孫 婷，楊 英，王華林，汪海濤，吳學(xué)鳳，張 旻，陳小舉，潘麗軍，姜紹通，李興江，*

（1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.安徽建筑大學(xué)環(huán)境與能源工程學(xué)院，安徽 合肥 230601）

利用玉米芯水解液產(chǎn)蘋(píng)果酸的戴爾根霉突變菌株選育及代謝分析

孫 婷1，楊 英2，王華林1，汪海濤1，吳學(xué)鳳1，張 旻1，陳小舉1，潘麗軍1，姜紹通1，李興江1，*

（1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.安徽建筑大學(xué)環(huán)境與能源工程學(xué)院，安徽 合肥 230601）

誘變篩選發(fā)酵玉米芯水解液高產(chǎn)蘋(píng)果酸的根霉屬菌株，并對(duì)其進(jìn)行代謝分析，研究其高產(chǎn)蘋(píng)果酸的機(jī)理。對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行ITS序列鑒定，進(jìn)一步利用軟X射線輻射對(duì)菌種進(jìn)行誘變篩選、對(duì)出發(fā)菌株和突變菌株的相關(guān)酶活力進(jìn)行測(cè)定及代謝通量分析。利用軟X射線輻射結(jié)合丙烯醇平板篩選乙醇脫氫酶缺陷型菌株，得到突變株-1，發(fā)現(xiàn)其乙醇脫氫酶基因的3 處密碼子突變?yōu)椤癟AA”，阻斷了突變菌株的乙醇代謝途徑。進(jìn)而利用軟X射線輻射結(jié)合氟乙酸平板篩選乙醛酸循環(huán)缺陷型菌株，得到復(fù)合突變株-2，降低了副產(chǎn)物富馬酸及琥珀酸的產(chǎn)量。復(fù)合突變株-2的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶中幾處NADP（H）結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變，增加了糖酵解和磷酸戊糖兩種途徑的相互作用，促進(jìn)了其戊糖代謝。經(jīng)過(guò)兩步分離篩選，得到的復(fù)合突變株-2能發(fā)酵玉米芯水解液高產(chǎn)蘋(píng)果酸，且減少了副產(chǎn)物乙醇、富馬酸、琥珀酸的生成。復(fù)合突變株-2的蘋(píng)果酸產(chǎn)量占代謝物總產(chǎn)量的比例由出發(fā)菌株的71%增加到91%，蘋(píng)果酸產(chǎn)量增大1倍，研究成果對(duì)工業(yè)化利用突變菌株生產(chǎn)蘋(píng)果酸具有重要意義。

蘋(píng)果酸；玉米芯水解液；代謝通量分析；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶

蘋(píng)果酸是一種重要的有機(jī)酸，廣泛運(yùn)用于食品和化學(xué)等領(lǐng)域。與檸檬酸相比，蘋(píng)果酸酸度大、產(chǎn)熱低，味道柔和、持久且具特殊香味，被譽(yù)為“最理想的食品酸味劑”［1］。目前制備蘋(píng)果酸的方法主要有2 種［2-3］：一是一步發(fā)酵法，利用霉菌直接發(fā)酵糖質(zhì)原料產(chǎn)蘋(píng)果酸；二是兩步發(fā)酵法，利用2 種不同功能的微生物，將糖質(zhì)原料先轉(zhuǎn)化為延胡索酸，再轉(zhuǎn)化為蘋(píng)果酸。其中一步發(fā)酵法篩選出高效菌株是關(guān)鍵，也是難點(diǎn)所在，兩步發(fā)酵法對(duì)發(fā)酵條件要求很?chē)?yán)格，且發(fā)酵周期長(zhǎng)，產(chǎn)酸率較低，蘋(píng)果酸對(duì)糖的產(chǎn)率一般為60%左右，副產(chǎn)物也較多，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。而一步發(fā)酵法可以避免上述的缺點(diǎn)，且產(chǎn)物安全性高，備受消費(fèi)者青睞。因此，基于可再生非糧生物質(zhì)原料一步發(fā)酵法制備蘋(píng)果酸更有潛力，這也是本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新所在，分離篩選出的戴爾根霉突變菌株可利用生物質(zhì)原料一步發(fā)酵產(chǎn)蘋(píng)果酸，產(chǎn)量高且副產(chǎn)物低。在中國(guó)，每年有100萬(wàn)t的玉米芯廢棄物，利用率低，隨著發(fā)酵技術(shù)進(jìn)步，可以利用玉米芯水解液發(fā)酵產(chǎn)蘋(píng)果酸。這對(duì)食品、化學(xué)領(lǐng)域都具有重要意義［4］。

