朱培華　黃敬垣★　葉萌　楊繼東　洪勇強(qiáng)

實(shí)時(shí)超聲造影技術(shù)分析兔VX2肝癌模型的實(shí)驗(yàn)研究

朱培華黃敬垣★葉萌楊繼東洪勇強(qiáng)

目的 探討應(yīng)用實(shí)時(shí)超聲造影（CEUS）技術(shù)檢查兔 VX2肝癌模型的臨床價(jià)值。方法 選取30只新西蘭大白兔制成VX2肝癌模型，分別行常規(guī)超聲檢查及經(jīng)兔耳緣靜脈注射超聲造影劑行CEUS檢查，觀察肝癌模型的影像學(xué)特點(diǎn)，獲得并分析肝癌模型中腫瘤組織的CEUS定量參數(shù)的特點(diǎn)，并與肝癌模型的病理切片比較分析。結(jié)果 兔VX2肝癌結(jié)節(jié)進(jìn)行CEUS檢查時(shí)均表現(xiàn)為典型的“快進(jìn)快退”增強(qiáng)特點(diǎn)。兔VX2肝癌組織的AS、PI、AUC較周圍鄰近正常肝組織明顯增高（P＜0.05）；AT、TTP較周圍鄰近正常肝組織明顯減少（P＜0.05）。CEUS檢查對(duì)兔VX2肝癌結(jié)節(jié)的總體檢出率及對(duì)微小肝癌、小肝癌的敏感度和準(zhǔn)確度均高于常規(guī)超聲檢查（P＜0.05）。CEUS對(duì)直徑0.3～0.5cm微小肝癌的檢出率（85.71%）高于常規(guī)超聲（P＜0.05）。與直徑＞1.0cm小肝癌比較，直徑＜1.0cm微小肝癌的CEUS定量參數(shù)AT、TTP明顯增加（P＜0.05）。結(jié)論 CEUS不僅能提供肝癌病灶的微小血管形態(tài)結(jié)構(gòu)信息，而且能實(shí)時(shí)反映其血流灌注情況，有助于小肝癌及微小肝癌的檢出及定性診斷。

兔 VX2肝癌模型 原發(fā)性肝細(xì)胞癌 實(shí)時(shí)超聲造影技術(shù)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌（HCC）在我國(guó)較為常見(jiàn)，因其惡性程度高，且對(duì)放療化療均不敏感，預(yù)后差。臨床對(duì)小肝癌、微小肝癌常難以早期發(fā)現(xiàn)。作者應(yīng)用實(shí)時(shí)超聲造影 （CEUS）技術(shù)對(duì)兔VX2肝癌模型進(jìn)行觀察，探討HCC 的CEUS實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)增強(qiáng)效應(yīng)特征及其定量參數(shù)特點(diǎn)，旨在提高HCC診斷率及檢出率。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型 30只健康純種新西蘭大白兔由浙江大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，雌雄不作限制，所有實(shí)驗(yàn)兔均為CL級(jí)，體質(zhì)量2.0～3.0kg。

