秦清娟，鄧 利，徐小青，王小燕，鐘 耕，2，3，*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400716；2.西南大學(xué) 食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，重慶 400716；3.重慶市特色食品工程技術(shù)研究 中心，重慶 400716）

魔芋葡甘聚糖及其衍生物腸道益生性的體外發(fā)酵評(píng)價(jià)

秦清娟1，鄧 利1，徐小青1，王小燕1，鐘 耕1，2，3，*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400716；2.西南大學(xué) 食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，重慶 400716；3.重慶市特色食品工程技術(shù)研究 中心，重慶 400716）

目的：評(píng)價(jià)魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）及其衍生物脫乙酰基魔芋葡甘聚糖（D-KGM）、魔芋葡甘露低聚糖（konjac oligosaccharide，KOS）的腸道益生性。方法：分別以1 g/100 mL的KGM、KOS和D-KGM為碳源，通過(guò)小鼠盲腸內(nèi)容物體外厭氧發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵液的pH值、微生物和短鏈脂肪酸，評(píng)價(jià)腸道益生效果。結(jié)果：與陽(yáng)性對(duì)照組（以葡萄糖作為碳源）相比，KGM和KOS發(fā)酵液pH值明顯降低，短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）和乳酸菌、雙歧桿菌的數(shù)量顯著增加，腸道潛在致病菌（大腸桿菌、梭狀桿菌、擬桿菌）的增殖不明顯，而D-KGM發(fā)酵液中pH值、腸道微生物、SCFAs與陰性對(duì)照組（不含碳源）均無(wú)顯著性差異。結(jié)論：KOS和KGM具有顯著的腸道益生性，而D-KGM沒(méi)有腸道益生性。

魔芋葡甘聚糖；魔芋葡甘低聚糖；脫乙酰基魔芋葡甘聚糖；腸道益生性；體外發(fā)酵

魔芋（konjac），天南星科魔芋屬多年生草本植物，主要生長(zhǎng)在山地和丘陵地區(qū)，在我國(guó)西南部及長(zhǎng)江中下游一帶，資源相當(dāng)豐富?，F(xiàn)代研究表明其主要成分有：魔芋葡甘露聚糖（konjac glucomannan，KGM）、淀粉及粗蛋白，其中KGM含量可達(dá)到濕質(zhì)量的10%～30%［1］。KGM是一種優(yōu)良的膳食纖維，由β-D-葡萄糖與β-D-甘露糖以1.5～1.6的比例，通過(guò)β-l，4-糖苷鍵連接而成的雜多糖［2］，在主鏈的C3位上存在通過(guò)β-l，3-糖苷鍵鍵合的支鏈結(jié)構(gòu)，每32 個(gè)糖殘基上有3 個(gè)左右的支鏈，支鏈只有幾個(gè)殘基的長(zhǎng)度，并且每19 個(gè)糖殘基上有一個(gè)乙?；鶊F(tuán)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以達(dá)到15%［3-4］。KGM的分子質(zhì)量很大，光散射法測(cè)得其重均分子質(zhì)量為8×105～2.2×106D，分子質(zhì)量高達(dá)109D，是一種天然的高分子化合物［5］。

魔芋葡甘低聚糖（konjac oligosaccharide，KOS）和脫乙酰基魔芋葡甘聚糖（deacetylation konjac glucomannan，D-KGM）是KGM兩種重要的衍生物。D-KGM是KGM在堿性物質(zhì)或機(jī)械力作用下，脫去乙酰基得到的一種不可逆凝膠。D-KGM力學(xué)性能和熱穩(wěn)定性能較KGM都有顯著性提高［6］，在食品、包裝、涂料、生物醫(yī)藥及化妝等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。如魔芋豆腐、魔芋仿生食品等［7］。KOS是KGM可通過(guò)物理法［8］、化學(xué)法［9］或（和）生物法［10］將KGM降解而生成的低聚糖。盡管KGM有多種生理功能，但由于KGM的分子質(zhì)量太高，溶于水中形成的液體黏度大，限制了KGM的應(yīng)用范圍，而通過(guò)降解生成的KOS不但溶解度得到提高，保持KGM原有的一些性能［11-12］，同時(shí)還具有一些新的已知［13］或未知的功能。