國(guó)內(nèi)外有關(guān)生物質(zhì)原料發(fā)酵有機(jī)酸的報(bào)道很多，研究最熱的是米根霉發(fā)酵產(chǎn)乳酸，但尚未有關(guān)于生物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)蘋(píng)果酸的報(bào)道。Maas等［5］利用小麥秸稈水解液發(fā)酵產(chǎn)乳酸，木糖利用率10.3 g/L，葡萄糖利用率19.2 g/L，最終產(chǎn)乳酸6.8 g/L，乙醇5.7 g/L，產(chǎn)量低且副產(chǎn)物多；Park等［6］用辦公廢紙水解液（包括82.8 g/L葡萄糖、7 g/L木糖、3.4 g/L纖維二糖）發(fā)酵產(chǎn)49.1 g/L的乳酸，發(fā)酵產(chǎn)量有待進(jìn)一步提高；Bai Dongmei等［7］利用玉米芯水解液發(fā)酵60 h可產(chǎn)乳酸65 g/L，說(shuō)明玉米芯相對(duì)于其他生物質(zhì)原料更具發(fā)酵潛力。以上研究雖然不是發(fā)酵產(chǎn)蘋(píng)果酸，但是由于發(fā)酵菌株的同源性以及五、六碳糖代謝的相似性，故具有很高的借鑒意義［8］。

本實(shí)驗(yàn)分離得到一株能發(fā)酵玉米芯水解液產(chǎn)蘋(píng)果酸的根霉菌株。但作為生產(chǎn)菌種，其代謝過(guò)程伴隨大量副產(chǎn)物生成。本實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)是以其作為出發(fā)菌株進(jìn)行準(zhǔn)確的代謝分析，通過(guò)胞內(nèi)代謝通路及關(guān)鍵酶基因操作定向選育突變菌株［9］。采用物理輻射誘變結(jié)合化學(xué)試劑篩選的方法，通過(guò)改變代謝酶活性來(lái)調(diào)控代謝過(guò)程，以達(dá)到降低副產(chǎn)物形成、提高蘋(píng)果酸產(chǎn)量的目的。關(guān)鍵酶基因表征分析解釋了關(guān)鍵酶活性變化的實(shí)質(zhì)，進(jìn)一步解釋了突變菌株產(chǎn)物、副產(chǎn)物的代謝流量變化，關(guān)鍵酶基因操作對(duì)代謝通量改變、代謝途徑變化、代謝網(wǎng)絡(luò)建立都具重要意義，也是初級(jí)代謝網(wǎng)絡(luò)建立的科學(xué)聚焦之處。

本實(shí)驗(yàn)在代謝途徑和代謝通量分析的基礎(chǔ)上，圍繞關(guān)鍵點(diǎn)定向選育菌株，降低了富馬酸、琥珀酸、乙醇的產(chǎn)量，促進(jìn)了五碳糖和六碳糖共代謝，增加了蘋(píng)果酸產(chǎn)量，為實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化打下了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

原始菌株分離自豐原集團(tuán)發(fā)酵工廠的發(fā)酵污染液，后由合肥工業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工研究院紹通菌種保藏中心誘變選育及保存。

1.1.2培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L 、瓊脂20 g/L，自然pH值；分離培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L、 溴甲酚綠0.1 g/L、自然pH值；發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米芯水解液125 g/L、（NH4）2SO42 g/L、 K2HPO40.8 g/L、MgSO40.3 g/L、ZnSO40.2 g/L、CaCO3調(diào)pH值至5.0。

1.1.3玉米芯水解液

玉米芯由豐原集團(tuán)收集，切碎碾磨成直徑小于1.0 mm的顆粒，進(jìn)行稀酸酸解和酶解。取原料1 000 g，按照固液比1∶5（m/V）的比例加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的稀酸，攪拌速率100 r/min，高壓罐中160 ℃持續(xù)加壓20 s后，減壓蒸汽爆破。經(jīng)洗滌的固體殘?jiān)?2 ℃條件下酶解，所用酶為纖維素酶（Genencor，Spezyme CP）和真菌的β-葡萄糖苷酶（Novozym 188，Novozymes A/S），攪拌速率120 r/min，持續(xù)72 h。1 000 g玉米芯得約450 g總糖（葡萄糖與木糖比例約4∶1），將總糖濃縮成約125 g/L（含葡萄糖100 g/L和木糖25 g/L）用作進(jìn)一步發(fā)酵。

1.2儀器與設(shè)備

E2695高效液相色譜儀 沃特斯中國(guó)有限公司；Aminex HPX-87糖分析柱 北京京京未來(lái)科技發(fā)展有限公司；1790氣相色譜儀 北京興延誠(chéng)博科技有限公司；MicroSpin S-400 HR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)柱 沃特曼公司；721型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；YX280A全自動(dòng)高壓滅菌鍋 上海三申儀器有限公司；ZC-100B恒溫氣浴搖床 上海申勝生物技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1菌株分離

從豐原集團(tuán)20 m3染菌的檸檬酸發(fā)酵罐中取100 mL發(fā)酵液于250 mL三角瓶中，32 ℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)2 d，搖瓶?jī)?nèi)壁挑取菌絲通過(guò)含有溴甲酚綠的PDA培養(yǎng)基分離。

