馬可　陳雄　鄭俊炯　陳嘉誠(chéng)　豐巖清

多發(fā)性硬化動(dòng)物模型神經(jīng)功能評(píng)分的比較與改良

馬可*陳雄*鄭俊炯*陳嘉誠(chéng)*豐巖清*

目的探討三種神經(jīng)功能評(píng)分方法在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）模型中的應(yīng)用情況，并提出最適評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。方法 32只雌性C57BL/6小鼠（18～20 g）隨機(jī)分配為正常對(duì)照組（15只）、造模組（17只）。造模組用MOG33-35多肽與弗式完全佐劑等體積混合成乳劑后多點(diǎn)皮下注射制備成EAE模型。遵循雙人雙盲原則分別使用Kono’s 5分法、Weaver’s 15分法及改良15分法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，并結(jié)合小鼠脊髓H&E染色結(jié)果，探究三種評(píng)分方法的評(píng)價(jià)準(zhǔn)確性、癥狀敏感性、病情相關(guān)性。結(jié)果據(jù)神經(jīng)功能評(píng)分趨勢(shì)圖，改良15分法后期癥狀波動(dòng)更明顯。對(duì)于非典型性發(fā)病EAE，改良15分法和15分法的評(píng)分更準(zhǔn)確。改良15分法和15分法的發(fā)病時(shí)間顯著早于5分法（P＜0.001），且可反映早期病理改變。改良15分法與高峰期、緩解期病理改變顯著相關(guān)（高峰P=0.001，緩解P=0.024），15分法與緩解期病理改變相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎動(dòng)物模型中，改良15分法能有效進(jìn)行細(xì)化評(píng)分，更準(zhǔn)確地評(píng)估各時(shí)期神經(jīng)功能改變。

多發(fā)性硬化 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎 神經(jīng)功能評(píng)分方法

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是國(guó)際上公認(rèn)的多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）的理想動(dòng)物模型，因能復(fù)制出與MS相似的臨床表現(xiàn)和病理特征而被廣泛應(yīng)用，并成為研究MS發(fā)病機(jī)制和藥物治療臨床前試驗(yàn)的重要手段［1-4］。

典型慢性EAE小鼠模型主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)功能障礙，對(duì)其據(jù)神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)量化后所得分?jǐn)?shù)可反映患病程度。但針對(duì)此EAE模型，目前仍沒(méi)有統(tǒng)一的神經(jīng)功能評(píng)分方法，常用的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)有Kono’s 5分法、Hooper’s 7分法和Weaver’s 15分法［5-6］。其中又因Hooper’s 7分法被多次更改，而最常用Kono’s 5分法和Weaver’s 15分法。但由于5分法適用面受限且評(píng)分不夠細(xì)化、15分法的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)表述缺乏精準(zhǔn)性，導(dǎo)致兩種方法的對(duì)模型病情反映欠準(zhǔn)確、對(duì)病情變化反映欠敏感。因此，本研究基于對(duì)EAE模型的長(zhǎng)期觀察提出了改良15分法。本文從評(píng)分方法的評(píng)價(jià)準(zhǔn)確性、癥狀敏感性、病情相關(guān)性三個(gè)方面對(duì)Kono’s 5分法，Weaver’s 15分法和改良15分法進(jìn)行探究，并提出EAE模型的相對(duì)最適神經(jīng)功能評(píng)分方法。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8～10周齡的C57BL/6雌性小鼠，體重18到20 g，購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（廣東），飼養(yǎng)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2EAE模型制備 C57BL/6小鼠飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)，記為第0天。32只8～10周齡的C57BL/6雌性小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（15只）、造模組（17只）。第0天，將100 μL 2mg/mL MOG33-35（MEVGYRSPFSRVVHLYRNGK，西安聯(lián)美多肽有限公司）和100 μL弗氏完全佐劑（complete freund’s adjuvant，CFA；美國(guó)Sigma公司）混合制成乳劑，多點(diǎn)皮下注射于造模組制備EAE模型；同時(shí)正常對(duì)照組皮下注射磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）。第0天及第2天，造模組腹腔注射百日咳毒素（pertussis toxin，PTX；美國(guó)Sigma公司）300 ng/只。第7天，造模組再次注射乳劑進(jìn)行二次免疫，造模方法同上；對(duì)照組附以PBS注射作對(duì)照。

