封蔚瑩　金晶　洪攀

Survivin抑制劑YM155聯(lián)合阿糖胞苷對(duì)人白血病K562細(xì)胞系的作用及機(jī)制

封蔚瑩金晶洪攀

目的 探討survivin抑制劑YM155聯(lián)合阿糖胞苷（Ara-C）對(duì)人白血病K562細(xì)胞系的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用及機(jī)制。方法 實(shí)驗(yàn)設(shè)6組：對(duì)照組、YM155單藥組、Ara-C單藥組、YM155和Ara-C聯(lián)合組、YM155序貫Ara-C組、Ara-C序貫YM155組，分別作用于K562細(xì)胞。以CCK法檢測(cè)增殖抑制率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果 CCK-8法顯示YM155和Ara-C單藥均能抑制K562細(xì)胞生長(zhǎng)，YM155序貫Ara-C組細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率高于其他給藥方式組。YM155序貫Ara-C組survivin、Mcl-1蛋白表達(dá)顯著下降。結(jié)論 YM155序貫Ara-C聯(lián)合能顯著抑制K562細(xì)胞增殖，可能通過(guò)下調(diào)survivin、 Mcl-1蛋白誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。

survivin YM155 阿糖胞苷 K562細(xì)胞

慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）是一種惡性血液病，CML加速急變期后使用常規(guī)聯(lián)合化療效果不理想。近來(lái)國(guó)內(nèi)外開展了Ara-C等藥物聯(lián)合作用于CML急變期細(xì)胞的體外研究，均顯示有一定療效［1，2］。作者自2012年6月至2014年6月通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，探討新型小分子survivin抑制劑YM155聯(lián)合Ara-C對(duì)CML細(xì)胞系K562的協(xié)同效應(yīng)和可能機(jī)制。

1　材料和方法

1.1藥物、試劑 YM155（美國(guó)Selleck Chemicals公司），Ara-C（美國(guó)法瑪西亞公司），RPMI1640培養(yǎng)液及胎牛血清（美國(guó)Sigma公司），AnnexinV PI試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），CCK-8試劑盒（上海前塵生物科技有限公司），Survivin 和Mcl-1兔抗人多克隆抗體（美國(guó)Cell Signaling公司），HRP標(biāo)記羊抗兔IgG（英國(guó)GE公司），兔抗人B-actin多克隆抗體及HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG（美國(guó)Sigma公司）。

1.2細(xì)胞系及培養(yǎng) CML急變期K562細(xì)胞系（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所），于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、飽和濕度孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)定細(xì)胞活力，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 分別以YM155（0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0nmol/L）和Ara-C（2，4，8，16，32，64μg/ml）單藥治療K562細(xì)胞48 h和72h，采用CCK-8活性檢測(cè)試劑盒，操作按照說(shuō)明書，以酶標(biāo)儀檢測(cè)A450處吸光度，以A450（作用組-空白組）/（正常組-空白組）×100%的值為細(xì)胞存活率，1-細(xì)胞存活率為增殖抑制率。Calcusyn藥效學(xué)軟件計(jì)算藥物IC50值。

1.4聯(lián)合和序貫用藥的增殖抑制實(shí)驗(yàn) 按照前述實(shí)驗(yàn)得出的藥物IC50值選擇YM155（1.0nmol/L）與Ara-C（4.0μg/ml），實(shí)驗(yàn)設(shè)6組：空白對(duì)照組、YM155單藥組（Y組）、Ara-C單藥組（A組）、YM155和Ara-C聯(lián)合組（Y+A組）、YM155預(yù)處理12h序貫Ara-C組（Y→A組）、Ara-C預(yù)處理12h序貫YM155組（A→Y組），分別作用于K562細(xì)胞48h。以CCK-8法檢測(cè)增殖抑制率，得出最佳結(jié)果。

1.5流式細(xì)胞儀凋亡檢測(cè) 仍以上述6組作用于K562細(xì)胞，操作按照Annexin FITC-PI試劑盒說(shuō)明書，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Annexin 陽(yáng)性為早期+晚期凋亡細(xì)胞［3，4］，比較各組細(xì)胞凋亡情況。

1.6Western blotting 檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白 設(shè)4組：對(duì)照組、YM155組、Ara-C組、最佳聯(lián)合作用組。作用于K562細(xì)胞0h、12h、24h、36h，收集細(xì)胞并裂解提取蛋白于-80℃保存，按照既往方法電泳、轉(zhuǎn)膜、一抗及二抗孵育并ECL顯影，掃描成像并進(jìn)行灰度值差異分析［5］。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1YM155與Ara-C單藥對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響 CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，YM155單藥對(duì)K562細(xì)胞48h、72h的IC50值分別為3.5nmol/L和1.2mmol/L，上述濃度Ara-C單藥在48h未達(dá)半數(shù)抑制濃度，其72h的IC50值為 3.5μg/ml，呈濃度和時(shí)間依賴，抑制K562細(xì)胞增殖。見圖1。