眾所周知，魔芋葡甘聚糖是優(yōu)質(zhì)的膳食纖維，能促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)，有“腸道清道夫”作用，加快排泄體內(nèi)有害毒素，預(yù)防和減少疾病的發(fā)生，還能有效保護(hù)胃黏膜，清潔胃壁，還具有良好的腸道益生性［14-16］，然而以哪種形式食用才能發(fā)揮更好的作用，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。而益生元發(fā)揮腸道益生性的作用機(jī)制主要有：通過(guò)增加腸道益生菌的活性，調(diào)節(jié)腸道上皮屏障發(fā)揮益生作用［17］；降低腸道pH值，抑制有害菌的生長(zhǎng)，防止腸道功能紊亂［18］；促進(jìn)短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）產(chǎn)生，為腸黏膜細(xì)胞提供能量，促進(jìn)細(xì)胞的代謝、生長(zhǎng)，還可增大腸道滲透壓，提高糞便含水率［19］。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)小鼠盲腸內(nèi)容物體外厭氧發(fā)酵模擬腸道，比較不同發(fā)酵液pH值、腸道微生物和短鏈脂肪酸的差異，研究KGM、D-KGM和KOS的腸道益生性，評(píng)價(jià)KGM及其衍生物的食用價(jià)值。

1　材料與方法

1.1材料

KGM由四川綿陽(yáng)魔力科技有限公司提供，符合NY/T 494—2010《魔芋粉》；D-KGM參照魔芋豆腐制作方法以上述KGM經(jīng)堿化、加熱、烘干、粉碎、過(guò)篩而成［7］；KOS以上述魔芋粉經(jīng)酶解、醇提、干燥、粉碎、過(guò)篩制備而成［20］。

1.2試劑

乙酸、丙酸、丁酸、正戊酸、異戊酸（色譜純）阿拉丁試劑（上海）有限公司；膽汁酸鹽、氯化血紅素合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；熒光定量PCR擴(kuò)增試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM、RR820A、DNA提取試劑盒9763 日本TaKaRa公司；總細(xì)菌、大腸桿菌、雙歧桿菌、擬桿菌、乳酸菌、梭狀桿菌的DNA引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成［21］，具體序列及信息見(jiàn)表1。

表1　細(xì)菌16S rDNA引物序列Table 1 Primer pairs for bacterial 16S rDNA

1.3儀器與設(shè)備

LightScanner32型定量PCR儀 美國(guó)Idaho公司；BioSpec-mini生化分析型紫外分光光度計(jì)、GC-2010氣相色譜儀 日本島津公司；厭氧培養(yǎng)箱 美國(guó)Sheldon Manufacturing公司；5810型臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；Spectrum 100型紅外光譜分析儀 美國(guó)Perkin Elmer公司；VD-650型桌上式潔凈工作臺(tái) 蘇州精華設(shè)備有限公司；Rtx-wax毛細(xì)管柱 美國(guó)Restek公司；ES-315高壓蒸汽滅菌鍋 日本Kagoshima Seisakusyo公司；PHS-3C型精密酸度計(jì) 上海大普儀器有限公司。

1.4動(dòng)物

清潔級(jí)KM小鼠、飼料 重慶騰鑫比爾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銷售有限公司，許可證號(hào)：SCXK（渝）2012-0003。

1.5方法

1.5.1KGM及其衍生物紅外光譜掃描

分別取上述KGM、KOS和D-KGM干燥粉末5 mg，與100 mg KBr粉末在瑪瑙研缽中充分研磨均勻，壓片上機(jī)測(cè)定，紅外光譜掃描范圍為4 000～450 cm－1。