1.2常規(guī)超聲檢查及CEUS檢查 實(shí)驗(yàn)兔VX2成瘤組織種植完畢于21d后，由中級(jí)職稱以上且經(jīng)驗(yàn)豐富的超聲診斷醫(yī)師對(duì)其進(jìn)行常規(guī)超聲檢查及CEUS檢查。使用Philips iU22超聲診斷儀（L9-3寬頻線陣探頭，頻率為10MHZ，機(jī)械指數(shù)設(shè)定為0.07）。采取仰臥位將實(shí)驗(yàn)兔固定于實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)上。首先采用常規(guī)二維超聲多方位多切面觀察兔VX2肝癌模型，觀察內(nèi)容主要包括：腫瘤病灶的部位、大小、形態(tài)、內(nèi)部回聲、邊界、數(shù)量。啟動(dòng)彩色多普勒觀察肝癌腫瘤病灶的血供情況。將意大利博萊科公司提供的Sonovue加入0.9%的氯化鈉5ml稀釋備用。以24G的靜脈留置針于實(shí)驗(yàn)兔的耳緣靜脈建立靜脈通道。進(jìn)行實(shí)時(shí)超聲造影時(shí)，采用1ml注射器按照0.1ml/kg的劑量經(jīng)靜脈通道進(jìn)行團(tuán)注，隨后以2ml生理鹽水進(jìn)行超聲造影劑團(tuán)注后的沖管。團(tuán)注造影劑的同時(shí)，立刻啟動(dòng)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)超聲造影計(jì)時(shí)器，并對(duì)造影影像資料作記錄（記錄時(shí)長(zhǎng)約3min），保存至超聲診斷儀的主機(jī)內(nèi)置硬盤中，作后續(xù)分析觀察。對(duì)超聲造影進(jìn)行時(shí)間-強(qiáng)度分析時(shí)，使用QLAB軟件完成，并獲取感興趣區(qū)域（腫瘤組織以及其周邊鄰近正常肝組織）的CEUS分析參數(shù)：曲線下面積（AUC）、峰值強(qiáng)度（PI）、開(kāi)始增強(qiáng)時(shí)間（AT）、曲線增強(qiáng)上升斜率（AS）、達(dá)峰時(shí)間（TTP）［1］。CEUS時(shí)相判斷：動(dòng)脈相-CEUS開(kāi)始后10s～30s；門脈相-CEUS開(kāi)始后30～120s；延遲相-CEUS開(kāi)始后120～360s。CEUS腫瘤組織“增強(qiáng)程度”判斷標(biāo)準(zhǔn)：以腫瘤病灶周邊鄰近正常的肝組織回聲作參照進(jìn)行比較，呈現(xiàn)四個(gè)級(jí)別（“高增強(qiáng)”、“等增強(qiáng)”、“低增強(qiáng)”、“無(wú)增強(qiáng)”）。

1.3病理學(xué)檢查 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用空氣栓塞法將實(shí)驗(yàn)兔全部處死，切除實(shí)驗(yàn)兔的肝臟，觀察兔VX2肝癌模型腫瘤標(biāo)本的情況，記錄實(shí)驗(yàn)兔肝癌結(jié)節(jié)的數(shù)目并精確測(cè)量每個(gè)結(jié)節(jié)的大小。將標(biāo)本浸入濃度為10%的甲醛液內(nèi)行標(biāo)本固定，常規(guī)石蠟包埋后進(jìn)行連續(xù)切片（厚度為3.0μm），常規(guī)HE染色后并以中性樹(shù)膠進(jìn)行封片，將制作好的組織標(biāo)本進(jìn)行病理分析觀察。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以%表示，用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兔VX2肝癌模型的CEUS檢查 超聲造影劑經(jīng)實(shí)驗(yàn)兔耳緣靜脈通道注入后約5s左右即開(kāi)始出現(xiàn)動(dòng)脈相增強(qiáng)，病灶結(jié)節(jié)周邊可見(jiàn)漸進(jìn)性的“環(huán)狀”增強(qiáng)或“樹(shù)枝狀”增強(qiáng)。門脈相超聲造影劑即開(kāi)始出現(xiàn)廓清，因該時(shí)相正常肝組織的造影回聲不斷增強(qiáng)，而病灶結(jié)節(jié)的增強(qiáng)即不斷減弱，兩者比較，病灶結(jié)節(jié)呈低回聲。整個(gè)CEUS過(guò)程表現(xiàn)為惡性腫瘤的典型增強(qiáng)方式：“快進(jìn)快退”型。如病灶中央出現(xiàn)壞死區(qū)時(shí)僅見(jiàn)病灶周邊的“環(huán)狀”增強(qiáng)。