1.3.2菌株誘變與篩選

菌株培養(yǎng)3 d（1.3.1節(jié)得到的菌株），挑取孢子在軟X射線下輻射2 min（物理射線技術(shù)支持由中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)提供）。將孢子稀釋并涂布到含有丙烯醇的培養(yǎng)基平板上（15 g/L瓊脂、2～10 mL/L丙烯醇），篩選存活細(xì)胞菌落用于進(jìn)一步的研究；將上一步軟X射線輻射誘變得到的菌株涂布于氟乙酸平板上（15 g/L瓊脂，5～30 g/L氟乙酸），30 ℃培養(yǎng)30 h，篩選出生長(zhǎng)旺盛的突變菌株。

1.3.3發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)

發(fā)酵采用15 L發(fā)酵罐，裝液量10 L，接種量1 L（孢子懸液體積分?jǐn)?shù)10%），發(fā)酵溫度30 ℃，通氣量0.4 L/（L·min），攪拌速率500 r/min。

1.3.4ITS序列分析

從凍干的細(xì)胞中提取DNA，進(jìn)行ITS序列（18S rDNA和5.8S rDNA間的ITS1，5.8S rDNA和28S rDNA間的ITS2）分析，測(cè)序采用引物參考相關(guān)文獻(xiàn)［10］，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物純化用MicroSpin S-400 HR柱。ITS序列測(cè)序由寶生物工程（大連）有限公司完成，并通過(guò)GenBank中BLAST程序進(jìn)行相似性分析。

1.3.5系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)前將樣本序列保存為txt文本文件，序列只包含序列字母（ATCG或氨基酸簡(jiǎn)寫(xiě)字母），然后將需要構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)的序列導(dǎo)入MEGA軟件，DNA序列進(jìn)行比對(duì)后選擇NJ法進(jìn)行構(gòu)建，選擇Kimura 2-parameter模型，Bootstrap次數(shù)為1 000，最終生成系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖。

1.3.6代謝通量分析

代謝通量分析用于計(jì)算形成的胞內(nèi)代謝物：ATF=r，式中：r為網(wǎng)絡(luò)中形成的代謝產(chǎn)物速率/（mmol/（g·h））；F為內(nèi)部反應(yīng)速率/（mmol/（g·h））；A為所有反應(yīng)物和生成物的總化學(xué)計(jì)量矩陣；T為系統(tǒng)運(yùn)算符號(hào)。代謝通量的計(jì)算可以利用Excel 2007中的MMULT和MINVERSE函數(shù)或者M(jìn)atlab軟件。

1.3.7細(xì)胞生物量測(cè)定

發(fā)酵液過(guò)濾得殘?jiān)?，?.01 mol/L的HCl溶液充分洗滌，除去過(guò)量CaCO3，再用蒸餾水洗滌，得殘留菌體，于80 ℃烘干至恒質(zhì)量，得到菌體細(xì)胞生物量。

1.3.8殘?zhí)羌坝袡C(jī)酸含量測(cè)定

利用Aminex HPX-87H柱進(jìn)行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析。洗脫劑：5 mmol/L H2SO4，流速：0.5 mL/min，溫 度：65 ℃。配制0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 g/L殘?zhí)羌坝袡C(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)HPLC分析后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此計(jì)算發(fā)酵液中殘?zhí)羌坝袡C(jī)酸含量。

1.3.9乙醇含量測(cè)定

采用1790氣相色譜儀，色譜柱采用DB-WAX毛細(xì)管柱，N2為載氣，流速為15 mL/min，進(jìn)樣器溫度240 ℃，柱溫220 ℃，檢測(cè)溫度250 ℃，進(jìn)樣量1 μL，分流比1∶100，外標(biāo)法定量。

1.3.10蛋白質(zhì)含量測(cè)定

［11］，采用布拉德福德法測(cè)定發(fā)酵液蛋白質(zhì)含量。

1.3.11酶活力檢測(cè)

木糖還原酶（xylose reductase，XR）活力測(cè)定參考文獻(xiàn)［12］，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH）活力測(cè)定參考文獻(xiàn)［13］，異檸檬酸裂解酶活力測(cè)定參考文獻(xiàn)［14］，蘋(píng)果酸脫氫酶活力測(cè)定參考文獻(xiàn)［15］，丙酮酸羧化酶活力測(cè)定參考文獻(xiàn)［16］，琥珀酸脫氫酶活力測(cè)定參考文獻(xiàn)［17］，富馬酸水合酶活力測(cè)定參考文獻(xiàn)［18］。檸檬酸合成酶、烏頭水合酶（aconitate hydratase，ACO）、蘋(píng)果酸酶、乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）、α-酮戊二酸脫氫酶、磷酸果糖激酶、蘋(píng)果酸合成酶活力均利用試劑盒測(cè)定。

1.3.12相關(guān)酶基因檢測(cè)