1.5.2體外厭氧發(fā)酵

無(wú)菌取20 只健康KM小鼠盲腸內(nèi)容物于滅菌離心管中，9 倍（V/m）無(wú)菌生理鹽水稀釋，渦旋振蕩3 min使其分散均勻，4 層紗布過(guò)濾，即為盲腸內(nèi)容物稀釋液?；A(chǔ)發(fā)酵液的配制參照Longland等［22］的方法，滅菌，分成5 份，其中3 份分別加入1 g/100 mL的KGM、KOS、D-KGM作為碳源，一份加入1 g/100 mL的葡萄糖（glucose，GLU）作為陽(yáng)性對(duì)照組，另外一組不加任何碳源作為陰性對(duì)照，4 ℃穩(wěn)定過(guò)夜，每個(gè)樣品各做3 個(gè)平行。向上述發(fā)酵液中加入體積分?jǐn)?shù)10%盲腸內(nèi)容物稀釋液混合均勻，將其放于37 ℃厭氧發(fā)酵箱中發(fā)酵24 h，終止發(fā)酵進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.5.3發(fā)酵液pH值測(cè)定

參考GB/T 1601-1993《農(nóng)藥pH值的測(cè)定方法》［23］標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定。

1.5.4發(fā)酵液中短鏈脂肪酸含量測(cè)定

短鏈脂肪酸的提取參考賈益群等［24］的方法，用氣相色譜測(cè)定發(fā)酵液中乙酸、丙酸、丁酸、戊酸及總酸含量。以乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸及異戊酸標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，總酸為以上各種酸的總和。

氣相色譜條件：進(jìn)樣量1 ?L；進(jìn)樣口溫度220 ℃；柱流量0.95 mL/min，柱溫90 ℃、平衡時(shí)間0.5 min，5 ℃/min升溫至150 ℃，保留時(shí)間7 min；檢測(cè)器溫度230 ℃；氫氣流量40 mL/min，空氣流量400 mL/min，尾吹流量40 mL/min。

1.5.5發(fā)酵液中微生物數(shù)量測(cè)定

1.5.5.1細(xì)菌基因組總DNA提取

將發(fā)酵液3 000 r/min離心5 min，取上清液5 mL，12 000 r/min離心3 min，棄上清液，之后按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行細(xì)菌基因組總DNA提取，提取的DNA經(jīng)微量紫外分光光度計(jì)測(cè)得A260nm/A280nm值在1.8～2.0，說(shuō)明可以作為熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的DNA模板。

1.5.5.2熒光定量PCR

發(fā)酵液中微生物含量的測(cè)定采用SYBR GreenⅠ染料法，在定量PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系為SYBR GreenⅠ染料10 ?L，上下游引物各1 ?L，DNA模板4 ?L，最后以雙蒸水補(bǔ)足10 ?L；反應(yīng)程序：95 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解，熔解程序：95 ℃ 5 s，65 ℃ 15 s，95 ℃ 0.1 ℃/s降溫。用定量PCR得出的Ct值，采用2－△△Ct法［25］計(jì)算大腸桿菌、雙歧桿菌、擬桿菌、梭狀桿菌、乳酸菌的相對(duì)含量。其中－△△Ct的計(jì)算見(jiàn)下式。

2　結(jié)果與分析

2.1KGM及其衍生物紅外光譜分析

圖1　魔芋葡甘聚糖及其衍生物的紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectra of KGM and its derivatives

由圖1可知，KGM及其衍生物紅外光譜曲線走向大致相同，有共同的吸收峰，但也有不同的吸收峰。其中KOS與KGM相比在1 252、1 153、1 061 cm－1處產(chǎn)生了特征峰，結(jié)構(gòu)與KGM變化不大，而聚合度顯著降低［26］；而D-KGM與KGM相比，除1 730 cm－1左右的乙?；逋庀猓渌逋耆嗤?，說(shuō)明用堿處理KGM主要作用在乙酰基上，即將乙酰基脫除，得到D-KGM。

2.2發(fā)酵液pH值測(cè)定結(jié)果

圖2　發(fā)酵液最終pH值的比較Fig.2 Comparison of pH in final anaerobic fermentation broths

由圖2可知，經(jīng)過(guò)24 h發(fā)酵，含有不同碳源的發(fā)酵液pH值存在一定的差異，其中陰性對(duì)照組與D-KGM組pH值最大，KGM組最小。陰性對(duì)照組顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05），而D-KGM組與陰性對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異，KGM組和KOS組顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05），且KGM組與KOS組之間pH值差異不顯著。發(fā)酵液pH值變化與微生物生長(zhǎng)代謝密切相關(guān)［27］，D-KGM組pH值沒(méi)有顯著差異的可能原因是堿處理改變了KGM的結(jié)構(gòu)，使其成為水不溶性物質(zhì)，腸道微生物較難利用。脫乙?；l(fā)的魔芋葡甘聚糖對(duì)腸道微生物的影響涉及其構(gòu)效關(guān)系，還未見(jiàn)相關(guān)的研究報(bào)道，也值得后續(xù)深入探索。

