孫蔚　闞延婷　黃燕　馮婷婷　甘建和*

?論著?

HEV相關(guān)肝衰竭患者CD4+/CD8+比值變化與預(yù)后的關(guān)系

孫蔚闞延婷黃燕馮婷婷甘建和*

目的 探討戊型肝炎病毒（HEV）相關(guān)肝功能衰竭患者中CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD4+/CD8+比值的變化及與預(yù)后的關(guān)系 方法 應(yīng)用流式細胞計數(shù)分別對戊型肝炎病毒相關(guān)肝功能衰竭（HEV-LF）患者15例，普通急性戊型肝炎（AHE）患者21例和健康對照者20例外周血中CD4+T細胞、CD8+T細胞水平進行檢測，同時檢測TBiL、PTA等指標(biāo)。15例HEV-LF患者根據(jù)預(yù)后不同分為好轉(zhuǎn)組與死亡組，預(yù)后相關(guān)危險因素用Logistic回歸分析結(jié)果。結(jié)果 HEV-LF組與AHE組CD4+T細胞頻數(shù)分別為（30.72±11.14）%，（32.61±8.96）%，比健康對照組（37.95±2.03）%明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。HEV-LF組與AHE組CD8+T細胞頻數(shù)分別為（31.15±8.69）%，（24.23±7.50）%，比健康對照組（19.14±5.33）%明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；兩組間比較也有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。HEV-LF組與AHE組CD4+/CD8+比值分別為（1.06±0.47）、（1.54±0.90），比健康對照組（2.13±0.88）明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），兩組間比較也有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。CD4+/CD8+比值水平降低是 HEV-LF組患者預(yù)后的危險因素。結(jié)論 HEV-LF、AHE患者存在不同程度的細胞免疫功能紊亂，其中CD4+/CD8+比值水平降低是HEV-LF組患者預(yù)后的危險因素。

戊型肝炎 CD4+T淋巴細胞 CD8+T淋巴細胞 流式細胞術(shù)

肝功能衰竭是肝細胞受到廣泛、嚴(yán)重?fù)p害，導(dǎo)致肝臟的合成、解毒、排泄等功能嚴(yán)重紊亂而出現(xiàn)的臨床癥候群。肝衰竭的病因及誘因復(fù)雜，在我國肝炎病毒感染是其發(fā)生的最主要原因。雖然戊型肝炎病毒（HEV）感染引起的病毒性肝炎，一般呈急性病程，預(yù)后較好，但近年來有關(guān)HEV感染相關(guān)肝衰竭的報道逐漸增多［1，2］。目前國內(nèi)外對戊型肝炎病毒相關(guān)肝功能衰竭（HEV-LF）免疫狀態(tài)的研究較少。作者回顧性分析15例HEV-LF患者的臨床資料，探討CD4+/CD8+比值與其預(yù)后的關(guān)系。

1　臨床資料

1.1一般資料 選擇2010年1月至2015年6月本院HEV-LF患者15例（HEV-LF組）、急性戊型肝炎（AHE）患者21例（AHE組）。AHE患者診斷符合《病毒性肝炎防治方案》［3］。HEV-LF患者在AHE基礎(chǔ)上出現(xiàn)肝衰竭，診斷符合《肝衰竭診治指南（2012年版）［4］。在入組前＜6個月均未接受免疫調(diào)節(jié)治療，同時排除腫瘤及妊娠。對照組為本院健康職工獻血標(biāo)本20例。本項目經(jīng)本院倫理委員會討論通過，并簽署知情同意書。

1.2主要儀器及試劑 CD4+T細胞和CD8+T細胞檢測采用Beckman.Coulter公司生產(chǎn)的XLAT09010流式細胞儀，試劑采用Beckman.Coulter四聯(lián)標(biāo)記抗體CD45-FITC/CD3-PC5/CD4-RD1/CD8-ECD以及 IntraPrep Permeabilization Reagent，包括鞘液、清洗液。