1.3神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1Kono’s 5分法 5分法（Kono，1988）［5-6］按照癥狀嚴(yán)重程度分為5個(gè)級(jí)別：0分為不發(fā)病；1分為尾巴無(wú)力；2分為后肢無(wú)力；3分為后肢癱瘓；4分為前肢癱瘓；5分為死亡。

1.3.2Weaver’s 15分法 15分法（Weaver，2005）［5-6］是對(duì)小鼠尾巴和四肢進(jìn)行評(píng)分，再將得到的5個(gè)分?jǐn)?shù)累加即得到總分。對(duì)于尾巴，0分表示無(wú)癥狀，1分表示尾巴半癱，2分表示尾巴全癱；對(duì)于四肢，0分表示無(wú)癥狀，1分表示無(wú)力或步態(tài)改變，2分表示肢體輕癱，3分表示肢體全癱。如此，發(fā)病最重的小鼠即尾巴全癱和四個(gè)肢體全癱則應(yīng)評(píng)為14分（2’+3’×4），15分則表示死亡。

1.3.3改良15分法改良15分法是本研究基于Weaver’s 15分法做進(jìn)一步細(xì)化，將小鼠尾巴和四肢進(jìn)行評(píng)分，再將得到的5個(gè)分?jǐn)?shù)累加即得到總分。對(duì)于尾巴（見(jiàn)圖1），0分表示無(wú)癥狀，0.5分表示比正常稍低，1分表示與地面平行，1.5分表示尾尖拖地，2分表示全尾拖地；對(duì)于肢體，0分表示正常，0.5分表示四肢掌外翻，1分表示四肢掌外翻且身體相應(yīng)部位稍壓低，1.5分表示四肢掌外翻且身體相應(yīng)部位幾乎貼地，2分表示輕癱（行走時(shí)有關(guān)節(jié)活動(dòng)），3分表示全癱（肢體不能活動(dòng)，行走時(shí)拖著肢體）。如此，發(fā)病最重的老鼠即尾巴全癱和四個(gè)肢體全癱則評(píng)為14分（2’+3’×4），15分則表示死亡。

1.4評(píng)分方法 神經(jīng)功能評(píng)分方法嚴(yán)格遵循雙人雙盲原則，于每日9點(diǎn)對(duì)32只小鼠進(jìn)行觀察評(píng)分，對(duì)每只老鼠使用兩種評(píng)分方法，且同一小鼠的兩次評(píng)分時(shí)間差控制在20 min以上。

1.5病理改變分析 動(dòng)物取材時(shí)間及數(shù)量：①發(fā)病初期：EAE組小鼠（5分法評(píng)分=0，15分法、改良15分法評(píng)分=0.5）及正常組小鼠各3只；②發(fā)病中期：主發(fā)癥狀不同的EAE組小鼠（分別以“前肢輕癱”和“后肢無(wú)力”為主）各1只；③發(fā)病高峰期：EAE組小鼠、正常組小鼠各9只；④疾病緩解期：EAE組小鼠、正常組小鼠各3只。

動(dòng)物取材方法：用戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉小鼠，剖開(kāi)胸腔，暴露心臟，經(jīng)左心室刺入注射器，剪開(kāi)右心耳，灌注生理鹽水，沖洗血液至肝臟變白后，改用4%多聚甲醛先快后慢灌注固定0.5～1 h，然后取出腰骶段脊髓浸入4%多聚甲醛液中固定24 h。濾紙將組織表面的多聚甲醛吸干后制作石蠟切片，厚度為5 μm。進(jìn)行后續(xù)H&E染色，光鏡下觀察炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

H&E染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：參照Racke的病理分度標(biāo)準(zhǔn)（400倍鏡下計(jì)數(shù)）［7］—0分：沒(méi)有炎癥細(xì)胞；1分：少量散在的炎癥細(xì)胞；2分：在血管周圍組織見(jiàn)炎性浸潤(rùn)；3分：見(jiàn)大量血管套現(xiàn)象并向鄰近組織延伸，或者組織炎性浸潤(rùn)但不伴有血管套現(xiàn)象。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示。三種評(píng)分方法與病情的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α= 0.05。