2.3短鏈脂肪酸含量

表2　發(fā)酵液中短鏈脂肪酸含Table 2 The contents of short-chain fatty acids （SCFAs） in anaerobic fermentation broths

表2　發(fā)酵液中短鏈脂肪酸含Table 2 The contents of short-chain fatty acids （SCFAs） in anaerobic fermentation broths

注：同行小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

項(xiàng)目陰性對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組KGM組KOS組D-KGM組乙酸含量/（mmol/L）8.526±0.913a22.651±0.831b32.275±1.054c47.267±1.218d10.045±1.278a丙酸含量/（mmol/L）0.432±0.093a1.079±0.087b1.987±0.084c2.175±0.130c0.466±0.098a丁酸含量/（mmol/L）1.285±0.053a2.304±0.060b3.393±0.071c3.513±0.076c1.305±0.069a戊酸含量/（mmol/L）3.151±0.128a5.159±0.123b6.943±0.141c6.853±0.143c3.259±0.119a總酸含量/（mmol/L）13.393±1.187a31.192±1.101b44.597±1.350c59.808±1.567d15.074±1.564a

由表2可知，KGM組、KOS組和陽(yáng)性對(duì)照組發(fā)酵液中乙酸、丙酸、丁酸和戊酸均高于陰性對(duì)照組（P＜0.05），而在各發(fā)酵液中乙酸含量最高，戊酸含量次之，丙酸含量最低。另外可以發(fā)現(xiàn)D-KGM組乙酸、丙酸、丁酸和戊酸含量均顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05），與陰性對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；KOS組與KGM組相比，KOS組中乙酸含量顯著高于KGM組（P＜0.05），而對(duì)于丙酸、丁酸，KOS組均略高于KGM組，KGM組中戊酸較KOS組高，差異不顯著（P＞0.05）。從總酸含量可以看出，KOS組顯著高于其他各組（P＞0.05），D-KGM組和陰性對(duì)照組不存在顯著性差異（P＞0.05）。

2.4微生物數(shù)量變化

表3　發(fā)酵液中微生物相對(duì)含量Table 3 Microbial quantities in anaerobic fermentation broth

表3　發(fā)酵液中微生物相對(duì)含量Table 3 Microbial quantities in anaerobic fermentation broth

注：同列小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。表中數(shù)據(jù)是相對(duì)陽(yáng)性對(duì)照組的微生物含量。

組別梭狀桿菌乳酸菌雙歧桿菌大腸桿菌擬桿菌陰性對(duì)照組0.112±0.061a0.237±0.065a0.318±0.071a0.454±0.072a0.485±0.067a陽(yáng)性對(duì)照組1.000±0.091b1.000±0.087b1.000±0.079b1.000±0.096b1.000±0.092bKGM組0.291±0.097c5.089±0.396c2.905±0.198c1.007±0.069b0.624±0.079aKOS組0.483±0.085d8.785±0.545d5.891±0.404d1.253±0.191b1.032±0.083bD-KGM組0.119±0.073a0.242±0.079a0.329±0.093a0.568±0.068a0.227±0.184a