圖1　YM155與Ara-C單藥分別對(duì)K562細(xì)胞增殖抑制作用

2.2YM155與Ara-C聯(lián)合和序貫方法對(duì)K562細(xì)胞增殖和凋亡的影響 聯(lián)合作用48h后CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，兩藥物聯(lián)合作用的增殖抑制率均強(qiáng)于單藥組及對(duì)照組，其中以YM155序貫Ara-C組的增殖抑制率最強(qiáng)，見圖2。流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，兩藥物聯(lián)合作用48h的誘導(dǎo)凋亡率均強(qiáng)于單藥組及對(duì)照組，其中以YM155序貫Ara-C組的凋亡率最高。見圖3。

2.3聯(lián)合作用機(jī)制研究 設(shè)對(duì)照組，YM155組Ara-C組，YM155序貫Ara-C組。對(duì)4組凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè)結(jié)果顯示，YM155單藥作用于K562細(xì)胞后survivin及Mcl-1蛋白表達(dá)均下降，Ara-C單藥作用于K562細(xì)胞后 survivin蛋白表達(dá)輕度升高，Mcl-1蛋白表達(dá)下降，YM155序 貫Ara-C組survivin及Mcl-1蛋白表達(dá)均顯著下降，見圖4。

圖2　YM155和Ara-C單藥或聯(lián)合、序貫治療對(duì)K562細(xì)胞增殖抑制的影響

圖3　YM155和Ara-C單藥或聯(lián)合、序貫方法對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響

圖4　不同藥物組對(duì)K562細(xì)胞survivin 和Mcl-1蛋白表達(dá)情況

3　討論

Survivin是耶魯大學(xué)Altier實(shí)驗(yàn)室在1997年發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制因子，具有抑制腫瘤細(xì)胞凋亡及誘導(dǎo)耐藥性產(chǎn)生等作用，研究認(rèn)為survivin高表達(dá)與CML疾病進(jìn)展及耐藥密切相關(guān)［6］，故survivin是研發(fā)CML晚期患者新治療藥物的理想靶點(diǎn)。作者前期研究證實(shí)survivin反義寡核苷酸能誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡及具有化療協(xié)同效應(yīng)［7］。YM155是Astellas公司研發(fā)的新藥，2007年報(bào)道該藥通過(guò)抑制前列腺癌細(xì)胞系survivin mRNA及蛋白表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，屬新型survivin抑制劑［8］。此后研究相繼發(fā)現(xiàn)YM155屬細(xì)胞周期非特異性藥物［9］，與多種抗癌藥物聯(lián)合具有化療協(xié)同作用［10，11］，多中心II期研究證明該藥具有良好耐受性，但單藥僅部分有效，建議進(jìn)行多藥聯(lián)合治療研究［12，13］。Ara-C屬作用于細(xì)胞周期S期的抗代謝藥物，臨床上大劑量Ara-C治療白血病易導(dǎo)致嚴(yán)重骨髓抑制、肺部真菌感染等并發(fā)癥，導(dǎo)致其臨床應(yīng)用受限，故有學(xué)者開展小劑量Ara-C與其他化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用研究。但小劑量Ara-C可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞survivin表達(dá)增加而使體內(nèi)產(chǎn)生獲得性Ara-C耐藥的白血病細(xì)胞群［14］，故理論分析將survivin抑制劑與小劑量Ara-C聯(lián)用，以達(dá)到降低Ara-C毒性又增加藥效的目的。

目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)YM155在CML的機(jī)制及聯(lián)合治療研究。K562細(xì)胞系高表達(dá)survivin的人CML急變期細(xì)胞系，是體外研究抗CML急變藥物的良好細(xì)胞模型。本資料顯示YM155單藥下調(diào)K562細(xì)胞系survivin蛋白表達(dá)，抑制K562細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)凋亡；而YM155序貫細(xì)胞周期特異性藥物Ara-C聯(lián)合治療，抑制K562細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用顯著高于其他治療組，且該序貫治療顯著下調(diào)survivin及Mcl-1 蛋白表達(dá)。作者發(fā)現(xiàn)YM155可通過(guò)激活caspase-8下調(diào)survivin來(lái)誘導(dǎo)急性髓系白血病細(xì)胞凋亡［5］，據(jù)報(bào)道YM155亦可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬［15］，故未來(lái)亦可從細(xì)胞周期、caspase凋亡通路及自噬等多方面進(jìn)行機(jī)制研究，YM155序貫Ara-C有可能是從多環(huán)節(jié)多靶點(diǎn)誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用。