2　結(jié)果

2.1三種評(píng)分方法評(píng)價(jià)準(zhǔn)確性比較

2.1.1神經(jīng)功能評(píng)分總體趨勢(shì) EAE組小鼠全部發(fā)病，表現(xiàn)為食欲不振，體重減輕，精神萎靡，步態(tài)失常，活動(dòng)減少，并伴有不同程度的尾巴無(wú)力、四肢無(wú)力等癥狀。由神經(jīng)功能評(píng)分曲線圖（見(jiàn)圖2）可得：①第4至6天，EAE組逐漸起??；15分法、改良15分法的平均癥狀評(píng)分=0.5，而5分法的平均癥狀評(píng)分仍為0（5分法的最小有癥狀評(píng)分為1分）；②第7天開(kāi)始，EAE組小鼠全部患??；③第17天，EAE組小鼠病情達(dá)峰，且改良15分法的癥狀峰值最明顯；④第17至35天，EAE組病情趨于穩(wěn)定；⑤與5分法和15分法相比，改良15分法后期癥狀評(píng)分波動(dòng)較為明顯，能更準(zhǔn)確地反映模型病情的變化。

圖2　三種評(píng)分方法評(píng)分與免疫天數(shù)曲線圖

2.1.2EAE模型特例的癥狀描述EAE模型的典型發(fā)病模式為“尾部—后肢—前肢”。而第18天EAE組出現(xiàn)1只非典型性發(fā)病小鼠，其呈現(xiàn)“尾部—前肢”的疾病進(jìn)展模式，即僅有尾巴無(wú)力、前肢輕癱，運(yùn)動(dòng)障礙癥狀未波及后肢等其他部位。取此鼠（以“前肢輕癱”為主）與同組常規(guī)發(fā)病鼠（以“后肢無(wú)力”為主）的全段脊髓做病理H&E染色，對(duì)比二者炎癥浸潤(rùn)最明顯脊髓節(jié)段的病理情況。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照（見(jiàn)圖5）相比，兩只EAE鼠脊髓白質(zhì)均見(jiàn)明顯的炎性浸潤(rùn)（見(jiàn)圖3）；而對(duì)比兩只“5分法得分各異、15分法與改良15分法得分相同”的EAE鼠（見(jiàn)表1），H&E染色結(jié)果未出現(xiàn)明顯差異。

表1　三種神經(jīng)功能評(píng)分方法的神經(jīng)功能評(píng)分比較

由此說(shuō)明，對(duì)于非典型性發(fā)病的EAE模型，與5分法相比，15分法和改良15分法的癥狀描述準(zhǔn)確性較高。

2.2三種評(píng)分方法癥狀敏感性比較

2.2.1EAE模型發(fā)病時(shí)間基于三種神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，15分法與改良15分法的發(fā)病時(shí)間（均為4.20±0.25 d）比5分法的發(fā)病時(shí)間（6.30±0.37 d）顯著提前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001；見(jiàn)圖4）。結(jié)果說(shuō)明與5分法相比，15分法與改良15分法更有利于早期發(fā)現(xiàn)EAE模型的癥狀改變。

2.2.2EAE模型發(fā)病早期病理改變?yōu)檫M(jìn)一步探究三種評(píng)分方法對(duì)EAE模型早期癥狀發(fā)現(xiàn)的敏

圖3　主發(fā)癥狀不同的EAE模型脊髓（炎癥浸潤(rùn)最明顯節(jié)段）病理切片（HE，400×）

圖4　三種神經(jīng)功能評(píng)分方法的發(fā)病時(shí)間（***表示與5分法相比，P＜0.001）

圖5　EAE模型（15分法、改良15分法=0.5，5分法=0）與正常組腰骶段脊髓病理切片（HE，400×）

2.3三種評(píng)分方法病情相關(guān)性比較

2.3.1發(fā)病高峰期三種評(píng)分方法的病情相關(guān)性比較根據(jù)三種神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示改良15分法的發(fā)病高峰時(shí)間（17.00±0.98）d遲于5分法的高峰時(shí)間（15.20±0.89）d、15分法的高峰時(shí)間（13.50±1.06）d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，見(jiàn)圖6）。