基因組DNA是從冷凍干燥的細(xì)胞中提取并進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序。引物序列如下：ADH引物分別為A1和A2（A1：5'-ATGTCTGAAGAAAC-3'，A2：5'-TTAGTTCATGACGAG-3'）；ACO引物分別為K1和K2（K1：5'-ATGATCTCTGCTTAT'，K2：5'-TCACACATGGTTAAT-3'）；G6PDH引物分別為P1和P2（P1：5'-ATGTCGCATGAAAGTTAC-3'，P2：5'-TTAAAGCTTGTTGGAAGA-3'）；XR引物分別為X1和X2（X1：5'-ATGGAAGAATATGCGC-3'，X2：5'-TTATTTACTCAAATCATG-3'）。

2　結(jié)果與分析

2.1出發(fā)菌株Rhizopus delemar HF-119的分離及代謝分析

2.1.1出發(fā)菌株的分離鑒定

從豐原集團(tuán)20 m3染菌的檸檬酸發(fā)酵罐中取100 mL發(fā)酵液于250 mL搖瓶培養(yǎng)2 d，搖瓶?jī)?nèi)壁挑取菌絲通過(guò)含有溴甲酚綠的PDA培養(yǎng)基分離，挑取生長(zhǎng)旺盛的菌株進(jìn)一步分離，篩選得到產(chǎn)生大的黃色透明圓圈的菌株，如圖1所示。

圖1　分離得到出發(fā)菌株Fig.1 Isolated colonies of the parent strain

圖2　出發(fā)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of the parent strain

如圖2所示，將出發(fā)菌株的ITS區(qū)域序列結(jié)果提交到GenBank進(jìn)行分析，結(jié)果顯示出發(fā)菌株與已有根霉屬幾種菌有99%的高度同源性，分析發(fā)現(xiàn)出發(fā)菌株代謝過(guò)程涉及的相關(guān)酶也較為相近，尤其與戴爾根霉菌較相近，故命名為根霉屬中的戴爾根霉菌Rhizopus delemar HF-119（后統(tǒng)稱(chēng)出發(fā)菌株），將其序列與相近菌株序列進(jìn)行比對(duì)，運(yùn)用MEGA軟件采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2.1.2出發(fā)菌株的基本碳源利用情況

以下面4 種碳源進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸：玉米芯水解液125 g/L、葡萄糖+木糖（葡萄糖100 g/L、木糖25 g/L）、葡萄糖（分析級(jí)）100 g/L、木糖（分析級(jí)）25 g/L。發(fā)酵結(jié)果如圖3、4所示。

圖3　以生物質(zhì)糖源與分析級(jí)糖源為碳源的蘋(píng)果酸產(chǎn)量（A）、菌體生物量（B）和碳源殘余量（C）的比較Fig.3 Malate output （A）， BM synthesis （B） and consumption of carbon source （C） from corn cob hydrolysate and analytical-grade sugars

圖4　4 種碳源的消耗情況比較Fig.4 Comparison of consumption of four carbon sources

由圖3、4可知，葡萄糖100 g/L、木糖25 g/L的混合糖源與玉米芯水解液相比，蘋(píng)果酸產(chǎn)量、產(chǎn)酸率略高、菌體生物量略低，碳源的消耗速率大體相同，二者差異并不顯著，故以混合的葡萄糖+木糖作為發(fā)酵原料代替玉米芯水解液進(jìn)行代謝流量分析，減少玉米芯水解液中未知成分對(duì)于代謝流量所造成的影響。圖4顯示發(fā)酵進(jìn)行60 h后，25 g/L的木糖還剩下16.5 g/L，且蘋(píng)果酸產(chǎn)量與細(xì)胞生物都很低，說(shuō)明分離的出發(fā)菌株可以利用木糖發(fā)酵，但發(fā)酵效率還需通過(guò)誘變篩選進(jìn)一步增強(qiáng)。

2.1.3出發(fā)菌株的發(fā)酵進(jìn)程研究

在出發(fā)菌株發(fā)酵的過(guò)程中，檢測(cè)葡萄糖、木糖消耗量，蘋(píng)果酸、富馬酸、乙醇產(chǎn)量及菌體生物量，結(jié)果如圖5所示。出發(fā)菌株主要代謝產(chǎn)物為蘋(píng)果酸，發(fā)酵60 h時(shí)蘋(píng)果酸質(zhì)量濃度達(dá)到60.5 g/L，但同時(shí)也伴隨大量富馬酸、乙醇等副產(chǎn)物生成。木糖被消耗證明該菌株的磷酸戊糖途徑（hexose monophophate pathway，HMP）被激活，后續(xù)誘變篩選可圍繞增強(qiáng)HMP途徑開(kāi)展。

2.1.4出發(fā)菌株的代謝酶活力分析

表1　關(guān)鍵酶活力分析Table 1 Key enzyme activity analysis of the parent strain

檢測(cè)出發(fā)菌株相關(guān)酶活力，結(jié)果如表1所示。分析表中酶活力可知，出發(fā)菌株蘋(píng)果酸生成來(lái)自以下三部分：1）由草酰乙酸轉(zhuǎn)化得到，因?yàn)镻C和MDH活性較高；2）由丙酮酸合成，因ME活性較高；3）由乙醛酸循環(huán)中ISOC催化得到，因?yàn)闊o(wú)KDH活性，三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）受阻，檢測(cè)到CS、ACO、ISOC、MS活性，說(shuō)明存在乙醛酸循環(huán)。同時(shí)產(chǎn)生副產(chǎn)物富馬酸和琥珀酸是由于缺少α-KDH和FUMH，只能通過(guò)乙醛酸循環(huán)中ISOC催化得到。XR、XDH、XK是木糖轉(zhuǎn)化為5-磷酸木酮糖的關(guān)鍵酶，也是HMP途徑的重要部分，說(shuō)明該出發(fā)菌株可進(jìn)行木糖代謝。

