天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院（300070）周瑾

天津醫(yī)科大學(xué)（300070）劉照勝

奧硝唑分散片用于治療由厭氧菌（脆弱擬桿菌、狄氏擬桿菌、卵園擬桿菌、多形擬桿菌、普通擬桿菌、梭狀芽胞桿菌、真桿菌、消化球菌和消化鏈球菌、幽門螺桿菌、黑色素擬桿菌、梭桿菌、CO2噬織維菌、牙齦類桿菌等）感染引起的多種疾??；男女泌尿生殖道毛滴蟲、賈第氏鞭毛蟲感染引起的疾?。ㄈ珀幍赖蜗x病等）；腸、肝阿米巴蟲病（包括阿米巴痢疾、阿米巴肝膿腫），腸、肝變形蟲感染引起的疾病；用于預(yù)防和治療各科手術(shù)后厭氧菌感染。本文以替硝唑為內(nèi)標(biāo)，采用反相HPLC法測定奧硝唑的含量，用于奧硝唑分散片的質(zhì)量控制。結(jié)果表明，本法簡便準(zhǔn)確，適用于奧硝唑制劑的常規(guī)質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

島津LC一10AT 型HPLC 儀，包括SPD一10A 型紫外檢測器、LC—R6A 型數(shù)據(jù)處理機和7725型定量進樣器。奧硝唑?qū)φ掌?自制，含量99.4%)、甲硝唑?qū)φ掌?中國藥品生物制品檢定所，含量99.8%，批號07254)；乙腈（色譜純）；KH2PO4（分析純，批號070221，天津化學(xué)試劑二廠）；鹽酸（分析純，批號071003，天津化學(xué)試劑二廠），實驗用水為雙蒸餾水；奧硝唑分散片（0.2 5 g/片，國藥準(zhǔn)字H20040375，批號：20130518，20130608，20130825，河南天方藥業(yè)有限公司）。

2 試驗方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱為Shimpack CLC—ODS柱(4.6 mm×150 mm,5u)；流動相乙腈-KH2PO4(0.01 mol·L-1)(22∶78，v/v)，使用前超聲脫氣20min，0.45μm微孔濾膜抽濾；流速1.0ml／min；檢測波長310nm；進樣量10μl；柱溫為室溫。在上述色譜條件下，模擬處方中，奧硝唑的出峰時間為5.8min，替硝唑出峰時間為2.7min；按奧硝唑峰計算理論板數(shù)不低于1000，奧硝唑與甲硝唑的色譜峰分離度大于1.5。色譜圖見附圖1。

2.2 溶液制備

附圖1 模擬處方中奧硝唑與甲硝唑色譜圖

附圖2 模擬空白處方

附表1 回收率測定結(jié)果（n＝9）

附表2 精密度試驗結(jié)果（n＝9）

附表3 三批奧硝唑分散片的含量測定結(jié)果

2.2.1 對照品溶液的制備 分別取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥至恒重的奧硝唑?qū)φ掌放c甲硝唑?qū)φ掌犯骷s25mg，精密稱定，分別置50ml量瓶中，加流動相適量，超聲10min使溶解，放冷，加流動相至刻度，搖勻，分別得到奧硝唑?qū)φ諆湟杭凹紫踹颍▋?nèi)標(biāo)）液。精密量取1.0 ml奧硝唑?qū)φ諆湟海?5ml量瓶中，再精密加入內(nèi)標(biāo)液1.0ml，加流動相稀釋至刻度，搖勻，得到對照品溶液 (奧硝唑濃度為20μg/ml，內(nèi)標(biāo)物濃度為20μg/ml)。

2.2.2 供試液的配制 取供試品10片，精密稱定，求出平均裝量。將膠囊的內(nèi)容物混合均勻，研細，精密稱取適量，（約相當(dāng)于奧硝唑25mg），置于50ml量瓶中，加流動相適量，超聲處理5min，使奧硝唑溶解，用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液1ml，置另25ml量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)液1.0 ml，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液（約相當(dāng)于奧硝唑20μg/ml）。

2.3 結(jié)果

2.3.1 空白對照 按處方工藝制備不含奧硝唑的模擬制劑，按供試液配制方法，制備不含內(nèi)標(biāo)物的空白對照，10μl進樣，得到附圖2，說明處方中敷料不影響奧硝唑的測定。