2.2肝癌病灶組織與周圍鄰近正常肝組織的CEUS定量參數(shù)比較 見(jiàn)表1。

表1　肝癌組織與正常肝組織CEUS定量參數(shù)比較 （x±s）

2.3常規(guī)超聲檢查和CEUS檢查對(duì)兔VX2肝癌結(jié)節(jié)的檢出情況比較 病理檢查發(fā)現(xiàn)兔VX2肝癌結(jié)節(jié)63個(gè)，其中37個(gè)為1.1～3.0cm的小肝癌，11個(gè)為0.3～1.0cm的微小肝癌。（1）常規(guī)超聲檢查：發(fā)現(xiàn)肝癌結(jié)節(jié)47個(gè)（結(jié)節(jié)直徑范圍0.5cm～4.3cm），其中包括微小肝癌7個(gè)（4個(gè)病理解剖證實(shí)，結(jié)節(jié)直徑＞1cm）、小肝癌28個(gè)（3個(gè)病理解剖證實(shí)，結(jié)節(jié)直徑＞3cm）。常規(guī)超聲檢查對(duì)肝癌結(jié)節(jié)總體檢出率74.60%。小肝癌敏感度67.57%、特異度88.46%、準(zhǔn)確度76.19%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值89.29%、陰性預(yù)測(cè)值65.71%。微小肝癌敏感度27.27%、特異度92.31%、準(zhǔn)確度80.95%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值42.86%、陰性預(yù)測(cè)值85.71%。（2）CEUS檢查：發(fā)現(xiàn)肝癌結(jié)節(jié)59個(gè)（結(jié)節(jié)直徑范圍0.4～4.1cm），其中包括微小肝癌10個(gè)（1個(gè)病理解剖證實(shí)，結(jié)節(jié)直徑＞1cm）、小肝癌35個(gè)（1個(gè)病理解剖證實(shí)，結(jié)節(jié)直徑＞3cm）。CEUS檢查對(duì)肝癌結(jié)節(jié)總體檢出率93.65%；小肝癌敏感度91.89%、特異度96.15%、準(zhǔn)確度93.65%、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值97.14%、陰性預(yù)測(cè)值89.29%；微小肝癌敏感度81.82%，特異度98.08%、準(zhǔn)確度95.24%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值90.00%、陰性預(yù)測(cè)值96.23%。（3）CEUS檢查與常規(guī)超聲檢查比較：CEUS檢查對(duì)兔VX2肝癌結(jié)節(jié)總體檢出率（χ2值=8.558、P值=0.003）、微小肝癌的敏感度（χ2值=6.600、P=0.010）、準(zhǔn)確度（χ2=6.130，P值=0.013）及小肝癌的敏感度（χ2=6.773，P=0.009）、準(zhǔn)確度（χ2=7.499，P=0.006）均高于后者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩種檢查方法對(duì)兔VX2微小肝癌特異度（χ2=1.891，P=0.169）、小肝癌的特異度（χ2=1.083，P=0.298），差異均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4CEUS對(duì)微小肝癌的檢出情況 CEUS對(duì)微小肝癌的總檢出率（81.82%）明顯高于常規(guī)超聲（27.27%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.600、P=0.010）。CEUS對(duì)直徑0.3～0.5cm微小肝癌的檢出率（85.71%）明顯高于常規(guī)超聲（14.29%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.143、P=0.008）。CEUS對(duì)直徑0.5～1.0cm微小肝癌的檢出率（75%）高于常規(guī)超聲（50%），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.533、P=0.465）。

2.5直徑＜1.0cm微小肝癌CEUS參數(shù)特征 見(jiàn)表2。

表2　微小肝癌與小肝癌的CEUS參數(shù)比較（x±s）

3　討論

臨床上將腫瘤病灶直徑為1～3cm的肝癌稱為小肝癌，而直徑＜1cm的肝癌稱為微小肝癌，其早期可無(wú)明顯的臨床癥狀。如何提高小肝癌、微小肝癌的檢出率及診斷準(zhǔn)確率成為目前肝癌醫(yī)學(xué)影像學(xué)研究的熱點(diǎn)。

肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，肝癌的新生血管最先生成，包繞肝癌病灶邊緣后通過(guò)分支伸入肝癌病灶內(nèi)部滋養(yǎng)肝癌實(shí)質(zhì)，最終形成血供豐富的新生血管網(wǎng)，在這網(wǎng)架結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上繼而出現(xiàn)肝癌細(xì)胞增生。本資料中，所有兔VX2肝癌模型的腫瘤病灶在進(jìn)行CEUS檢查時(shí)均可探及較豐富的動(dòng)脈血供，并表現(xiàn)出“快進(jìn)快退”的造影特征，即動(dòng)脈期腫瘤病灶出現(xiàn)快速增強(qiáng)，門脈期即表現(xiàn)為快速廓清［2］。這是CEUS對(duì)腫瘤良惡性作出鑒別診斷的基礎(chǔ)。這與腫瘤病灶的血供以肝動(dòng)脈供血占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)有關(guān)。肝癌組織的供血?jiǎng)用}異常增生、移位、變形、包繞、擴(kuò)張及動(dòng)靜脈瘺形成，可使超聲造影劑快速到達(dá)腫瘤病灶的內(nèi)部組織，一般為造影開(kāi)始后的5～10s［3］，以致于動(dòng)脈相早期CEUS即可顯示腫瘤病灶的灌注情況及滋養(yǎng)血供情況。因此利用CEUS能更加敏感地顯示小肝癌、微小肝癌結(jié)節(jié)。有利于小肝癌、微小肝癌的早期檢出，為肝癌患者的臨床治療提供早期客觀的醫(yī)學(xué)影像學(xué)依據(jù)。

正常肝臟供血來(lái)自于肝動(dòng)脈以及門靜脈的雙重供血，而肝癌結(jié)節(jié)的供血即主要來(lái)自于肝動(dòng)脈供血，兩者供血方式存在著差異。本資料中，腫瘤病灶組織的CEUS定量參數(shù)中AS、 PI、AUC較其周邊鄰近正常肝組織明顯增大（P＜0.05），提示兔VX2肝癌模型中腫瘤病灶組織內(nèi)部具有異常豐富的新生微小動(dòng)脈，必然導(dǎo)致肝癌病灶組織內(nèi)血供隨之增加，提示HCC惡性的傾向［4］，有助于CEUS對(duì)腫瘤病灶結(jié)節(jié)的性質(zhì)判定，即有助于小肝癌、微小肝癌的定性診斷。本資料中，與周邊鄰近正常肝組織比較，腫瘤病灶組織的CEUS定量參數(shù)中AT 、TTP明顯減少（P＜0.05），表明腫瘤病灶組織出現(xiàn)提前灌注。原因可能是一方面腫瘤病灶組織內(nèi)新生微小動(dòng)脈血管的異常增生，使肝動(dòng)脈的優(yōu)勢(shì)供血構(gòu)成比例遠(yuǎn)超門靜脈［5］，并占絕對(duì)性的主導(dǎo)地位，進(jìn)入病灶結(jié)節(jié)組織的血流量較正常肝組織明顯增多。另一方面腫瘤病灶組織內(nèi)新生血管具有極高的通透性，進(jìn)一步提高超聲造影劑的灌注速度，縮短灌注時(shí)間［6］。CEUS檢查對(duì)肝癌病灶結(jié)節(jié)的檢出能力明顯優(yōu)于常規(guī)超聲檢查，尤其對(duì)臨床上難以發(fā)現(xiàn)的直徑＜1.0cm的微小肝癌的診斷能力更突出，其臨床診斷的漏診率更低。且本資料中，CEUS對(duì)兔VX2肝癌結(jié)節(jié)的檢查較常規(guī)超聲檢查具有更高的準(zhǔn)確度（P＜0.05），且對(duì)小肝癌的準(zhǔn)確度達(dá)93.65%，對(duì)微小肝癌的準(zhǔn)確度達(dá)95.24%，其值均＞0.75，表明CEUS檢查對(duì)肝癌病灶結(jié)節(jié)的診斷具有更高的臨床應(yīng)用價(jià)值，尤其對(duì)小肝癌和微小肝癌的診斷檢查，CEUS明顯優(yōu)于常規(guī)超聲檢查。