2.1.5出發(fā)菌株的代謝途徑分析及代謝網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在出發(fā)菌株關(guān)鍵酶活力分析基礎(chǔ)上，結(jié)合研究已經(jīng)較為透徹的蘋(píng)果酸代謝途徑分析。首先，菌株代謝潛力明顯，即菌株代謝入口具備五、六碳糖共代謝特征，這為廣譜的生物質(zhì)轉(zhuǎn)化提供了可能。其次，菌株蘋(píng)果酸合成來(lái)源多樣化，尤其上游的丙酮酸羧化途徑及蘋(píng)果酸酶合成途徑均是典型的CO2固定化途徑，使得菌株具備較高的碳得率的優(yōu)勢(shì)，進(jìn)一步構(gòu)建代謝網(wǎng)絡(luò)（圖6）。

圖6　出發(fā)菌株的代謝網(wǎng)絡(luò)［199--2211］Fig.6 Metabolic network for the parent strain［19-21］

在生物反應(yīng)方程式與主要產(chǎn)物分析的基礎(chǔ)上繪制出發(fā)菌株的基本代謝途徑，通過(guò)關(guān)鍵酶分析建立代謝網(wǎng)絡(luò)模型。圖6中清晰顯示蘋(píng)果酸主要來(lái)自3 條途徑，分別對(duì)應(yīng)蘋(píng)果酸1、蘋(píng)果酸2、蘋(píng)果酸3，副產(chǎn)物富馬酸、檸檬酸、琥珀酸、乙醇對(duì)應(yīng)的代謝途徑是主要改造對(duì)象，尤其是糖酵解與HMP途徑相偶聯(lián)的NADPH生成途徑，為菌株能量平衡帶來(lái)了重要的調(diào)控突破點(diǎn)。

2.1.6出發(fā)菌株的代謝通量分析

根據(jù)生物反應(yīng)式及建立的代謝網(wǎng)絡(luò)列出代謝通量方程式，如表2所示。

表2　代謝通量方程式Table 2 Metabolic flux equations

表2列出60 個(gè)流量方程式及其流量值。其中41 個(gè)方程式（（1）～（41））從基礎(chǔ)質(zhì)量平衡的生物反應(yīng)式中獲得，另外11 個(gè)方程系數(shù)參考文獻(xiàn)［19-21］獲得。其他方程式（包括底物攝入（53）、（54），產(chǎn)物輸出（55）～（59），檢測(cè)生物量（60））都是直接測(cè)得的。本實(shí)驗(yàn)計(jì)算這部分的數(shù)據(jù)通過(guò)用代謝物凈變化量趨于穩(wěn)定的量除以該穩(wěn)定階段的時(shí)間獲得。細(xì)胞生物量幾乎在40～50 h時(shí)固定，特別選擇此時(shí)期進(jìn)行代謝通量分析。整個(gè)體系通量數(shù)據(jù)有60 個(gè)相對(duì)應(yīng)的反應(yīng)式，通過(guò)矩陣計(jì)算這些通量如表3所示。

表3　代謝通量數(shù)據(jù)Table 3 Original metabolic flux data（mmol/（g·h））

出發(fā)菌株的通量數(shù)據(jù)如表3第一列所示，代謝通量最多的是蘋(píng)果酸，主要通過(guò)以下3 條途徑得到，其中75%的蘋(píng)果酸來(lái)自草酰乙酸，18%來(lái)自乙醛酸，7%來(lái)自丙酮酸。副產(chǎn)物乙醇和富馬酸代謝通量高，需進(jìn)一步消弱。木糖的代謝通量為0.059 5 mmol/（g·h），與葡萄糖相比消耗量低，說(shuō)明HMP途徑需進(jìn)一步加強(qiáng)。

2.2突變株-1的選育及代謝分析

2.2.1突變株-1的選育

軟X射線誘變出發(fā)菌株 ，選取丙烯醇含量為2、4、6、8、10 mL/L的平板進(jìn)行菌株篩選，結(jié)果表明丙烯醇含量過(guò)低抑制效果不明顯，丙烯醇含量在6 mL/L時(shí)，出發(fā)菌株即被顯著抑制，基本不生長(zhǎng)，少數(shù)缺陷型突變株生長(zhǎng)，因而選擇6 mL/L丙烯醇進(jìn)行誘變篩選。