1.3流式細胞術(shù)檢測 5?l四聯(lián)標(biāo)記抗體CD45-FITC/ CD3-PC5/CD4-RD1/CD8-ECD加入50?l全血中，振蕩混勻避光標(biāo)記15min。加入自制紅細胞裂解液A液600?l，振蕩混勻至澄清后加入B液265?l，振蕩混勻后1500r/min離心5min棄上清液，加入2ml PBS振蕩混勻后1500r/min離心5min棄上清液（重復(fù)2遍），用500?l PBS重懸混勻后上機；計數(shù)3000～5000個細胞。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件。計量資料以（x±s）表示，兩組均數(shù)間比較用t檢驗，組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組基本臨床資料比較 3組間性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），HEV-LF組與AHE組T-BIL、ALT、AST、PA、PTA比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）見表1。HEV-LF組6例未愈，均為男性，出現(xiàn)肺部感染并發(fā)癥4例，出現(xiàn)肝性腦病并發(fā)癥1例，同時出現(xiàn)肺部感染、尿路感染、肝性腦病并發(fā)癥1例；6例未愈患者中合并HBV感染1例、HCV感染1例，乙型肝炎后肝硬化脾臟切除術(shù)后1例，有酒精性肝硬化病史1例。AHE組住院治療后均好轉(zhuǎn)，無并發(fā)癥。其中血吸蟲肝病史1例，HBV合并感染1例。

表1　各組基本臨床資料比較（x±s）

2.2CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD4+/CD8+比值在3組中的比較 見表2。

表2　各組CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD4+/CD8+比值（x±s）

2.3CD4+/CD8+比值與HEV-LF預(yù)后的Logistic回歸分析結(jié)果 采用Logistic回歸以是否死亡為應(yīng)變量，而性別、年齡、住院天數(shù)、TBil、PTA、CD4+/CD8+比值為自變量建立回歸模型，結(jié)果顯示血清CD4+/CD8+比值水平降低可作為重癥肝炎危險因素，OR值為1.753（P＜0.05）。

3　討論

我國是病毒性肝炎的高發(fā)區(qū)，戊型肝炎的人群流行率約20%，多表現(xiàn)為急性感染，一般不轉(zhuǎn)為慢性，但在一部分患者如老年男性、免疫力低下、孕婦中易發(fā)展為肝功能衰竭［5］。HE的發(fā)病機制目前尚不清楚，推測可能與甲型肝炎類似，即HEV可能不直接引起肝細胞損傷，而免疫病理損傷特別是細胞免疫可能是引起肝細胞損傷的主要原因［6］。機體的細胞免疫由T淋巴細胞介導(dǎo)，T淋巴細胞的主要功能是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)抗原引起的免疫應(yīng)答，并產(chǎn)生清除細胞表面抗原或細胞內(nèi)微生物的效應(yīng)。細胞免疫功能主要由不同類型T淋巴細胞亞群決定，其中最重要的是輔助細胞（CD4+）和殺傷抑制細胞（CD8+），兩者比例失調(diào)影響機體免疫系統(tǒng)［7］。本資料顯示，無論是HEV-LF組還是AHE組和健康對照組比較均表現(xiàn)為CD4+T細胞頻率降低，CD8+T細胞頻率升高，CD4+/CD8+比值下降。提示細胞免疫在HEV感染的發(fā)病過程中起著重要的作用。計云霞［8］等研究發(fā)現(xiàn)HE肝臟病變有肝細胞氣球樣變、性變、嗜酸性小體、灶性壞死及炎性細胞浸潤，主要是淋巴細胞和單核巨噬細胞。經(jīng)免疫組化檢查，壞死灶周圍浸潤的大多為CD8+T細胞，因此認(rèn)為HE可能并非直接使肝細胞致病，肝細胞損害是由于細胞免疫反應(yīng)介導(dǎo)。活化的CD4+T細胞可產(chǎn)生多種細胞因子，可輔助B細胞形成抗體，也能輔助CD8+T細胞產(chǎn)生細胞毒作用，可誘導(dǎo)和增強細胞和體液免疫應(yīng)答，功能上主要屬輔助性T細胞。國內(nèi)外研究證實CD8+T是清除乙型肝炎病毒（HBV）的主要效應(yīng)細胞，可產(chǎn)生穿孔素、粒酶等細胞毒物質(zhì)，參與抗病毒、抗腫瘤免疫和移植排斥反應(yīng)，其殺傷靶細胞主要有兩種途徑：即細胞裂解性殺傷和誘導(dǎo)細胞凋亡，功能上可歸為抑制性T細胞［9～11］。兩種T淋巴細胞借其相互拮抗作用調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答過程，以保持免疫功能的平衡。