2.3.2 線性范圍 精密量取不同體積奧硝唑?qū)φ找簝湟?，分別置25ml量瓶中，精密加入1.0ml內(nèi)標(biāo)液，用流動相稀釋至刻度，搖勻，分別配成濃度為4、8、16、24、32及40μg/ml的對照液，分別進樣10μl，記錄不同濃度的色譜峰面積，以濃度C對奧硝唑?qū)μ嫦踹虻姆迕娣e比（A1/A2）做最小二乘法線性回歸分析，得到回歸曲線為A1/A2＝4.220C+0.054（r＝0.9998，n＝5）。結(jié)果顯示，峰面積比與奧硝唑濃度之間的線性關(guān)系良好。

2.3.3 準(zhǔn)確度實驗

2.3.3.1 校正因子f的測定 精密量取不同體積的對照液儲備液，分別置25ml量瓶中，分別精密加入1.0ml內(nèi)標(biāo)液，以流動相稀釋至刻度，得到濃度分別為16μg/ml、20μg/ml及24μg/ml的三種溶液。每個濃度分別進樣3次，每次10μl，按公式f＝（A內(nèi)標(biāo)/C內(nèi)標(biāo)）/（A對照/C對照）計算f值，f的平均值為0.931。

2.3.3.2 回收率的測定

取三份模擬的空白處方，分別置50ml量瓶，分別精密加入不同量的苯酰甲硝唑?qū)φ掌?，加流動相適量，超聲處理5min，用流動相稀釋至刻度，搖勻。濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液1.0ml，置另一25ml量瓶中，精密加入一定量的內(nèi)標(biāo)液，用流動相稀釋至刻度，搖勻。10μl進樣，每個濃度重復(fù)測定3次，測得奧硝唑與內(nèi)標(biāo)物的峰面積，計算奧硝唑回收率，結(jié)果見附表1。

2.3.4 精密度試驗

2.3.4.1 重復(fù)性試驗 在同一時間內(nèi)，由一名實驗人員分別配制不同含量的苯酰甲硝唑的模擬處方，按“2.2.2供試液配制”規(guī)定方法配制待測樣品，使奧硝唑的濃度分別為16、20、24μg/ml，進樣10μl，每個濃度重復(fù)3次，測定奧硝唑及內(nèi)標(biāo)物的峰面積，計算9次測定的f值的RSD，結(jié)果見附表2。結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好。

2.3.4.2 中間精密度試驗 在不同日期內(nèi)，由不同分析人員分別配制不同含量的奧硝唑的模擬處方，按“2.3供試液配制”規(guī)定方法配制待測樣品，使奧硝唑的濃度分別為16、20、24μg/ml，進樣10μl，每個濃度重復(fù)3次，測定奧硝唑及內(nèi)標(biāo)物的峰面積，計算9次測定的f值的RSD，結(jié)果見附表2。結(jié)果表明，本方法中間精密度較好。

2.3.4.3 供試液穩(wěn)定性試驗 取2.2.2項下的供試品溶液，自然放置，分別于0、2、6、12小時進樣10ul，測定奧硝唑與甲硝唑的面積比（A1/A2）， 考察供試液的穩(wěn)定性，結(jié)果表明，12小時內(nèi)的A1/A2RSD為1.07%，供試液在12小時內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 樣品測定 取不同批號的奧硝唑分散片，分別按“2.2.2項下”規(guī)定處理，測定每批奧硝唑相對標(biāo)示量的百分含量，結(jié)果見附表3。

3 討論

根據(jù)文獻報道[1][2][3][4]，奧硝唑的測定一般采用甲醇一水或甲醇一磷酸緩沖鹽作流動相，以甲硝唑為內(nèi)標(biāo)測定奧硝唑的含量。通過試驗比較，我們發(fā)現(xiàn)甲醇一水或甲醇一磷酸緩沖鹽體系效果均不理想，供試液不穩(wěn)定。改用乙腈-KH2PO4(0.01 mol·L-1)(22∶78，v/v)后，色譜峰分離理想，色譜系統(tǒng)適用性指標(biāo)均令人滿意。

反相高效液相色譜技術(shù)具有靈敏、簡便、分離效能高等優(yōu)點，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用。應(yīng)用此技術(shù)對分析奧硝唑分散片的含量有很大意義，本文方法準(zhǔn)確度高，精密度及樣品穩(wěn)定性均較好，可作為實踐中常規(guī)應(yīng)用的一種簡便、可靠、快速的分析方法。