圖6　三種神經(jīng)功能評(píng)分方法的發(fā)病高峰時(shí)間（###表示與5分法、15分法相比，P＜0.001）

基于上述結(jié)果，分別于第14、15、17天（分別對(duì)應(yīng)15分法、5分法、改良15分法的高峰期）取小鼠腰骶段脊髓進(jìn)行H&E染色觀察，并參照Racke的病理分度標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分。再據(jù)三種評(píng)分方法高峰期評(píng)分與脊髓病理評(píng)分進(jìn)行Pearson相關(guān)分析（見(jiàn)表2）顯示，5分法、15分法與病理評(píng)分相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），改良15分法與病理改變顯著相關(guān)（P=0.001，γ=0.709）。

表2　三種神經(jīng)功能評(píng)分方法的病情相關(guān)性比較（高峰期）

2.3.2疾病緩解期三種評(píng)分方法的病情相關(guān)性比較免疫后第35天取小鼠腰骶段脊髓進(jìn)行H&E染色觀察，并參照Racke的病理分度標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分。再據(jù)三種評(píng)分方法高峰期評(píng)分與脊髓病理評(píng)分進(jìn)行Pearson相關(guān)分析（見(jiàn)表3）顯示，5分法與病理感性，免疫后第4天處死EAE組（15分法、改良15分法評(píng)分=0.5，5分法評(píng)分=0）與正常對(duì)照組小鼠各3只，并取腰骶段脊髓做H&E染色觀察病理改變。如圖5所示，與正常小鼠相比，EAE組可見(jiàn)脊髓白質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。這進(jìn)一步說(shuō)明與5分法相比，15分法和改良15分法對(duì)早期癥狀的發(fā)現(xiàn)更敏感。評(píng)分相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），15分法、改良15分法均與病理改變顯著相關(guān)（P＜0.05）。

表3　三種神經(jīng)功能評(píng)分方法的病情相關(guān)性比較（緩解期）

3　討論

EAE模型作為研究多發(fā)性硬化的主要?jiǎng)游锬Ｐ捅粡V泛使用，但目前對(duì)其仍沒(méi)有統(tǒng)一的神經(jīng)功能評(píng)分方法。其中最常用的評(píng)分方法包括Kono’s 5分法、Hooper’s 7分法以及Weaver’s 15分法。而對(duì)于Kono’s 5分法又描述各異［8-9］，7分法也被改進(jìn)成8分法、9分法等［10-11］。這些方法都有其存在的合理性，但由于缺少統(tǒng)一且行之有效的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)而造成了學(xué)術(shù)交流的不便。因此，本研究在15分法的基礎(chǔ)上做出改良，并對(duì)5分法，15分法和改良15分法在EAE模型的應(yīng)用情況進(jìn)行比較，試圖找到最適評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

多發(fā)性硬化癥病灶具有時(shí)間多發(fā)性，其動(dòng)物模型EAE也具有復(fù)發(fā)—緩解的特點(diǎn)。本研究顯示，對(duì)比常用的5分法和15分法，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)過(guò)合理細(xì)化的改良15分法可以更準(zhǔn)確地評(píng)估EAE模型癥狀的波動(dòng)情況。多發(fā)性硬化癥病灶還具有空間多發(fā)性，其動(dòng)物模型EAE的起病部位也并不固定，因此5分法的模型適用范圍嚴(yán)重受限。如本研究中出現(xiàn)的非典型性發(fā)病模型（以“前肢輕癱、后肢不受累”為主發(fā)癥狀）與同期常規(guī)型發(fā)病模型（以“后肢無(wú)力”為主發(fā)癥狀）相比，二者病理改變?cè)u(píng)分并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但用5分法評(píng)價(jià)得到的神經(jīng)功能評(píng)分卻出現(xiàn)了較大的區(qū)別。這充分說(shuō)明了5分法沒(méi)能有效地考慮EAE模型病灶有空間多發(fā)性的特點(diǎn)。而改良15分法和15分法采用分?jǐn)?shù)累加的計(jì)分方法，尤其是改良15分法又做了進(jìn)一步的評(píng)分細(xì)化，這很有效的解決了病灶隨發(fā)導(dǎo)致行為表現(xiàn)差異的問(wèn)題。