由表3可知，KGM組、KOS組和陽(yáng)性對(duì)照組中梭狀芽孢桿菌、乳酸菌、雙歧桿菌、大腸桿菌和擬桿菌的數(shù)量均顯著高于陰性對(duì)照組（P＜0.05），而D-KGM組中的細(xì)菌數(shù)量與陰性對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；對(duì)于雙歧桿菌和乳酸菌來(lái)說(shuō)，KGM組和KOS組均顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05），KGM組中乳酸菌和雙歧桿菌相對(duì)含量分別約為陽(yáng)性對(duì)照組的5 倍和3 倍，KOS組中乳酸菌和雙歧桿菌的數(shù)量分別是陽(yáng)性對(duì)照組的9 倍和6 倍；從KGM和KOS兩組比較發(fā)現(xiàn)，KOS組中雙歧桿菌和乳酸菌的數(shù)量都顯著高于KGM組（P＜0.05），同樣的現(xiàn)象也在梭狀芽孢桿菌、擬桿菌和大腸桿菌中可以觀察到。通過(guò)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線的檢驗(yàn)，樣品的擴(kuò)增曲線、熔解曲線較好，不存在雜峰，可以證明實(shí)驗(yàn)選用的PCR引物沒(méi)有非特異性擴(kuò)增的影響。

3　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)盲腸內(nèi)容物體外厭氧發(fā)酵，從發(fā)酵液pH值、短鏈脂肪酸、微生物數(shù)量來(lái)研究KGM及其衍生物--KOS和D-KGM的發(fā)酵特性，進(jìn)而評(píng)價(jià)其腸道益生作用。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，KGM和KOS對(duì)雙歧桿菌和乳酸菌有明顯的增殖作用，乳酸菌的含量分別為陽(yáng)性對(duì)照的5 倍和9 倍，雙歧桿菌為陽(yáng)性對(duì)照組的3 倍和6 倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)腸道中潛在的致病菌梭狀芽孢桿菌、大腸桿菌和擬桿菌的增殖作用，同時(shí)可以促進(jìn)乙酸、丙酸、丁酸和戊酸的產(chǎn)生，降低發(fā)酵液pH值，這些都可以說(shuō)明KOS 和KGM對(duì)腸道健康有潛在積極作用，具有顯著的益生功能。

綜上所述，以KOS和KGM形式食用，可以很好的發(fā)揮腸道益生功能，而以堿處理KGM脫乙酰基得到D-KGM后，這可能是由于堿處理改變了魔芋葡甘聚糖的分子結(jié)構(gòu)，并使其形成較大的顆粒狀，難溶于水，使其難以被腸道微生物利用。

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Evaluation of Prebiotic Functions of Konjac Glucomannan and Its Derivatives by Fermentation in vitro

QIN Qingjuan1， DENG Li1， XU Xiaoqing1， WANG Xiaoyan1， ZHONG Geng1，2，3，*
（1. College of Food Science， Southwest University， Chongqing 400716， China； 2. National Undergraduate Experiment Teaching Demonstration Center of Food Science and Engineering， Southwest University， Chongqing 400716， China；3. Chongqing Special Food Engineeri ng Technology Research Center， Chongqing 400716， China）

Objective： To evaluate the prebiotic functions of konjac glucomannan （KGM）， konjac oligosaccharides， and deacetyled konjac glucomannan （D-KGM） in the intestine. Methods： Anaerobic fermentation in vitro with the fresh mouse cecum contents was carried out using 1 g/100 mL KGM， KOS and D-KGM as carbon sources， respectively. The pH，bacterial enumeration， and short-chain fatty acids （SCFAs） of the fermented broth were measured. Results： Compared with the positive control （with GLU as carbon source）， the pH of the fermented broths with KGM and KOS was much lower. Meanwhile， SCFAs， lactobacilli and bifidobacteria increased significantly， while the potentially pathogenic bacteria（Escherichia coli， Bacterium fusiformis and Bacteroidetes） did not change obviously. The broth of D-KGM presented no obvious difference compared with the negative control （without carbon source）. Conclusion： The prebi otic functions of KGM and KOS are conspicuous， but D-KGM has no prebiotic function.

konjac glucomannan （KGM）； konjac oligosaccharides （KOS）； deacetyled konjac glucomannan （D-KGM）；prebiotic function； fermentation in vitro

TS202.1

A

1002-6630（2015）15-0217-04

10.7506/spkx1002-6630-201515040

2014-09-10

重慶市“121”科技示范工程項(xiàng)目（cstc2014zktjccxyyBX0032）

秦清娟（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：825681973@qq.com

鐘耕（1964—），男，教授，博士后，研究方向?yàn)榧Z食、油脂、植物蛋白。E-mail：zhongdg@126.com