2.2.2突變株-1的發(fā)酵進(jìn)程分析

軟X射線輻射結(jié)合丙烯醇誘變出發(fā)菌株得到突變株-1，繪制突變株-1的發(fā)酵進(jìn)程曲線并和出發(fā)菌株進(jìn)行基礎(chǔ)發(fā)酵參數(shù)比較，結(jié)果如圖7所示。

圖7　突變株-1的發(fā)酵進(jìn)程Fig.7 Time course of fermentation by mutant strain-1

與出發(fā)菌株相比，突變株-1在發(fā)酵時(shí)間、菌體生物量、殘?zhí)呛康劝l(fā)酵參數(shù)上基本沒(méi)有變化，但蘋(píng)果酸產(chǎn)量顯著增加，副產(chǎn)物乙醇質(zhì)量濃度明顯減少。結(jié)合表3的代謝通量數(shù)據(jù)可知，蘋(píng)果酸通量由出發(fā)菌株的1.056 5 mmol/（g·h）增加到1.388 5 mmol/（g·h）（F3），主要由于來(lái)自草酰乙酸這部分的通量從0.785 7 mmol/（g·h）增加到1.086 3 mmol/（g·h）（F41）。

2.2.3突變株-1的相關(guān)酶活力分析

為了解釋代謝通量機(jī)制，測(cè)定突變株-1的相關(guān)酶活力并與出發(fā)菌株酶活力進(jìn)行比較，結(jié)果如圖8所示。

圖8　出發(fā)菌株與突變株-1的相關(guān)酶參數(shù)Fig.8 Key enzyme activities involved from the parent strain and mutant strain-1

與出發(fā)菌株相比，突變株-1的乙醇脫氫酶（ADH）活力從259.4 U/mg減少至0，引起乙醇急劇減少，丙酮酸羧化酶（PC）活力從265.6 U/mg增加到304.6 U/mg，蘋(píng)果酸脫氫酶（MDH）活力從623.0 U/mg增加為666.3 U/mg。這些關(guān)鍵酶活力的改變對(duì)應(yīng)引起代謝通量和代謝物產(chǎn)量的變化。

2.2.4突變株-1的突變基因表征

乙醇脫氫酶可以將丙烯醇轉(zhuǎn)化為對(duì)細(xì)胞有致死毒性的丙烯醛，常采用此方法進(jìn)行乙醇阻斷選育，篩選到能在丙烯醇平板上良好生長(zhǎng)的突變株，往往其乙醇脫氫酶發(fā)生了不可逆的致死性突變。對(duì)乙醇脫氫酶的基因進(jìn)一步研究，分析比較出發(fā)菌株和突變株-1的乙醇脫氫酶基因序列，NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）登錄號(hào)分別為KF060237和KF060238。對(duì)比發(fā)現(xiàn)在突變株-1的乙醇脫氫酶基因中有3 處密碼子（GAA、GAA、CAA）突變成了“TAA”，導(dǎo)致了乙醇脫氫酶活力的改變。

2.3復(fù)合突變株-2的選育及代謝分析

2.3.1復(fù)合突變株-2的選育

采用軟X射線誘變突變株-1，選取氟乙酸質(zhì)量濃度為5、7、10、12、15 g/L的平板進(jìn)行菌株篩選，結(jié)果表明氟乙酸質(zhì)量濃度過(guò)低時(shí)其抑制作用不明顯，當(dāng)氟乙酸質(zhì)量濃度為7 g/L時(shí)，出發(fā)菌株出現(xiàn)被顯著抑制，基本不生長(zhǎng)的現(xiàn)象，因而選擇7 g/L氟乙酸進(jìn)行誘變篩選，挑取那些在此條件下能夠生長(zhǎng)的缺陷型突變株。

2.3.2復(fù)合突變株-2的發(fā)酵進(jìn)程分析

軟X射線輻射結(jié)合氟乙酸誘變突變株-1得到復(fù)合突變株-2，繪制復(fù)合突變株-2的發(fā)酵進(jìn)程曲線并和出發(fā)菌株、突變株-1進(jìn)行基礎(chǔ)發(fā)酵參數(shù)比較，如圖9、10所示。

圖9　復(fù)合突變株-2的發(fā)酵進(jìn)程Fig.9 Time course of fermentation by mutatnt strain-2

圖10　出發(fā)菌株、突變株-1及復(fù)合突變株-2的基礎(chǔ)發(fā)酵參數(shù)比較Fig.10 Basic fermentation parameters from the parent strain， mutant strain-1 and mutant strain-2

經(jīng)過(guò)誘變篩選得到復(fù)合突變株-2，將其與出發(fā)菌株、突變株-1進(jìn)行基礎(chǔ)發(fā)酵參數(shù)的比較，發(fā)現(xiàn)復(fù)合突變株-2在發(fā)酵時(shí)間、菌體生物量、殘?zhí)呛糠矫婊緵](méi)有變化，但蘋(píng)果酸產(chǎn)量由60.5 g/L增加到122 g/L，副產(chǎn)物乙醇、富馬酸產(chǎn)量明顯減少，木糖代謝途徑得到增強(qiáng)，此外還具有一定量的檸檬酸生成。

