陳艷　林琳　賈志強(qiáng)

高危型HPV載量 HIF-1α在CIN的表達(dá)及與LEEP術(shù)后患者的相關(guān)性分析

陳艷林琳賈志強(qiáng)

目的 探討高危型人乳頭狀瘤病毒（HPV）載量及缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）在宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變（CIN）的表達(dá)及發(fā)病過(guò)程中的相關(guān)性。方法 行環(huán)狀電圈切除術(shù)（LEEP）患者，CIN Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ級(jí)各50例，并選取同期體檢健康女性50例為對(duì)照組，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)HIF-1α的表達(dá)，采用HPV-DNA雜交捕獲Ⅱ（HC-Ⅱ）方法檢測(cè)高危型HPV-DNA，并用ROC曲線分析高危型HPV-DNA判斷宮頸病變理想的RLU/CO界值。結(jié)果 高危型HPV RLU/CO值及多個(gè)性伴侶因素組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HIF-1α在 CINI、II、III級(jí)中表達(dá)率分別為 26%、54 %、68%，呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，HIF-1α的陽(yáng)性表達(dá)率與CIN分級(jí)成正相關(guān)（R=0.377，P=0.000），與HPV RLU/CO值成正相關(guān)（R=0.309，P=0.000）。Logistic回歸分析，HPV載量、多個(gè)性伴侶、HIF-1α表達(dá)均為危險(xiǎn)因素。ROC曲線分析，確定預(yù)測(cè)CINII、CINIII宮頸病變最佳RLU/CO值3.805，靈敏度81%，特異度79%，Youden指數(shù)=0.600。結(jié)論 高危型HPV載量及HIF-1α與CIN存在明顯相關(guān)性，兩者聯(lián)合檢測(cè)可以更準(zhǔn)確地判斷CIN病變程度及生物學(xué)行為，預(yù)測(cè)CIN病變最佳HPV載量為3.805。

宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變 缺氧誘導(dǎo)因子-1α 乳頭狀瘤病毒 病毒負(fù)荷量 雜交捕獲

宮頸癌是我國(guó)婦科惡性疾病死亡的主要原因之一，高危型人乳頭狀瘤病毒（HPV）感染是宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）發(fā)生的必要條件，CINⅡ、Ⅲ患者術(shù)后高危型HPV載量與宮頸病變相關(guān)，近年來(lái)成為國(guó)內(nèi)CIN患者經(jīng)環(huán)狀電圈切除術(shù)（LEEP）后的隨訪內(nèi)容。缺氧誘導(dǎo)因子1 （HIF-1）是維持機(jī)體氧平衡的核心轉(zhuǎn)錄基因，是近年來(lái)腫瘤研究的熱點(diǎn)。本文探討高危型HPV載量判斷宮頸病變CINⅡ、Ⅲ級(jí)理想的RLU/CO界值，進(jìn)一步分析HIF-1α參與CIN的可能機(jī)制及作用。

1　臨床資料

1.1一般資料 2009年6月至2013年1月本院行LEEP患者150例，選擇同期體檢健康女性50例為對(duì)照組，所有入選者年齡20～56歲，平均（39.97±9.67）歲。LEEP術(shù)患者均由同一位經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師操作，以病理檢查結(jié)果為最終診斷，所有病理切片均由資深病理學(xué)專家復(fù)核。按國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期： Ⅰ級(jí)，Ⅱ級(jí)，Ⅲ級(jí)各收集50例。入選標(biāo)準(zhǔn)：既往無(wú)冠心病、腦血管病家族史、糖尿病、肝、腎、血液、自身免疫性疾病及妊娠者。本項(xiàng)目通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有標(biāo)本的收集均經(jīng)受試者本人或家屬同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：腦卒中、嚴(yán)重心臟疾病近期發(fā)生心肌梗死或心絞痛疾病、嚴(yán)重感染、嚴(yán)重肝、腎功能不全、血栓性疾病、腫瘤、曾行放化療或生物學(xué)治療患者。

1.2高危型HPV-DNA檢測(cè) 高危型HPV-DNA檢測(cè)采用美國(guó)Digene公司HPV-DNA雜交捕獲Ⅱ（HC-Ⅱ）的方法，HC-Ⅱ試劑盒購(gòu)自美國(guó)Digene公司。共檢測(cè)13個(gè)高危HPV基因型，包括HPVl6、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68。操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明。

