廣西桂林食品藥品檢驗(yàn)所（541002）覃曉 周文杰 李夏林

附圖 混合對照品(左)及樣品圖譜(右)

大黃為蓼科植物掌葉大黃R h e u m p a l m a t u m L.、唐古特大黃R h e u m tanguticum Maxim.ex Balf.或藥用大黃Rheum officinale Baill.的干燥根和根莖[1]。是臨床上用量較大的一味藥，其主要活性成分為大黃素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚等。2010版藥典在用高效液相色譜法對這5種成分的含量進(jìn)行測定時，需要用到5種對照品，而中藥對照品通常都較貴，且難以純化。因此，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)“一測多評”的思路[2]，擬用大黃素對照品為內(nèi)標(biāo)物，通過測定它與蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚的校正因子，對大黃藥材中5種成分的含量進(jìn)行測定，為大黃藥材的質(zhì)量控制建立一種新的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器：島津LC-20AT高效液相色譜儀（色譜儀1）；島津2010AHT高效液相色譜儀（色譜儀2）；Waters高效液相色譜儀（色譜儀3）；色譜柱：島津C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；漢邦C18柱(4.6mm×250mm，5μm）；特納C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；ABS265-S十萬分之一天平。

1.2 試藥 對照品：大黃素，批號：1 1 0 7 5 6-2 0 0 1 1 0 ，大黃酸，批號：110757-200206，大黃酚，批號：110796-200716，蘆薈大黃素，批號：110795-200605，大黃素甲醚，批號：110758-200408，均購自中國食品藥品檢定研究院。大黃藥材為藥店采購。甲醇、磷酸為色譜純，三氯甲烷、鹽酸為分析純，水為純化水。

2 原理

在一定的線性范圍內(nèi)，紫外檢測器的響應(yīng)值（A）與組分的濃度（C）成正比，即：K=A/C[2][3][4]，在對多組分的物質(zhì)進(jìn)行含量測定時，可以先選定一個合適的組分作為內(nèi)標(biāo)物，建立該組分與其它組分的校正因子（?），如公式（1）所示：

在一定的色譜條件下，配置一定濃度的內(nèi)標(biāo)物和對照品的溶液，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以峰面積A為縱坐標(biāo)，分別測定內(nèi)標(biāo)物和對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距校正為0后，用兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率K的比值即可求得校正因子（?） 。

以上公式即為用內(nèi)標(biāo)物與校正因子測定其它組分含量的計(jì)算公式。式中，SA為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高；RA為對照品的峰面積或峰高；XA為供試品的峰面積或峰高；Sc為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度；Rc為對照品的濃度；Xc為供試品的濃度。

3 方法與結(jié)果

3.1 色譜條件[1]色譜柱： C 1 8 柱（4.6mm×250mm，5 μ m）；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15)；檢測波長：254nm；流速：0.8 ml·min-1；柱溫：35℃；進(jìn)樣量10μl；理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)不低于3000，各峰的分離度均應(yīng)大于1.5。見附圖。

3.2 對照品溶液的配制 精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚對照品各16mg，置200ml量瓶中（A瓶），精密稱取大黃素甲醚對照品10mg置250ml量瓶中（B瓶），分別加甲醇至刻度；精密量取A瓶與B瓶中溶液各2ml置10ml量瓶中（C瓶），加甲醇至刻度，即得（每1ml中含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚各16μg，含大黃素甲醚8μg）。

3.3 供試品溶液的制備 取大黃粉末（過四號篩）0.15g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，稱定重量，加熱回流1小時，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5ml，置燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液10ml，超聲處理2分鐘，再加三氯甲烷10ml加熱回流1小時，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙猓D(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.4 線性范圍：精密量取混合對照品溶液1μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl，按“3.1”項(xiàng)下的色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，得各成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：蘆薈大黃素：Y=5857835X-16964，R=1.0000；大黃酸：Y=5402446X-22526，R=1.0000；大黃素：Y=5134066X-13903，R=1.0000；大黃酚：Y=5855968X+8868，R=0.9999；大黃素甲醚：Y=3794269X-8019，R=1.0000。各成分的線性關(guān)系良好。

3.5 校正因子（?）的測定：精密量取混合對照品溶液5μl、10μl、15μl、20μl、25μl注入液相色譜儀，測定它們的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距校正為0后，內(nèi)標(biāo)物與對照品的斜率之比即為它們的校正因子（?），見附表1。

3.6f值的耐用性考察：在用高效液相色譜法進(jìn)行操作的時候，色譜條件通常會發(fā)生一些變化，因此，我們對幾種常見的變化因素，包括色譜柱、色譜儀、波長偏差以及流速變化進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示， 值的差異不大。見附表2。

3.7 各組分色譜峰的定位 在只使用一個對照品的情況下，如何對其他3個組分的色譜峰進(jìn)行定位是一個關(guān)鍵問題，參照王智明[2]的思路，采用相對保留時間差對它們進(jìn)行定性時，發(fā)現(xiàn)不同儀器對各組分的出峰時間影響較小，而不同填料色譜柱則對各組分的出峰時間影響較大，見附表3。由于同樣的成分，在不同色譜柱及色譜儀器中光譜是相同或相似的，因此，為了對各組分色譜峰的定位更準(zhǔn)確，可以采用相對保留時間差與光譜圖相結(jié)合的方法確定色譜峰的歸屬。

3.8 一測多評法與外標(biāo)法檢測樣品含量結(jié)果比較 取同一批大黃藥材，分別采用對照品外標(biāo)法和一測多評法測定6次，結(jié)果見附表4。每組數(shù)據(jù)經(jīng) 檢驗(yàn)，P值均＞0.05，兩種方法結(jié)果無顯著差異。

4 討論

4.1 本文根據(jù)“一測多評”的思路，以大黃素為內(nèi)標(biāo)物，測定大黃素與其它組分的校正因子，用內(nèi)標(biāo)物加校正因子對其它組分的含量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，該法與對照品外標(biāo)法測定結(jié)果沒有顯著差異，各校正因子在耐用性考察中重現(xiàn)性較好，說明“一測多評”應(yīng)用到大黃的含量測定中是可行的。4.2 在使用“一測多評”進(jìn)行樣品含量測定的過程中，增加了校正因子這個量值，它的測量誤差將直接傳遞給最終的測定結(jié)果，導(dǎo)致誤差增大。為了合理表征測定結(jié)果的分散性，筆者認(rèn)為今后可以對校正因子的不確定度進(jìn)行評定。

4.3 同對照品外標(biāo)法相比，使用“一測多評”具有以下優(yōu)勢：不僅可以減少對照品的使用量，還能簡化樣品的檢驗(yàn)程序，對于一些價格昂貴，不易得到的對照品來說，非常適用，因此，在將來的藥品檢測方法的應(yīng)用中，“一測多評”技術(shù)將具有很大的發(fā)展前景。