王春偉，葉勝丹

（浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司，浙江杭州　310018 ）

豬瘟活疫苗耐熱保護(hù)劑冷凍干燥技術(shù)研究

王春偉，葉勝丹

（浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司，浙江杭州310018 ）

隨著豬瘟活疫苗耐熱保護(hù)劑的不斷應(yīng)用，凍干技術(shù)的要求也越來(lái)越高。通過(guò)對(duì)凍干工藝的不斷研究，采取預(yù)凍階段快速和慢速降溫，一期升華階段選取不同溫度等方法，篩選一條合適的凍干曲線，不僅縮短凍干時(shí)間，降低生產(chǎn)能耗，而且有利產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，為今后耐熱保護(hù)劑的冷凍干燥提供了研究方向。

冷凍干燥；豬瘟活疫苗；耐熱保護(hù)劑；凍干曲線

我國(guó)于1955年成功研制了豬瘟兔化弱毒疫苗，并于1958年成功研制出了凍干疫苗，以適用于批量生產(chǎn)［1］。在獸用生物制品冷凍干燥過(guò)程中不僅需要一定量的抗原，而且還需要添加一些成分作為凍干保護(hù)劑。凍干保護(hù)劑不僅要具有保護(hù)制品生物學(xué)活性的作用，而且要具有維持制品有一定形狀、抗氧化的作用，其直接與疫苗的質(zhì)量和長(zhǎng)期保存保持穩(wěn)定性相關(guān)聯(lián)［2］。我國(guó)現(xiàn)在常用的獸醫(yī)生物制品保護(hù)劑主要用脫脂奶粉和蔗糖進(jìn)行配制，制品要求低溫保存（-15℃以下），2～8℃僅存3～6 個(gè)月，因此非常不利于產(chǎn)品的使用和保存［3］。為了克服豬瘟活疫苗常規(guī)凍干保護(hù)劑存在的不耐熱、貯藏溫度低、保存期短等缺點(diǎn)，現(xiàn)市場(chǎng)較多企業(yè)推出豬瘟活疫苗（脾淋源）耐熱凍干保護(hù)劑，這大大提高了對(duì)冷凍干燥技術(shù)的要求。我們也多次進(jìn)行了相同耐熱保護(hù)劑不同凍干曲線6次試驗(yàn)，分別標(biāo)記為S1組、S2組、S3組、S4組、S5組、S6組，不斷對(duì)凍干曲線進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，從中篩選出了1 條適合當(dāng)前耐熱保護(hù)劑的最佳凍干曲線。

1　材料與方法

1.1設(shè)備性能與材料

1.1.1凍干機(jī)性能。東富龍Lyo-1型1m2 凍干機(jī)，各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到出廠時(shí)要求即可。

1.1.2凍干材料。豬瘟兔化弱毒株從中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所購(gòu)買，用家兔繼代，脾淋組織毒對(duì)家兔的最小感染量為≤10-5/mL。選擇定型熱和輕型熱反應(yīng)兔，從體溫下降及其以后的24 h內(nèi)剖殺，以無(wú)菌手術(shù)采取脾臟和腸系膜淋巴結(jié)，置于-15℃以下保存?zhèn)溆茫?］。耐熱保護(hù)劑成分以2%明膠、5%蔗糖、2%聚乙烯吡咯烷酮為基礎(chǔ)，均有由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)。對(duì)照組采用常規(guī)5%蔗糖脫脂奶粉保護(hù)劑。

1.2方法

1.2.1要求。要求試驗(yàn)產(chǎn)品和對(duì)照組產(chǎn)品均使用相同批次的組織毒，配苗比例完全一致。

1.2.1.1試驗(yàn)組苗配制。在百級(jí)潔凈環(huán)境下，將采取的脾淋組織先研磨、再用80目銅紗網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，去除殘?jiān)?，與耐熱保護(hù)劑混合均勻后定量分裝，根據(jù)文獻(xiàn)［4］的要求，每頭份脾淋苗不少于組織毒0.01 g，每瓶2.0 mL，每批疫苗配制100瓶左右。

1.2.1.2對(duì)照組苗配制。按以上同樣方法將家兔脾淋組織毒進(jìn)行研磨，然后用80目銅紗網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，再添加5%蔗糖脫脂奶粉保護(hù)劑，每頭份脾淋苗不少于組織毒0.01 g，每瓶2.0 mL，每批疫苗配制100瓶左右。

1.2.2凍干。將6組試驗(yàn)連同對(duì)照組一起采用常溫入箱，預(yù)凍要求、降溫速率、升華溫度（表1），至板層溫度降至-45℃時(shí)控制在此溫度，待制品接近該溫度，開(kāi)始計(jì)時(shí)并保持2 h，目的是使所有制品溫度降至共晶點(diǎn)以下，待制品接近升華溫度該溫度后，可判斷結(jié)束一期升華。

解析干燥使板層溫度控制在25℃保持5 h，或短暫關(guān)閉中隔閥觀察真空上升速率達(dá)到設(shè)計(jì)要求，方可判斷凍干結(jié)束，壓塞釋放真空，結(jié)束該批次凍干（圖1）。