1.3HIF-1α表達(dá)的檢測(cè) HIF-1α表達(dá)的檢測(cè)采用兔抗人HIF-1α單克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司），染色方法嚴(yán)格按照說(shuō)明進(jìn)行，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)。HIF-1α主要表達(dá)于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)，以棕褐色或棕黃色顆粒者為陽(yáng)性，參考Swinson等［1］的判斷標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)腫瘤細(xì)胞顯色的比例及染色強(qiáng)度，對(duì)HIF-1α表達(dá)作半定量評(píng)定。參考肖帥等［2］研究，陽(yáng)性細(xì)胞率評(píng)分：0分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜1%。1分：1%～10%。2分：11%～50%。3分＞50%。按顯色程度評(píng)分：1分：染色弱。2分：中等染色。3分：強(qiáng)染色。兩種評(píng)分結(jié)合起來(lái)分為4級(jí)：無(wú)論染色強(qiáng)度如何，細(xì)胞陽(yáng)性率＜10%為陰性。2～3分為陽(yáng)性（+）。4～5分為中度陽(yáng)性（++）。6～7分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件分析。計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料行秩和檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（x±s）表示，用單因素方差分析。采用非條件多項(xiàng)式Logistic回歸分析病毒載量、HIF-1α表達(dá)及其他多因素與各級(jí)CIN的關(guān)系。確定閾值采用ROC曲線，真陽(yáng)性率與假陽(yáng)性率之差為Youden指數(shù)，取最大Youden指數(shù)為HPV-DNA負(fù)荷的最佳閾值。

2　結(jié)果

2.1CIN高危因素的單因素分析 見(jiàn)表1。

表1　CIN高位因素的單因素分析［n，（x±s）］

2.2HIF-lα在宮頸上皮內(nèi)瘤樣變中的表達(dá) HIF-1α的陽(yáng)性表達(dá)率與CIN分級(jí)成正相關(guān)（R=0.377，P=0.000），與HPV RLU/CO值成正相關(guān)（R=0.309 P=0.000）見(jiàn)表2。

表2　HIF-1α在宮頸上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)（n）

2.3Logistic 回歸分析 采用二分類非條件Logistic回歸分析HPV載量及HIF-1α表達(dá)與CIN高危因素的關(guān)系，將單因素分析篩選出的可能危險(xiǎn)因素進(jìn)一步進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，最終進(jìn)入模型的因 素：HPV載 量（OR=4.206，95% CI為1.826～9.691；P=0.001），多個(gè)性伴侶（OR=4.406，95% CI為1.942～9.997；P=0.000），HIF-1α表達(dá)（OR=2.457，95% CI為1.364～4.424；P=0.003）均為危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表3。

表3　HPV載量及HIF-1α表達(dá)與CIN高危因素的關(guān)系的logistic回歸分析

2.4高危型HPV病毒載量預(yù)測(cè)宮頸病變閾值的確定 根據(jù)病理組織學(xué)結(jié)果，以健康體檢人群及CIN I為陰性，CINII、III為陽(yáng)性，高危HPV-DNA病毒載量預(yù)測(cè)CIN II、III宮頸病變閾值的ROC曲線，結(jié)果提示預(yù)測(cè)CINII、III宮頸病變，高危型HPV病毒載體最佳RLU/CO閾值為3.805，靈敏度81%、特異度79%，Youden指數(shù)=0.600。

3　討論

HPV病毒感染后，僅少數(shù)患者HPV載量一直持續(xù)在較高的水平，并逐漸由量變發(fā)生了質(zhì)變，感染細(xì)胞異常增生，直至出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變，導(dǎo)致宮頸癌。HPV感染是CIN發(fā)生、發(fā)展的必要條件，但并不是充分條件。有研究報(bào)道子宮頸暴露HPV病毒的載量和型別對(duì)于宮頸高度病變及子宮頸癌發(fā)生的致病風(fēng)險(xiǎn)至關(guān)重要［3］。本資料顯示，宮頸病變中HPV感染率與HPV病毒負(fù)荷量均隨著宮頸病變級(jí)別升高，隨著HPV病毒負(fù)荷量的增高，宮頸病變程度越高；宮頸病變級(jí)別越髙。目前，CIN治療方法主要為L(zhǎng)EEP術(shù)［4］，LEEP術(shù)陽(yáng)性切緣的患者25%～50%可能病灶殘留或復(fù)發(fā)。