本資料中，與直徑＞1.0cm小肝癌比較，直徑＜1.0cm微小肝癌的CEUS定量參數(shù)AT及TTP明顯增加（P＜0.05），提示微小肝癌組織的超聲造影劑灌注遲于小肝癌。原因可能與微小肝癌直徑體積小，分化程度更高，癌結(jié)節(jié)內(nèi)腫瘤細(xì)胞組織及血管結(jié)構(gòu)分布更接近正常，異常增生小動(dòng)脈相對(duì)較少，肝動(dòng)脈供血相對(duì)較少，而門靜脈供血相對(duì)較多，致使AT、TTP增加，而隨著腫瘤體積增大及分化程度降低，腫瘤內(nèi)血管結(jié)構(gòu)分布越偏離正常，肝動(dòng)脈供血越占優(yōu)勢(shì)，血流灌注量不斷增加，造影劑灌注加快，即AT、TTP減小，且隨著腫瘤不斷生長(zhǎng)增大，動(dòng)靜脈瘺形成數(shù)量隨之增加，灌注進(jìn)一步提前［7］。這同時(shí)提示不同大小的肝癌結(jié)節(jié)CEUS定量參數(shù)的變化特征與其分化程度以及惡性程度密切相關(guān)，有助于腫瘤性質(zhì)的初步判斷，有利于肝癌的分期。

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4齊錚琴，趙玉珍，楊漪，等 .卵巢腫瘤經(jīng)陰道彩色多普勒超聲與微血管密度的對(duì)比研究，中國(guó)醫(yī)學(xué)影像技術(shù)，2006，22（4）：603～605.

5周軍華，趙玉珍，董超，等.原發(fā)性肝癌超聲造影定量血流灌注參數(shù)與病理微血管密度對(duì)比分析.中國(guó)超聲醫(yī)學(xué)雜志，2008，24（1）：47～49.

6丁雪明，李智賢，韋康來(lái)，等.肝細(xì)胞癌的超聲造影定量灌注參數(shù)與MVD、VEGF表達(dá)的關(guān)系.中國(guó)超聲醫(yī)學(xué)雜志，2009，25（11）：1054～1057.

7Liu GJ，Xu HX，Lu MD，et al. Correlation between enhancement pattern of hepatocellular carcinoma on real-time contrast enhanced ultrasound and tumour cellular differentiation on histopathology .Br J Radiol，2007，80（953）：321～330.

Objective To explore the clinical application value of that to check rabbit VX2 liver cancer model using contrast enhanced ultrasound （CEUS）. Methods 30 New Zealand white rabbits were made into VX2 liver cancer model .Respectively performed the conventional ultrasound check and CEUS check .Observed the imaging characteristics of liver cancer model .Obtained and analyzed the CEUS quantitative parameters of tumor tissue in the liver cancer model. And compared with the pathological slice of the liver cancer model . Results Rabbit VX2 liver cancer nodules show the typical enhanced features ："fast forward fast rewind" by CEUS. Compared with neighbour normal liver tissue，the AS，PI，AUC of rabbit VX2 liver cancer tissue were increased obviously （P＜0.05）；the AT、TTP were decreased signifi cantly （P＜0.05）.Compared with conventional ultrasound check，the overall detection rate of rabbit VX2 liver cancer nodules，as well as the sensitivity and accuracy of micro hepato cellular carcinoma（MHCC）、small hepato cellular carcinoma（SHCC） were higher using CEUS check （P＜0.05）. The detection rate of CEUS （85.71%）was higher than conventional ultrasound in MHCC with 0.3 ～ 0.5cm diameter（P＜0.05）.Compared with SHCC with diameter＞1.0 cm，the quantitative parameters of CEUS ：AT、TTP signifi cantly increased （P＜0.05） in MHCC with diameter＜1.0 cm. Conclusions CEUS can provide the information of tiny blood vessels structure in liver cancer，can refl ect the blood perfusion，help detect and diagnose to MHCC、SHCC.

Rabbit VX2 liver cancer model Hepatic cell carcinoma Contrast enhanced ultrasound

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃一般研究計(jì)劃項(xiàng)目（2013KYB015）

310013 浙江醫(yī)院超聲科