此外，改良15分法和15分法的早期癥狀發(fā)現(xiàn)敏感性顯著優(yōu)于5分法。如圖4所示，改良15分法和15分法的發(fā)病時(shí)間明顯早于5分法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且病理分析也驗(yàn)證了改良15分法和15分法早期發(fā)現(xiàn)的準(zhǔn)確性。在藥物治療臨床前試驗(yàn)中，15分法，尤其是評(píng)分細(xì)化后的改良15分法在研究藥物對(duì)EAE模型早期變化的有效性方面具有顯著的優(yōu)勢(shì)。

同時(shí)，我們也對(duì)三種評(píng)分方法的與病理改變的相關(guān)性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，在EAE緩解期，改良15分法和15分法與病理改變顯著相關(guān)。這在關(guān)于多發(fā)性硬化癥緩解復(fù)發(fā)過(guò)程的研究具有顯著優(yōu)勢(shì)。而在EAE高峰期，改良15分法與病理改變顯著相關(guān)，15分法和5分法與病理評(píng)分相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高峰期在關(guān)于EAE模型的研究中是一個(gè)常用于觀察的病理階段，一般的研究中該階段的確定主要是通過(guò)神經(jīng)功能評(píng)分方法評(píng)分結(jié)果來(lái)確定，所以，該時(shí)期神經(jīng)功能評(píng)分方法評(píng)分是否準(zhǔn)確十分重要。所以，我們有理由相信改良15分法在未來(lái)的科研工作中會(huì)可以發(fā)揮巨大的作用。

本研究仍存在一些不足之處。首先，本研究中非典型性發(fā)病的模型數(shù)量有限，尚未得到更加全面的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)。其次，本研究?jī)H僅對(duì)將改良的15分法與常用的5分法和15分法進(jìn)行比較，沒(méi)有將其與常用的7分法進(jìn)行比較，不能客觀得出改良15分法優(yōu)于其他所有神經(jīng)功能評(píng)分方法。最后，改良15分法是我們根據(jù)前人的努力成果以及實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)而提出的，相比5分法和15分法都有了較大的提高，但它仍然還有進(jìn)一步提高的空間。希望其他科研工作者也能對(duì)此進(jìn)行研究，分享經(jīng)驗(yàn)，提出更加準(zhǔn)確、敏銳、病理相關(guān)性更好的評(píng)分方法。

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A comparison study of three neurological assessments in the animal model of multiple sclerosis.

MA Ke，CHEN Xiong，ZHENG Junjiong，CHEN Jiacheng，F(xiàn)ENG Yanqing.Department of Neurology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital，Sun Yat-Sen University，Guangzhou，510080，China.Tel:020-87755766.

Objective To evaluate the effectiveness of three neurological assessments in experimental autoimmune encephalomyelitis.Methods Thirty-two female C57BL/6 mice（18-20g）were randomly divided into normal group（n=15）and immune group（n=17）.Immune group were induced subcutaneously in the flank by emulsion consisted of MOG33-35and complete Freund’s adjuvant.Mice were assessed by two investigators for 35 days after immunization in a blinded manner using Kono’s 5-point criterion，Weaver’s 15-point criterion and improved 15-point criterion.Based on H&E staining，we analyzed the accuracy，sensibility and dependency of three assessments.Results 35-day clinical-score plots revealed that the fluctuation of symptoms was more obvious in improved 15-point criterion compared with the other two criteria.15-point criterion and improved 15-point criterion are more accurate than 5-point criterion in atypical-onset EAE.15-point criterion and improved 15-point criterion could detect the neurological deficits much earlier than 5-point criterion（P＜0.001）.Neurological scores assessed by improved 15-point were well correlated with the pathological findings during the peak and remission stage.Conclusion Improved 15-point criterion is better neurological score system than Kono’s 5-point criterion and Weaver’s 15-point criterion because of its accurate assessment of the neurological deficits in experimental autoimmune encephalomyelitis.

Multiple sclerosis Experimental autoimmune encephalomyelitisClinical assessment criterion

R744.51

A

2014-11-07）

（責(zé)任編輯:李立）

10.3969/j.issn.1002-0152.2015.11.008

*中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（廣州510080）