2.3.3復(fù)合突變株-2的代謝通量分析

復(fù)合突變株-2代謝通量如表3所示，復(fù)合突變株-2的蘋(píng)果酸通量由1.388 5 mmol/（g·h）增加到2.162 7 mmol/（g·h）（F3），其中從丙酮酸轉(zhuǎn)化成蘋(píng)果酸的通量由0.0 7 2 1 m m o l/（g·h）增 加到0.422 3 mmol/（g·h）（F34），從草酰乙酸轉(zhuǎn)化成蘋(píng)果酸的通量由1.086 3 mmol/（g·h）增加到1.711 8 mmol/（g·h）（F41），從乙醛酸轉(zhuǎn)化成蘋(píng)果酸的通量從0.230 1 mmol/（g·h）減少到0.028 7 mmol/（g·h）（F48），這一系列變化有效地減少了副產(chǎn)物生成，增強(qiáng)了木糖代謝途徑。

綜合分析兩次誘變結(jié)果，第一次輻射結(jié)合烯丙醇平板篩選得到突變株-1，與出發(fā)菌株相比，蘋(píng)果酸代謝通量從1.056 5 mmol/（g·h）增加到1.388 5 mmol/（g·h）（F3），增加了31.42%，乙醇代謝通量從0.403 5 mmol/（g·h）減少為0（F43），這說(shuō)明突變株的乙醇代謝途徑被阻斷；琥珀酸由0.039 7 mmol/（g·h）減少至0.015 9 mmol/（g·h）（F50），減少了59.95%，富馬酸由0.158 6 mmol/（g·h）增加到0.214 1 mmol/（g·h）（F58、F59），增加了35.06%，副產(chǎn)物富馬酸的增加可能是由于乙醇代謝途徑阻斷而使得其他代謝途徑增強(qiáng)所致。對(duì)于突變株-1進(jìn)一步進(jìn)行軟X射線輻射結(jié)合氟乙酸篩選得到復(fù)合突變株-2，蘋(píng)果酸代謝通量增加了55.76%，富馬酸代謝通量減少了88.52%，琥珀酸通量減少了74.84%，乙醇代謝通量依然是0。 由此說(shuō)明第二次誘變不僅保證了第一次突變誘變菌株的優(yōu)良性狀，而且進(jìn)一步提高了蘋(píng)果酸產(chǎn)量，降低了富馬酸、琥珀酸產(chǎn)量。整體來(lái)說(shuō)，兩次誘變蘋(píng)果酸代謝通量增加了1.106 2 mmol/（g·h），其中第一次誘變貢獻(xiàn)了30.01%，第二次誘變貢獻(xiàn)了69.99%。

2.3.4復(fù)合突變株-2的關(guān)鍵酶酶活力表征與分析

測(cè)定復(fù)合突變株-2相關(guān)酶活力，與出發(fā)菌株及突變株-1進(jìn)行比較，結(jié)果如圖11所示。

圖11　出發(fā)菌株、突變株-1及復(fù)合突變株-2涉及的關(guān)鍵酶活力分析Fig.11 Key enzyme activities involved from the parent strain， mutant strain-1 and mutant strain-2

復(fù)合突變株-2的ACO活力由88.6 U/mg減少至4.4 U/mg，阻斷了乙醛酸循環(huán)，有效地減少了富馬酸和琥珀酸的生成，ISOC的活力減少進(jìn)一步加強(qiáng)了阻斷效果。PFK的活力從150.5 U/mg減少至120.5 U/mg，降低糖酵解（Embden-Meyerhof-Parnas pathway，EMP）途徑的代謝通量，抑制檸檬酸積累。

復(fù)合突變株-2的蘋(píng)果酸流量合成主途徑主要來(lái)自丙酮酸的羧化及草酰乙酸的氫化，但綜合分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的總體還原力（能量） 處于平衡，并沒(méi)有結(jié)余，則細(xì)胞生長(zhǎng)、活動(dòng)及代謝所需能量必須有其他結(jié)余能量途徑來(lái)彌補(bǔ)，對(duì)突變株的發(fā)酵過(guò)程及代謝通量深入分析發(fā)現(xiàn)木糖代謝得到有效加速以及HMP途徑流速得到顯著提升，其EMP/HMP流量穿梭提升的背后肯定與突變株在此步驟中的代謝關(guān)鍵酶有關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步的酶活力分析表明，突變株的G6PDH（此步驟的關(guān)鍵酶）活力顯著提升。此關(guān)鍵酶具有提供2 倍的還原性H（NADPH）的能力，以此來(lái)彌補(bǔ)突變株-1在乙醛循環(huán)中丟失的還原性H（NAD和FADH），且增加戊糖磷酸途徑的代謝通量。G6PDH能提供木糖還原酶、ME催化過(guò)程中需要的關(guān)鍵輔助因子NADPH，所以某種意義上通過(guò)活化G6PDH能增強(qiáng)木糖與ME代謝。通過(guò)酶基因及酶蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//enzyme. expasy.org）分析表明，該酶蛋白常在90～100的氨基酸序列范圍與NADPH（NADP+）具有較活躍的結(jié)合位點(diǎn)，而通過(guò)對(duì)比復(fù)合突變株-2與出發(fā)菌株的G6PDH關(guān)鍵酶基因序列及氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，復(fù)合突變株-2在第88、92、100、102位發(fā)生了多處突變，這也進(jìn)一步說(shuō)明突變株中該關(guān)鍵酶基因的多處突變與其酶活力改變（包括與NADPH/NADP+的結(jié)合能力）及細(xì)胞能力供給系統(tǒng)的平衡可能是相關(guān)的，從而改變相關(guān)代謝通量。