進一步比較HEV-LF組與AHE組CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD4+/CD8+比值，結(jié)果顯示HEV-LF組CD8+T細胞頻數(shù)高于AHE組。模式生物學(xué)研究認(rèn)為適度水平的CTL應(yīng)答是控制、清除病毒感染及引起肝細胞損傷的中心環(huán)節(jié)［12］，過度升高的CD8+T細胞在清除病毒的同時引起的大量肝細胞壞死。本資料結(jié)果顯示CD4+/CD8+比值HEV-LF組低于AHE組。提示HEV感染機體導(dǎo)致肝功能衰竭的患者存在嚴(yán)重的免疫功能紊亂。CD4+/CD8+比值與HEV-LF預(yù)后的Logistic回歸分析結(jié)果顯示血清CD4+/CD8+比值水平降低可作為重癥肝炎預(yù)后不良的危險因素。當(dāng)CD4+T細胞或CD8+T細胞的數(shù)量或功能出現(xiàn)異常時，T 淋巴細胞調(diào)節(jié)就失去平衡而導(dǎo)致機體發(fā)病。CD4+/CD8+的水平高低可反映機體免疫系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定情況［13］，表明免疫應(yīng)答對機體具有雙重的作用，一方面可以幫助清除病原微生物起到保護性作用，但是過度激活則可導(dǎo)致機體發(fā)生炎癥病理損傷。

綜上所述，HEV感染外周血CD4+T細胞、CD8+T細胞及CD4+/CD8+比值的變化提示細胞免疫功能紊亂可能是HEV感染發(fā)病及重癥化的重要機制。但機體的免疫系統(tǒng)是復(fù)雜并動態(tài)變化的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，需進一步完善細胞因子及共刺激分子的同步檢測，才能更全面的評估HEV感染機體的免疫發(fā)病機制及與預(yù)后的關(guān)系。

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Objective To investigate the changes of CD4+T cell，CD8+ T cell and ratio of CD4+/CD8+in patients with hepatitis E virus （HEV）related liver failure and their relationship with prognosis. Methods Using flow cytometry respectively ， peripheral blood CD4+T cell，CD8+T cell were detectedin 15 cases of hepatitis E virus related liver failure patients （HEV-LF），21 cases of common acute hepatitis E patients （AHE） and 20 cases of healthy controls， as well as TBIL、PTA and others. 15 patients with HEV-LF were divided into improvement group and death group according to different prognosis，and prognostic risk factors using logistic regression analysis. Results HEV-LF and AHE group of CD4+T cell frequency were（30.72±11.14）%，（32.61±8.96）%，which were significantly decreased compared with the healthy control group （37.95±2.03）%（P＜0.05），while there was no significant difference between the two groups of patients（P＞0.05）. CD8+T cell frequency in HEV-LF group and AHE group were（31.15±8.69）% and（24.23±7.50）%，respectively， which both increased significantly compared with healthy control group（ 19.14% ±5.33%），（P＜0.05）； while there was statistical significance between two groups of patients （P＜0.05）. The ratio of CD4+/CD8+were（1.06±0.47），（1.54±0.90） in HEV-LF group and AHE group， respectively， while in the healthy control group， it was 2.13±0.88， showing significant decrease（P＜0.05），also statistical significance were between the two groups of patients（P＜0.05）. Conclusion Reduction of CD4+/CD8+ratio is a risk factor for the prognosis of patients with HEV-LF. HEV-LF and AHE have different levels of cellular immune function disorder，and the reduction of ratio of CD4+/CD8+is a risk factor for the prognosis of patients with HEV-LF.

HEV CD4+T cell CD8+ T cell Flow cytometry

國家科技部十二五重大專項（2012X10002004-008）；2013年省級自然科學(xué)基金（BK20130271）

215006 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科