1.2.3成品檢驗(yàn)。凍干后成品按照文獻(xiàn)的要求［4］進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)、真空度測(cè)定、物理性狀、剩余水分以及效力檢驗(yàn)。

1.2.4耐老化穩(wěn)定性試驗(yàn)。將檢驗(yàn)合格的制品置于37℃作耐老化試驗(yàn)，分別保存7天和10天，然后進(jìn)行相關(guān)檢驗(yàn)。

表1　6組試驗(yàn)曲線表

圖1　凍干曲線圖

2　結(jié)果

2.1凍干后成品檢驗(yàn)

6組試驗(yàn)連同對(duì)照樣品在凍干結(jié)束后，分別取樣進(jìn)行編號(hào)，按照文獻(xiàn)規(guī)定，選用同一批試驗(yàn)用兔，對(duì)其進(jìn)行檢驗(yàn)，各項(xiàng)指標(biāo)必須都要符合文獻(xiàn)的要求。

2.2無(wú)菌及真空度檢驗(yàn)結(jié)果

表2 各批次無(wú)菌及真空度檢驗(yàn)

2.337℃保存下的物理性狀及剩余水分測(cè)定結(jié)果

根據(jù)要求將凍后制品放置37℃，分別為7天、10天，后取樣進(jìn)行物理性狀和水分含量檢測(cè)。其中S4組試驗(yàn)、S5組試驗(yàn)和S6組試驗(yàn)產(chǎn)品均出現(xiàn)干縮情況，而且水分超標(biāo)，不符合規(guī)程要求，其它樣品全部合格（表3）。

2.437℃保存不同時(shí)間效力測(cè)定結(jié)果

37℃放置7天、10天后進(jìn)行效力檢測(cè)，除S4、S5、S6組試驗(yàn)出現(xiàn)干縮情況未進(jìn)行檢測(cè)外，其它各組耐熱保護(hù)劑的效力檢測(cè)均符合要求，但是5%蔗糖脫脂奶粉的對(duì)照均達(dá)不到要求（表4）。

表3 在37℃條件下疫苗物理性狀與水分含量變化

表4　37℃保存不同時(shí)間效力測(cè)定結(jié)果

3　討論

3.1預(yù)凍降溫速率

根據(jù)制品保護(hù)劑組分，結(jié)合產(chǎn)品的特點(diǎn)，在允許的條件下采取快速降溫的辦法，這樣可使冰晶快速形成，產(chǎn)生較大的冰核，有利于水分的快速蒸發(fā)。

3.2一期升化溫度

通過(guò)測(cè)到的共晶點(diǎn)使制品溫度低于10℃以下保溫2小時(shí)，在關(guān)鍵的一期升華階段，一定控制好板層溫度，不可使升華界面溫度超過(guò)共晶點(diǎn)溫度，否則就會(huì)出現(xiàn)制品塌陷，凍后會(huì)發(fā)現(xiàn)干縮情況。

綜上所述，我們認(rèn)為耐熱保護(hù)劑在凍干過(guò)程中需要根據(jù)保護(hù)劑的不同組分，進(jìn)行凍干曲線的合理調(diào)整。前期測(cè)量出制品的共晶點(diǎn)，在一期升華溫度相同的情況下，預(yù)凍降溫速率對(duì)制品凍型就顯得尤其重要。因?yàn)橹破吩陬A(yù)凍階段，冰晶形成的快慢，對(duì)升華時(shí)水分子逃逸的空間起著關(guān)鍵性的影響作用。不斷調(diào)整試驗(yàn)，對(duì)凍干曲線進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，最終篩選一條合適的凍干曲線，縮短了產(chǎn)品凍干時(shí)間，降低了生產(chǎn)能耗，而且有利于產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定，對(duì)我們今后耐熱保護(hù)劑的冷凍干燥研究具有重大意義。

［1］ 姜平.獸醫(yī)生物制品學(xué)［M］.第二版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2003：252.

［2］ 王玉琳，曾鳴，王玲，等. 病毒活疫苗凍干保護(hù)劑篩選研究［J］. 微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，1996，24（1）：22.

［3］ 王文成. 獸醫(yī)生物制品耐熱凍干保護(hù)劑的研究進(jìn)展［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2002（12）：7.

［4］ 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部. 中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程2000年版［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000.

（責(zé)任編輯：胡藕祥）

Study on Freeze-drying Technology of Heat Protection Agent of Live Classical Swine Fever Vaccine

Wang Chunwei，Ye Shengdan
（Zhejiang Ebvac Biotech Co. Ltd，Hangzhou，Zhejiang 310018）

With continuous application of swine fever live vaccine heat-resisting protective agents，the freeze-drying requirements are getting higher and higher. Through studies of the freeze drying processes，a suitable freeze-drying curve was selected： applying rapid and slow cooling in pre-freezing stage and selecting different temperatures during first sublimation stage，resulting in not only shortening the drying time，but reducing energy. The study provide the research direction of freeze-drying with heat-resisting protective agents in future.

freeze-drying；live classical swine fever vaccine；heat protection agent；freeze drying curve

S859.79+7

A

1005-944X（2015）11-0084-03