本資料應(yīng)用雜交捕獲HPV-DNA檢測(cè)技術(shù)HC-Ⅱ法測(cè)定；有研究報(bào)道［5］HC-Ⅱ檢測(cè)法在CIN II級(jí)以上，其宮頸病變敏感性＞90%，但其特異性偏低，門診宮頸癌篩查其診斷意義不明確，不典型鱗狀細(xì)胞分層特異性＜50%。而本資料結(jié)果提示，預(yù)測(cè)CINII級(jí)以上高危HPV-DNA病毒載量最佳值為3.805，靈敏度81%、特異度79%，Youden指數(shù)=0.600，分析其原因可能有：（1） HPV感染患者可通過(guò)體內(nèi)免疫系統(tǒng)可自然消退。（2）HC-Ⅱ檢測(cè)方法與其他低危型HPV基因有交叉反應(yīng)，尤其是RLU/CO值＜2時(shí)其敏感性及特異性均受影響。故作者認(rèn)為提高HPV-DNA陽(yáng)性閾值至3.805可提高HC-II法檢測(cè)的特異性，可降低其檢測(cè)CIN II、Ⅲ級(jí)宮頸病變的假陽(yáng)性率，而對(duì)其敏感性僅輕微影響。

近年來(lái)關(guān)于腫瘤發(fā)生、發(fā)展的影響因素的研究中，腫瘤細(xì)胞內(nèi)部缺氧作為一個(gè)新的觀點(diǎn)逐步引起重視。其發(fā)生機(jī)制可能為當(dāng)腫瘤細(xì)胞缺氧時(shí)，通過(guò)對(duì)HIF-1α調(diào)節(jié)，從而影響細(xì)胞能量代謝、血管發(fā)生及舒縮的控制，繼而介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、紅細(xì)胞生成素、糖酵解酶等多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄［6］，誘導(dǎo)新生血管生成，使腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧微環(huán)境。HIF-1α在 CINI、II、III 中陽(yáng)性表達(dá)呈逐漸上升趨勢(shì)。在組織學(xué)分級(jí)，HIF-1α的陽(yáng)性表達(dá)率與CIN分級(jí)成正相關(guān)（R=0.377），與HPV RLU/CO值成正相關(guān)（R=0.309），因此作者認(rèn)為，臨床上對(duì)HIF-1α蛋白的檢測(cè)將有助于子宮內(nèi)膜改變的診斷及鑒別診斷，且與HPV病毒載量成弱正相關(guān)關(guān)系，能夠預(yù)測(cè)腫瘤的發(fā)展趨勢(shì)和轉(zhuǎn)移潛能，有望成為一種新的臨床診斷指標(biāo)。

1Swinson DE，Jones JL，Cox G，et al. Hypoxia-inducible factor-1 alpha in non small cell lung cancer， relation to growth factor， protease and apoptosis pathways. Int JCancer，2004，l 11（1）：43.

2肖帥，盧先州，劉龍飛，等. 缺氧誘導(dǎo)因子-1α及轉(zhuǎn)錄因子Snail與直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2012，29（2）：212-213.

3Gravitt PE， Kovacic MB， Herrero R， et al. High load for most high risk human papillomavirus genotypes is associated with prevalent cervical cancer precursors but only HPV16 load predicts the development of incident disease. Int J Cancer.2007， 121（12）：2787～2793.

4余進(jìn)進(jìn)，舒珊，王元，等. 腹腔鏡輔助陰式根治性子宮切除術(shù)治療宮頸癌的臨床研究.中國(guó)醫(yī)師雜志，2011， 13（6）：329～330

5Ordi J1， Puig-Tintoré LM， Torné A， et al. Contribution of high risk human papillomavirus testing to the management of premalignant and malignant lesions of the uterine cervix Med Clin ， 2003，121（12）：441～445.

6Kelly B D，Hackett S F，Hirota K，et al . Cell type-specific reguiation of angiogenic growth factor gene expression and induction of angiogenesis in nonischemic tissue by a constitutiveiy active form of hypoxiainducibie factor1. Circ Res，2003，93（11）：1074～1081.

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