出發(fā)菌株與復(fù)合突變株-2 ACO基因序列的NCBI登錄號(hào)分別是KF060239和KF060240，G6PDH基因的NCBI登錄號(hào)分別是KF041003和KF041003。綜上所述，ACO基因序列有幾處突變位點(diǎn)引起酶活力的降低，解釋了其下游富馬酸及琥珀酸代謝通量顯著降低的原因；G6PDH基因序列中位于NADP（H）結(jié)合區(qū)域的部分序列發(fā)生突變，增強(qiáng)了其與NADP+的結(jié)合，提高了其催化能力。

3　結(jié) 論

以一步發(fā)酵法產(chǎn)蘋(píng)果酸為基礎(chǔ)，通過(guò)誘變篩選得高產(chǎn)蘋(píng)果酸且副產(chǎn)物減少的復(fù)合突變菌株-2，該菌株由于乙醇脫氫酶突變?nèi)毕萁档土艘掖籍a(chǎn)量，乙醛酸循環(huán)突變?nèi)毕萁档土烁获R酸和琥珀酸產(chǎn)量，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶NADP（H）活動(dòng)位點(diǎn)突變?cè)黾覧MP和HMP相互作用，促進(jìn)了戊糖途徑。經(jīng)過(guò)兩步選育，復(fù)合突變株-2的蘋(píng)果酸產(chǎn)量占代謝物總產(chǎn)量的比例由出發(fā)菌株的71%增加到91%，蘋(píng)果酸產(chǎn)量由出發(fā)菌株的60.5 g/L增加1 倍，大幅度提高了蘋(píng)果酸產(chǎn)量。代謝途徑分析證明復(fù)合突變株-2菌株能利用玉米芯水解液進(jìn)行五、六碳糖共代謝，這對(duì)于農(nóng)業(yè)廢棄物利用具有重要意義。復(fù)合突變株-2產(chǎn)酸量高、副產(chǎn)物低，復(fù)合突變株-2的獲得及代謝選育研究為工業(yè)化生產(chǎn)蘋(píng)果酸提供了一定的理論依據(jù)與應(yīng)用價(jià)值。

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Mutation and Metabolism Analysis for a Malic Acid-Producing Rhizopus delemar Strain Utilizing Corn Cob Hydrolysate

SUN Ting1， YANG Ying2， WANG Hualin1， WANG Haitao1， WU Xuefeng1， ZHANG Min1， CHEN Xiaoju1， PAN Lijun1，JIANG Shaotong1， LI Xingjiang1，*
（1. School of Biotechnology and Food Engineering， Hefei University of Technology， Hefei 230009， China；2. School of Environment and Energy Engineering， Anhui Jianzhu University， Hefei 230601， China）

High-level production of malic acid by fermentation of corn cob hydrolysate with an isolated Rhizopus delemar strain was expected. Then metabolic analysis and research of the underlying mechanism were carried out. Phylogenetic analysis based on ITS region sequences was carried out for the identifi cation of X-ray-induced mutant strains， and the key enzyme activities and metabolic fl ux were also analyzed. The results showed 3 “TAA” codons in the alcohol dehydrogenase gene of the anti-allyl mutant strain， which interrupt the pathway of ethanol metabolism. The breeding for the antifl uoroacetate mutant strain succeeded to decrease the fl ux of fumaric and succinic acid. Some NADP （H）-binding loci were mutated in the G6PDH gene of the mutant， probably leading to increased interaction of Embden-Meyerhof-Parnas pathway with Hexose-Monophophate pathway and improved pentose metabolism. After two-step breeding and regulation for this isolated strain， the production of malic acid was enhanced markedly； the formation of ethanol， fumaric acid and succinic acid were decreased simultaneously. Compared with the parent strain， the proportion of malic acid in mutant strain-2 increased to 91% from 71% and the yield of malic acid was increased markedly， which is of signifi cance for deep industrial development.

malate； corn cob hydrolysate； metabolic fl ux analysis； glucose-6-phosphate dehydrogenase

TS201.3

A

1002-6630（2015）15-0090-08

10.7506/spkx1002-6630-201515018

2014-09-27

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31470002；31371859）

孫婷（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣I(yè)微生物。E-mail：sunting@mail.hfut.edu.cn

李興江（1978—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程代謝調(diào)控。E-mail：lixingjiang1978@hfut.edu.cn