）。