通過(guò)科學(xué)的方法評(píng)價(jià)YM155和Ara-C各種聯(lián)合用藥方式及療效，為尋找更有效經(jīng)濟(jì)的CML急變患者的聯(lián)合治療方案提供理論依據(jù)及開辟新思路。結(jié)合YM155具有低毒性及可與多藥聯(lián)合治療發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)的特點(diǎn)，推測(cè)其在未來(lái)CML急變患者的臨床治療中可能具有良好的應(yīng)用前景。

1Li Y， Deng Z， Zhu J， et al. Homoharringtonine combined with cytarabine to treat chronic myelogenous leukemia in myeloid blast crisis and its impact on bone marrow CD34+CD7+ cells. Acta Haematol，2014， 132（2）：172～176.

2陸世豐，陸勤.硼替佐米與阿糖胞苷聯(lián)用對(duì)K562細(xì)胞增殖和凋亡的影響. 中華血液學(xué)雜志，2010，31（1）：42～45.

3封蔚瑩，周煬，鐘永根，等.SN-38對(duì)K56Z細(xì)胞的增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)及其與塞來(lái)昔布聯(lián)合化療的協(xié)同作用.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2012，41（2）：156～160.

4封蔚瑩，宋春嬌，張志堅(jiān)，等.喜樹堿衍生物SN-38對(duì)人白血病細(xì)胞系HL-60增殖及凋亡作用的實(shí)驗(yàn)研究.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2014，32（6）：1406～1408.

5Feng W， Yoshida A， Ueda T. YM155 induces caspase-8 dependent apoptosis through downregulation of survivin and Mcl-1 in human leukemia cells. Biochem Biophys Res Commun， 2013， 435（1）： 52～57. 6Reis FR， Vasconcelos FC， Pereira DL，et al.Survivin and P-glycoprotein are associated and highly expressed in late phase chronic myeloid leukemia. Oncol Rep， 2011， 26（2）：471～478.

7封蔚瑩， 周煬， 周國(guó)忠.survivin反義寡核苷酸誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡及化療協(xié)同作用研究. 臨床血液學(xué)雜志， 2012， 25（7）： 454～456.

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9Yamanaka K， Nakahara T， Yamauchi T， et al. Antitumor Activity of YM155， a Selective Small-Molecule Survivin Suppressant， Alone and in Combination with Docetaxel in Human Malignant Melanoma Models. Clin Cancer Res， 2011，17（16）：5423～5431.

10Park DG. Antichemosensitizing effect of resveratrol in cotreatment with oxaliplatin in HCT116 colon cancer cell. Ann Surg Treat Res，2014，86（2）：68～75.

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14丁倩，張祥忠，鐘雪云，等.阿糖胞苷對(duì)白血病細(xì)胞K562凋亡抑制基因Survivin的作用研究. 白血病·淋巴瘤，2009，18（5）： 264～273.

15Wang YF，Zhang W，HE KF， et al. Induction of autophagy-dependent cell death by the survivin suppressant YM155 in salivary adenoid cystic carcinoma. Apoptosis，2014，19（4）：748～758.

Objective To investigate the combination effect of the survivin inhibitor YM155 and Ara-C on the proliferation and apoptosis of human leukemia cell line K562 and to explore its mechanism. Methods The K562 cells were divided into 6 groups： control group，YM155 group，Ara-C group，combination group，YM155 following Ara-C group，Ara-C following YM155 group. The cell growth inhibitory rate was measured by CCK-8 assay. The fl ow cytometry was performed to assess cell apoptosis. The apoptosis associated proteins were analyzed by Western blotting. Results The CCK-8 Methods showed that YM155 and Ara-C alone inhibited the proliferation of K562 cells. The growth inhibitory and apoptosis rates in YM155 following Ara-C group were higher than other groups. The protein expression levels of survivin and Mcl-1 decreased remarkably in K562 cells treated with YM155 following Ara-C. Conclusion The combination with YM155 following Ara-C group on K562 cells has synergistic effect. The mechanism may be related with induing apoptosis through down-regulation survivin，Mcl-1.

Survivin YM155 Cytarabine K562 cells

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目No.2012ZB159；紹興市公益性應(yīng)用計(jì)劃項(xiàng)目No.2012B70066

312000浙江省紹興市人民醫(yī)院